Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

सेल वंश विश्लेषण और जीन समारोह अध्ययन ट्विन मौके MARCM का प्रयोग

Published: March 2, 2017 doi: 10.3791/55278
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,2
1Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica, 2Graduate Institute of Life Sciences, National Defense Medical Center

Summary

यहाँ, हम एक पच्चीकारी लेबलिंग तकनीक है कि दो अलग-अलग रंगों में एक आम पूर्वज सेल से निकाली गई न्यूरॉन्स के दृश्य के परमिट के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। यह अलग व्यक्तियों का एक ही न्यूरॉन्स में जन्म-डेटिंग व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की क्षमता और पढ़ाई जीन समारोह के साथ तंत्रिका वंश विश्लेषण की सुविधा।

Abstract

एम आर सी epressible पक्ष मीटर arker के साथ एक nalysis (MARCM) एक सकारात्मक पच्चीकारी लेबलिंग प्रणाली है कि व्यापक रूप से जटिल morphologies चित्रित करने के लिए और अन्यथा अगोचर और बेफिक्र भीतर न्यूरॉन्स के सबसेट में जीन के समारोह में हेरफेर करने के लिए ड्रोसोफिला neurobiological पढ़ाई में लागू किया गया है osaic जीवों। जेनेटिक MARCM प्रणाली में उत्पन्न मोज़ाइक अग्रदूत कोशिकाओं को विभाजित बँटवारा के दौरान दोनों चिह्नित (MARCM क्लोन) और अगोचर बेटी कोशिकाओं का उत्पादन करने के भीतर मुताबिक़ गुणसूत्रों के बीच साइट विशेष पुनर्संयोजन के माध्यम से मध्यस्थता कर रहे हैं। MARCM विधि का एक विस्तार है, कहा जाता जुड़वां मौके MARCM (tsMARCM), दो अलग-अलग रंगों के साथ एक आम पूर्वज से निकाली गई कोशिकाओं के जुड़वां दोनों लेबल। इस तकनीक को दोनों अर्ध-प्रजातियों से उपयोगी जानकारी की पुनर्प्राप्ति सक्षम करने के लिए विकसित किया गया था। द्वारा व्यापक tsMARCM क्लोन के विभिन्न जोड़े का विश्लेषण, tsMARCM प्रणाली उच्च संकल्प तंत्रिका वंश mappin परमिटजी आम पूर्वज कोशिकाओं से उत्पादित लेबल न्यूरॉन्स की सही जन्म के आदेश प्रकट करते हैं। इसके अलावा, tsMARCM प्रणाली को भी विभिन्न जानवरों के समान न्यूरॉन्स की प्ररूपी विश्लेषण की अनुमति से जीन समारोह के अध्ययन फैली हुई है। यहाँ, हम कैसे tsMARCM प्रणाली ड्रोसोफिला में तंत्रिका विकास के अध्ययन की सुविधा के लिए लागू करने का वर्णन है।

Introduction

मस्तिष्क, एक विशाल संख्या और न्यूरॉन्स के विविध प्रकार के शामिल, अनुभव, प्रक्रिया, और बाहरी दुनिया से चुनौतियों का सामना करने की क्षमता के साथ जानवरों endows। वयस्क ड्रोसोफिला केंद्रीय मस्तिष्क के न्यूरॉन्स, तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं की एक सीमित संख्या से निकाली गई है बुलाया neuroblasts (एनबीएस), विकास 1, 2 के दौरान। NBs ड्रोसोफिला में मस्तिष्क न्यूरोजेनेसिस में भाग लेने के अधिकांश विषम विभाजन से गुजरना स्वयं renewing NBs और नाड़ीग्रन्थि मां कोशिकाओं (GMCs) उत्पन्न करने के लिए, और GMCs तो विभाजन के दूसरे दौर के माध्यम से जाना (चित्रा 1 ए दो बेटी कोशिकाओं है कि न्यूरॉन्स 3 में अंतर का उत्पादन करने के लिए )। न्यूरोनल आकृति विज्ञान की जटिलता और विशिष्ट न्यूरॉन्स, एक सकारात्मक पच्चीकारी लेबलिंग प्रौद्योगिकी, एक repressible सेल मार्कर (MARCM) के साथ पच्चीकारी विश्लेषण की पहचान के साथ जुड़े चुनौतियों की वजह से, visualizat सक्षम करने के लिए आविष्कार किया गया थाएक न्यूरॉन या आसपास, लेबल हटाया गया न्यूरॉन्स 4 की आबादी से बाहर न्यूरॉन्स के एक छोटे सबसेट के आयन।

MARCM flippase (FLP) / FLP मान्यता लक्ष्य (FRT) प्रणाली एक repressor जीन, जिनकी अभिव्यक्ति सामान्य रूप से एक पत्रकार जीन 4 की अभिव्यक्ति को रोकता है की एक विषमयुग्मजी एलील ले जाने के एक विभाजन अग्रदूत कोशिका के भीतर मुताबिक़ गुणसूत्रों के बीच साइट विशेष पुनर्संयोजन मध्यस्थता करने के लिए इस्तेमाल करता है। mitotic विभाजन के बाद, पुनः संयोजक गुणसूत्रों जुड़वां कोशिकाओं में अलग कर रहे हैं, जैसे कि एक सेल repressor जीन की homozygous alleles और अन्य सेल कोई repressor जीन है कि सेल (और उसके वंश) में रिपोर्टर की अभिव्यक्ति है शामिल नहीं रह गया है 4 जाम कर दिया। तीन प्रतिरूप पैटर्न आम तौर पर एक MARCM प्रयोग में पाया जाता है जब FLP प्रसंभात्य NBs या GMCs में प्रेरित किया है: एकल कोशिका और दो-सेल जीएमसी क्लोन है, जो एकल कोशिका resolutio पर न्यूरोनल आकृति विज्ञान को दर्शातीएन, और बहु-कोशिकीय-एनबी क्लोन है, जो एक आम एनबी (चित्रा 1 बी) से व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की पूरी रूपात्मक पैटर्न प्रकट करते हैं। MARCM तकनीक का व्यापक रूप, ड्रोसोफिला neurobiological पढ़ाई में लागू किया गया है मस्तिष्क चौड़ा तारों के नेटवर्क के पुनर्निर्माण के लिए न्यूरोनल प्रकार पहचान में भी शामिल है, तंत्रिका वंश न्यूरॉन्स, सेल भाग्य विनिर्देश में शामिल जीन कार्यों की प्ररूपी लक्षण वर्णन के विकास के इतिहास खुलासा करने के लिए विश्लेषण करती है, और neuronal morphogenesis और भेदभाव अध्ययन 5, 6, 7, 8, 9, 10। क्योंकि पारंपरिक MARCM केवल दो बेटी कोशिकाओं (और प्रजातियों) प्रेरित mitotic पुनर्संयोजन घटना के बाद से एक लेबल, अगोचर तरफ से संभावित रूप से उपयोगी जानकारी खो दिया है। इस सीमा बुनियादी एम के आवेदन precludesउच्च संकल्प को ARCM प्रणाली कई तंत्रिका प्रजातियों कि तेज गति में सेल भाग्य स्विच का विश्लेषण करती है या सटीक करने के लिए विभिन्न जानवरों 11, 12 की समान न्यूरॉन्स में जीन कार्यों का विश्लेषण करती है।

ट्विन मौके MARCM (tsMARCM) एक उन्नत प्रणाली है कि दो अलग-अलग रंगों के साथ एक आम पूर्वज से निकाली गई न्यूरॉन्स लेबल, जो दो कोशिकाओं के दोनों ओर से उपयोगी जानकारी की वसूली के लिए सक्षम बनाता है, इस प्रकार मूल MARCM प्रणाली 11 की सीमा (पर काबू पाने के लिए है चित्रा 2A - 2 सी)। TsMARCM प्रणाली में, दो शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) आधारित दमन का पूर्वाभ्यास कोशिका के भीतर मुताबिक़ क्रोमोसोम के पार स्थलों पर स्थित हैं, और उन दमन की अभिव्यक्ति के लिए स्वतंत्र रूप से अपने संबंधित संवाददाताओं (चित्रा 2 बी) की अभिव्यक्ति को रोकती हैं। साइट विशेष mitotic पुनर्संयोजन FLP / FRT प्रणाली के माध्यम से मध्यस्थता के बाद, TWओ आरएनएआई आधारित बनने दमन जुड़वां कोशिकाओं में अलग अलग संवाददाताओं से (चित्रा 2 बी) की अभिव्यक्ति की अनुमति के लिए। दो प्रतिरूप पैटर्न, एकल कोशिका एकल कोशिका क्लोन और बहु-कोशिकीय-एनबी क्लोन के साथ जुड़े दो सेल जीएमसी के साथ जुड़े, आम तौर पर एक tsMARCM प्रयोग (चित्रा -2) में देखा जाता है। सूचना जुड़वां कोशिकाओं दूसरे पक्ष के लिए संदर्भ के रूप में उपयोग किया जा सकता है की एक तरफ से निकाली गई, उच्च संकल्प तंत्रिका वंश का विश्लेषण करती है, जैसे जन्म-डेटिंग लेबल न्यूरॉन्स के रूप में सक्षम करने, और प्ररूपी सटीक जांच के लिए विभिन्न जानवरों में समान न्यूरॉन्स का विश्लेषण करती है तंत्रिका जीन समारोह 11, 12 की। यहाँ, हम एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल कैसे (यदि लागू करने के साथ ही अन्य ऊतकों के विकास) ड्रोसोफिला में एक tsMARCM प्रयोग है, जो अन्य प्रयोगशालाओं द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता तंत्रिका विकास की अपनी पढ़ाई को व्यापक बनाने का संचालन करने का वर्णन प्रस्तुत करते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. निर्माण की आवश्यकता transgenes 11, 13 का उपयोग tsMARCM तैयार मक्खियों

  1. ट्रांसजीन कि व्यक्ति मक्खियों 11 द्वारा किया जाता है से tsMARCM तैयार मक्खियों के मूल संस्करण उत्पन्न (1 टेबल देखें)। मानक मक्खी आनुवंशिक क्रासिंग योजनाओं, जो पहले से वर्णित किया गया है, एक ही उड़ शेयरों में 13 कई ट्रांसजीन डाल द्वारा आयोजित करते हैं।
    1. एक माता पिता की लाइन में, FRT 40A, यूएएस mCD8 :: GFP (पहले संवाददाता, mCD8 :: GFP के ट्रांसजीन इकट्ठा; transgene की अभिव्यक्ति अपस्ट्रीम सक्रियण अनुक्रम प्रमोटर के नियंत्रण है, जो एक झिल्ली सीमित संवाददाता का उत्पादन किया जा रहा है आरएनएआई चूहे क्लस्टर ओ की अभिव्यक्ति के खिलाफ;) भेदभाव 8 प्रोटीन के माउस क्लस्टर हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ जुड़े हुए हैं, और यूएएस rCD2RNAi (शमन कि दूसरी रिपोर्टर की अभिव्यक्ति को रोकता कीएफ भेदभाव 2, rcd2) 2 एन डी गुणसूत्र के बाईं बांह पर। जगह ऊतक विशेष, एक्स या 3 गुणसूत्र पर -GAL4 चालक यदि संभव हो तो।
    2. अन्य माता पिता की लाइन में, FRT 40A, यूएएस rCD2 :: आरएफपी के ट्रांसजीन इकट्ठा (दूसरा संवाददाता, rCD2 :: आरएफपी; अन्य झिल्ली सीमित संवाददाता rCD2 प्रोटीन लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ जुड़े हुए से मिलकर), और यूएएस GFPRNAi (शमन कि mCD8 :: GFP की अभिव्यक्ति को रोकता है; GFP की अभिव्यक्ति के खिलाफ आरएनएआई) 2 एन डी गुणसूत्र के बाईं बांह पर। एक्स या 3 गुणसूत्र, यदि संभव हो तो पर रखें गर्मी के झटके (एचएस) -FLP या ऊतक specific- FLP।
  2. ट्रांसजीन कि व्यक्ति मक्खियों 14 द्वारा किया जाता है से tsMARCM तैयार मक्खियों के नए संस्करण उत्पन्न (1 टेबल देखें)। आचरण मानक मक्खी आनुवंशिक क्रासिंग योजनाओं, जो पी वर्णित किया गया हैreviously, एक ही उड़ शेयरों में 13 कई ट्रांसजीन डाल द्वारा।
    1. एक माता पिता की लाइन में, के एक ही हाथ में एक FRT साइट और यूएएस mCD8.GFP.UAS-rCD2i (mCD8 :: GFP और शमन कि rCD2 की अभिव्यक्ति :: आरएफपी रोकता की एक संयुक्त ट्रांस्जीन) की ट्रांसजीन इकट्ठा एक साथ 2 एन डी या 3 गुणसूत्र (FRT और यूएएस mCD8.GFP.UAS-rCD2i की transgenes की उचित जोड़े तालिका 1 में संकेत कर रहे हैं)। चुना FRT साइट के गुणसूत्र के अलावा अन्य यदि संभव हो तो गुणसूत्रों पर रखें ऊतक विशेष-GAL4 ड्राइवर।
    2. अन्य माता पिता की लाइन में, एक FRT साइट और यूएएस rCD2.RFP.UAS-GFPi (rCD2 के अन्य संयुक्त ट्रांस्जीन :: आरएफपी और शमन कि mCD8 :: GFP की अभिव्यक्ति को रोकता है) एक ही हाथ में ट्रांसजीन इकट्ठा 2 एन डी या 3 गुणसूत्र (FRT की transgenes की उचित जोड़े की यूएएस rCD2.RFP.UAS-GFPi तालिका 1 में संकेत कर रहे हैं)। प्लेस एच एस FLP या चुना FRT साइट के गुणसूत्र के अलावा अन्य यदि संभव हो तो गुणसूत्रों पर ऊतक विशेष-FLP।

2. क्रॉस tsMARCM के लिए तैयार उनकी संतान में tsMARCM क्लोन उत्पन्न करने के लिए मक्खियों

  1. क्रॉस tsMARCM के लिए तैयार एक साथ मक्खियों ताजा के साथ एक मक्खी भोजन शीशी में (जैसे, 10-15 नर मक्खियों कदम 1.1.1 या 1.2.1 और 20-30 कुंवारी महिला से एक साथ कदम 1.1.2 या 1.2.2 से मक्खियों डाल) शीशी की दीवार पर बना दिया खमीर पेस्ट।
  2. निषेचित अंडे इकट्ठा करने से पहले संभोग की संभावना को बढ़ाने के लिए 2 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर पार tsMARCM तैयार मक्खियों को बनाए रखें।
  3. बार-बार भीड़ से बचने के (मक्खियों नीचे नल या कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग मक्खियों anesthetize करने के लिए स्थानांतरण की सुविधा के लिए हौसले yeasted शीशियों में पार tsMARCM तैयार मक्खियों स्थानांतरण, के माध्यम से एक 10 एमएल उड़ फूड में 80-100 निषेचित अंडे से अधिक नहीं रखएल भी कई रची लार्वा से बचने के लिए)।
  4. संस्कृति tsMARCM जानवरों (यानी, निषेचित अंडे, tsMARCM जानवरों के जीनोटाइप का एक उदाहरण के रूप में चित्रा 3 में प्रयोग किया जाता है, एच एस FLP [22], डब्ल्यू / डब्ल्यू, यूएएस mCD8 :: GFP, यूएएस rCD2RNAi, FRT 40A , Gal4-GH146 / यूएएस rCD2 :: आरएफपी, यूएएस GFPRNAi, FRT 40A + +) है कि 25 डिग्री सेल्सियस पर क्रमानुसार का तबादला शीशियों में रखा गया है, जब तक वे वांछित चरणों (जैसे, भ्रूण, लार्वा को विकसित करने, या pupae)।
  5. स्थानांतरित कर शीशियों है कि 10 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान, 20, 30, 40 के लिए एक ही विकास के चरण में tsMARCM जानवरों होते हैं, और 50 मिनट जगह है कि FLP की अभिव्यक्ति लाती उत्पन्न करने के लिए गर्मी के झटके का इष्टतम समय निर्धारित करने के लिए ब्याज की tsMARCM क्लोन। इस कदम को छोड़ अगर ऊतक-specific- FLP tsMARCM प्रयोग में इस्तेमाल किया जा रहा है (एच एस FLP तंत्रिका वंश के लिए पसंद किया जाता है का विश्लेषण करती है, यह वरीयता के लिए कारणों में पहले से वर्णित किया गया है 15)।
    नोट: दोहराएँ 2.5 कदम भविष्य tsMARCM प्रयोगों में गर्मी सदमे से इष्टतम समय का उपयोग ब्याज की अधिक tsMARCM क्लोन चाहती हैं, तो; आम तौर पर, और अधिक FLP अभिव्यक्ति में प्रेरित किया है एच एस FLP [22] की तुलना में एच एस FLP [1] ही गर्मी सदमे समय के साथ।
  6. संस्कृति 25 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी हैरान tsMARCM जानवरों जब तक वे उचित विकास के चरण पर पहुंच गया है, और उसके बाद चरण 3 पर आगे बढ़ें।

3. तैयार करें, दाग, और माउंट फ्लाई दिमाग tsMARCM क्लोन युक्त

  1. संदंश-सुरक्षा के व्यंजन तैयार करें। भाग एक (30 ग्राम) और सक्रिय लकड़ी का कोयला (0.25 छ) के साथ सिलिकॉन elastomer किट के भाग बी (3 जी) मिक्स। उचित बर्तन में मिश्रण डालो।
  2. लार्वा, पोटा संबंधी या वयस्क 1x फॉस्फेट बफर खारा में tsMARCM जानवरों (पीबीएस) एक संदंश-संरक्षण एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखा पकवान पर संदंश का उपयोग कर के बाहर दिमाग काटना। नोट: मक्खी के मस्तिष्क विच्छेदन के लिए एक प्रोटोकॉल अवरोही किया गया हैपहले 16 ribed।
  3. 1x पीबीएस 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 4% formaldehyde युक्त के साथ एक गिलास मौके थाली में मक्खी दिमाग को ठीक करें। कदम के शेष के लिए इस कांच मौके थाली में मक्खी दिमाग प्रक्रिया।
  4. पीबीटी को हटाने और नए पीबीटी जल्दी से जोड़ने, धोने: 1% पीबीटी (1x पीबीएस 1% ट्राइटन X-100 युक्त) और उन्हें 1% पीबीटी (कुल्ला में प्रत्येक 30 मिनट के लिए तीन बार धोने के साथ तीन बार कुल्ला मक्खी दिमाग हटाने पीबीटी, नई पीबीटी जोड़ने के लिए, और एक कक्षीय प्रकार के बरतन का उपयोग कर नए पीबीटी में मक्खी दिमाग) सेते हैं।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर या कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी के मिश्रण के साथ उड़ दिमाग सेते हैं। खरगोश विरोधी DsRed एंटीबॉडी (1: 800), और माउस विरोधी Bruchpilot (बीआरपी) एंटीबॉडी (1:50) 1% पीबीटी में युक्त प्राथमिक एंटीबॉडी के मिश्रण का एक उदाहरण चूहे विरोधी CD8 एंटीबॉडी (100 1) है 5% सामान्य बकरी सीरम (NGS)।
  6. 1% पीबीटी के साथ तीन बार कुल्ला मक्खी दिमाग, और फिर उन्हें 1% पीबीटी के साथ 30 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार धोएं।
  7. 1% पीबीटी के साथ तीन बार कुल्ला मक्खी दिमाग, और फिर उन्हें 1% पीबीटी के साथ 30 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार धोएं। एक एंटी-शमन अभिकर्मक के साथ एक सूक्ष्म स्लाइड पर उन्हें माउंट। कवर और मक्खी दिमाग की रक्षा के लिए माइक्रो स्लाइड पर एक माइक्रो कांच कवर रखो। सूक्ष्म कवर कांच और सूक्ष्म स्पष्ट नेल पॉलिश का उपयोग स्लाइड के किनारों को सील। इन मुहिम शुरू की और 4 डिग्री सेल्सियस पर मस्तिष्क नमूनों के लिए उड़ान भरने सील स्टोर।

4. लो, प्रक्रिया, और tsMARCM क्लोन का फ्लोरोसेंट छवियों का विश्लेषण

  1. tsMARCM क्लोन fr के फ्लोरोसेंट छवियों पर कब्जाओम नमूने पसंद के confocal माइक्रोस्कोपी प्रणाली का उपयोग कर 3.8 चरण में बनाया।
  2. दो आयामी में tsMARCM confocal फ्लोरोसेंट छवियों की परियोजना के ढेर, इमेज प्रोसेसिंग पसंद के confocal माइक्रोस्कोपी प्रणाली के साथ आपूर्ति की सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों चपटा (चित्रा 3 बी देखते हैं - 3E, 3 जी - 3J, 3 एल - 3O, और 3Q - 3T चपटा के उदाहरण के लिए confocal फ्लोरोसेंट छवियों)।
  3. एक उचित इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर (ImageJ 17 में जैसे, "सेल काउंटर" समारोह का उपयोग tsMARCM क्लोन की बहु-कोशिकीय-एनबी पक्षों की सेल संख्या की गणना, चित्रा 3E, 3J, 3O, और 3T देख सेल के उदाहरण के लिए न्यूरॉन्स के शव)।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

tsMARCM प्रणाली आम NBs से निकाली गई न्यूरॉन्स पर महत्वपूर्ण जानकारी पुन: प्राप्त करने से तंत्रिका वंश का विश्लेषण करती है और जीन समारोह के अध्ययन की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया गया है। प्रणाली, सबसे अधिक (यदि सभी नहीं) न्यूरोनल प्रकार की पहचान प्रत्येक न्यूरोनल प्रकार के सेल नंबर निर्धारित करते हैं, और करने के लिए tsMARCM के प्रयोग पर इन न्यूरॉन्स के जन्म के आदेश के 11, 12, 18 (चर्चा खंड विवरण के लिए देखें पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है तंत्रिका वंश का संचालन का विश्लेषण करती है या जीन समारोह के अध्ययन)। यहाँ, हम कैसे एक tsMARCM प्रयोग 1, 2 का संचालन करने वर्णन करने के लिए anterodorsal घ्राण प्रक्षेपण न्यूरॉन्स (ड्रोसोफिला घ्राण प्रणाली के ALad1 तंत्रिका वंश में adPNs) उदाहरण के रूप में GAL4-GH146 के साथ लेबल के चार tsMARCM क्लोन का इस्तेमाल किया। बाद FLP अभिव्यक्ति भ्रूण चरण, एक सी में प्रेरित किया गया था45 मैजेंटा adPNs के साथ जुड़े ngle, हरे VL2p adPN एक tsMARCM क्लोन (- 3E चित्रा 3 ए) में पाया गया था। इसके विपरीत, जब FLP बाद में प्रेरित किया गया था, विभिन्न लार्वा चरणों, एकल, हरी adPNs (DL1 adPN या DC3 adPN) है या नहीं, GH146 + मैजेंटा adPNs के विभिन्न संख्या (31, 21, या 15) के साथ जुड़े adPNs में तीन अन्य में मनाया गया में tsMARCM क्लोन (चित्रा 3F - 3T)। VL2p adPNs के जन्म DL1-, DC3- और कोई GH146 + -adPNs के जन्म से पहले tsMARCM क्लोन (45, 31, 21 के उनके संबद्ध बहु सेलुलर-एनबी पक्षों में adPNs की सेल नंबर की गणना के द्वारा निर्धारित किया गया था, और 15 चित्रा 3E, 3J, 3O, और 3T, क्रमशः)। tsMARCM क्लोन की बहु-कोशिकीय-एनबी पक्षों में सेल नंबर, axonal की जटिलता और वृक्ष के समान पैटर्न की गिनती के अलावा के उनके संबद्ध दो-सेल जीएमसी पक्षों के रिश्तेदार जन्म-क्रम निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताtsMARCM क्लोन। प्रारंभिक विकास के चरणों में प्रेरित मूसा के क्लोन सामान्य रूप से अधिक न्यूरॉन्स होते हैं और इस प्रकार है, और अधिक जटिल axonal और वृक्ष के समान पैटर्न है, जबकि देर से विकास के चरणों में प्रेरित पच्चीकारी क्लोन कम न्यूरॉन्स होते हैं और इस प्रकार कम जटिल axonal और वृक्ष के समान पैटर्न (चित्रा -3 सी है - 3 डी, 3H - 3I , 3M - 3N, और 3R - 3S)।

आकृति 1
चित्रा 1: ड्रोसोफिला न्यूरोजेनेसिस के योजनाबद्ध चित्र और एक MARCM प्रयोग में पाया प्रतिरूप पैटर्न के तीन प्रकार के। (ए) ड्रोसोफिला केंद्रीय मस्तिष्क का सबसे तंत्रिका प्रजातियों में एक योजनाबद्ध आरेख illustrating न्यूरोजेनेसिस: neuroblasts (एनबीएस) एक असममित विभाजन से गुजरना स्वयं renewing NBs और नाड़ीग्रन्थि मां कोशिकाओं (उत्पन्न करने के लिएGMCs), और GMCs एक बार और दो बेटी न्यूरॉन्स (एन एस) के उत्पादन के लिए विभाजित। (ख) तीन प्रतिरूप पैटर्न एक MARCM प्रयोग में मनाया जाता है: एकल कोशिका क्लोन (क), जब flippase (FLP) GMCs में प्रेरित किया है, और दो-सेल जीएमसी क्लोन (ख) और बहु-कोशिकीय-एनबी क्लोन (ग ), जब FLP NBs में प्रेरित किया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: tsMARCM प्रणाली के योजनाबद्ध चित्र। (ए) tsMARCM तैयार मक्खियों: एक माता पिता की मक्खी एक FRT साइट और यूएएस mCD8 :: GFP (पहले संवाददाता), यूएएस rCD2RNAi (प्रथम शमन कि दूसरी रिपोर्टर की अभिव्यक्ति को रोकता है), और एक ऊतक के ट्रांसजीन शामिल विशिष्ट -GAL4; अन्य माता पिता की मक्खी एक FRT शामिल साइट, यूएएस rCD2 :: आरएफपी (दूसरा रिपोर्टर), यूएएस GFPRNAi (दूसरा शमन है कि पहली रिपोर्टर की अभिव्यक्ति को रोकता है), और एच एस FLP। (बी) को पार कर tsMARCM तैयार मक्खियों की संतान में दो आरएनएआई आधारित दमन की उपस्थिति संवाददाताओं (यानी, mCD8 :: GFP और rCD2 :: पैनल बी के G1 और G2 चरणों में आरएफपी) की अभिव्यक्ति को रोकता है। FLP की अभिव्यक्ति गर्मी सदमे से प्रेरित है, और FLP तो FLP मान्यता लक्ष्य (FRTs) के लिए बाध्य पर एक विभाजन अग्रदूत कोशिका के भीतर मुताबिक़ गुणसूत्रों की साइट विशेष पुनर्संयोजन मध्यस्थता करता है। यह अलग संवाददाताओं की अभिव्यक्ति की अनुमति के लिए mitotic विभाजन के बाद जुड़वां कोशिकाओं में आरएनएआई आधारित दमन के अलगाव में यह परिणाम है। (ग) दो प्रतिरूप पैटर्न एक tsMARCM प्रयोग में मनाया जाता है: एकल कोशिका, एकल कोशिका क्लोन के साथ जुड़े (क) जब FLP GMCs में प्रेरित किया है, और दो-सेल जीएमसी, बहु-कोशिकीय-एनबी क्लोन के साथ जुड़े(ख) FLP NBs में प्रेरित किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: कैसे एक तंत्रिका वंश विश्लेषण में एक tsMARCM प्रयोग का संचालन करने के उदाहरण के रूप adPNs के चार tsMARCM क्लोन का उपयोग करना। AdPNs के चार tsMARCM क्लोन उनकी न्यूरोजेनेसिस पैटर्न (ए, एफ, कश्मीर, और पी) के चित्र के साथ सचित्र हैं; समग्र मस्तिष्क के confocal छवियों (बी, जी, एल, और क्यू), पार्श्व सींग दिखा (एलएच, सी, एच, एम, और आर), antennal पालि (AL, डी, मैं, एन, और एस) और सोम(ई, जम्मू, हे, और टी); और उनके न्यूरोनल morphologies के पैटर्न। एकल adPNs (VL2p, DL1, DC3, और कोई GH146 + adPNs, हरा) tsMARCM क्लोन की बहु-कोशिकीय-एनबी adPNs (मैजंटा) के साथ जुड़े FLP की प्रेरण द्वारा प्राप्त किए गए भ्रूण पर adPN एनबी में mitotic पुनर्संयोजन मध्यस्थता करने के लिए (ए - ई) और लार्वा (एफ - टी) चरणों। ध्यान दें कि adPNs ALad1 तंत्रिका वंश, जो ALad1 तंत्रिका के अन्य अर्ध-वंश से (चित्रा 3 में मैजेंटा adPNs अज्ञात कारणों के लिए, न्यूरॉन्स के साथ जुड़े एक एकल, हरी adPN की tsMARCM क्लोन में यह परिणाम में अर्ध-प्रजातियों में से एक हैं वंश मरने)। VL2p, DL1, DC3, और कोई GH146 + adPNs के जन्म के आदेश के धराशायी भीतर tsMARCM क्लोन (45, 31, 21 के मैजेंटा बहु सेलुलर-एनबी पक्षों में adPNs की सेल नंबर की गणना के द्वारा निर्धारित किया गया था, और 15 पैनलों ई, जम्मू की तर्जहे, और टी)। Neurite पैटर्न आमतौर पर मैजेंटा बहु सेलुलर-एनबी पक्षों में और अधिक जटिल जब tsMARCM क्लोन जल्दी विकास के चरणों में प्रेरित कर रहे हैं (जैसे, वृक्ष के समान पैटर्न पैनल ई में अधिक जटिल पैनलों मैं, एन, और एस की तुलना में)। tsMARCM का विश्लेषण करती है कभी कभी भ्रमित कर रहे हैं जब अन्य तंत्रिका प्रजातियों के न्यूरॉन्स भी एक ही GAL4 चालक द्वारा चिह्नित कर रहे हैं (जैसे, हरी एलएच न्यूरॉन्स, डबल तीर द्वारा दिखाया गया है, पैनलों बी और सी में VL2p adPNs की axonal विस्तार पैटर्न के दृश्य में बाधा डालती है) । ब्रेन neuropiles (नीले रंग में दिखाया गया है) Bruchpilot (बीआरपी) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। हीट शॉक समय: 12 मिनट (पैनल ए - ई), 15 मिनट (पैनल एफ - जे), और 35 मिनट (पैनलों कश्मीर - टी)। पैनल बी में स्केल बार - जी - जम्मू, एल - हे, और क्यू - एस = 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम

1.1.1 कदम, 1.2.1, 2.3, 2.5, और 3.2 अच्छा tsMARCM परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। ऊतक विशेष -GAL4 ड्राइवरों कि तंत्रिका progenitors में GAL4 व्यक्त नहीं करते कदम 1.1.1 और 1.2.1 के लिए पसंद कर रहे हैं। 2.3 कदम में मक्खी-खाद्य शीशियों में उगाया जानवरों अधिक भीड़ से बचें। क्योंकि प्रेरण विलंबता, गर्मी सदमे पर FLP की अभिव्यक्ति के स्तर पर, और तंत्रिका progenitors (यानी, NBs और GMCs) की औसत विभाजन के समय ज्ञात नहीं हैं, यह सबसे अच्छा है गर्मी सदमे समय भिन्न करने के लिए (10, 20, 30 , 40, और 50 मिनट) एक ही जीनोटाइप और 2.5 कदम में विकास मंच के विभिन्न नमूनों पर। इस क्रम में ब्याज की tsMARCM क्लोन का सबसे अच्छा अनुपात प्राप्त करने के लिए इष्टतम गर्मी सदमे समय के निर्धारण के लिए अनुमति देगा। इसके अलावा, आदेश बरकरार मस्तिष्क के नमूने प्राप्त करने के लिए 3.2 कदम में मक्खी के मस्तिष्क विच्छेदन के दौरान सावधान रहना होगा; यह सही न्यूरोनल सेल नंबर की गिनती के लिए महत्वपूर्ण है। अनुसंधान कौशल के लिएतीरंदाजों जो अन्य गुणसूत्र बाहों पर जीन के समारोह के अध्ययन (जैसे, 2R, 3 एल, और 3R), tsMARCM तैयार मक्खियों 1.2 चरण में के रूप में FRT, UAS- की transgenes की उचित जोड़े का चयन करके इकट्ठा किया जाना चाहिए के लिए tsMARCM का उपयोग करने में रुचि रखते हैं mCD8.GFP.UAS-rCD2i, और यूएएस rCD2.RFP.UAS-GFPi, जो तालिका 1 में संकेत कर रहे हैं। हम यह भी सुझाव है कि महिला tsMARCM तैयार मक्खियों एक्स गुणसूत्र (जैसे, एच एस FLP [22], डब्ल्यू, यूएएस rCD2 :: आरएफपी, यूएएस GFPRNAi, FRT 40A + +) पर ले जाने के एच एस FLP, जो बार-बार tsMARCM प्रयोगों की सुविधा।

संशोधन, समस्या निवारण, और तकनीक की सीमाएं

दक्षता और आरएनएआई दमन और पत्रकारों के perdurance तंत्रिका वंश का विश्लेषण करती है और जीन समारोह के अध्ययन सफलतापूर्वक tsMARCM प्रयोगों में किया जा सकता है कि क्या के लिए प्रमुख निर्धारक हैं। आम तौर पर, आरएनएआई दमन की कम perdurance के संयोजन और, तंत्रिका progenitors से निकाली गई एक साथ बाद mitotic न्यूरॉन्स में आरएनएआई दमन और पत्रकारों के उच्च अभिव्यक्ति के साथ संवाददाताओं से बेहतर tsMARCM परिणाम दे सकते हैं। क्योंकि आरएनएआई दमन और पत्रकारों की अभिव्यक्ति GAL4 चालकों द्वारा नियंत्रित किया जाता है, शोधकर्ताओं मजबूत GAL4 ड्राइवर है कि तंत्रिका progenitors में विभेदित न्यूरॉन्स में GAL4 को व्यक्त नहीं बल्कि चयन करना चाहिए। उदाहरण के लिए, Gal4-OK107 एक मजबूत GAL4 ड्राइवर है कि मशरूम शरीर (एमबी) पूर्वज और उनके डेरिवेटिव, एमबी γ, α '/ β', और α / β न्यूरॉन्स 11, 19 में GAL4 व्यक्त करता है। एमबी गामा न्यूरॉन्स की विश्वासघाती लेबलिंग दो प्रतिरूप पैटर्न में देखा गया है (यानी, एकल कोशिका एकल कोशिका क्लोन और दो-सेल जीएमसी बहु सेलुलर-एनबी क्लोन के साथ जुड़े के साथ जुड़े) जब GAL4-OK107 tsMARCM प्रयोगों 11 में इस्तेमाल किया गया था । दिलचस्प, उपरोक्त मुद्दे MB247-Gal4, एक अलग एमबी GAL4 ड्राइवर का उपयोग करके हल किया जा सकताकि भेदभाव एमबी न्यूरॉन्स 11 में GAL4 व्यक्त करता है।

नहीं सभी GAL4 ड्राइवरों tsMARCM प्रणाली में या अन्य पच्चीकारी लेबलिंग सिस्टम में इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे, MARCM, क्यू MARCM, और जुड़वां मौके जनरेटर) 4, 20, 21 अगर ड्राइवर ब्याज की न्यूरॉन्स में व्यक्त नहीं कर रहा है। इसलिए, तंत्रिका वंश के लिए tsMARCM उपयोग करने से पहले विश्लेषण, Gal4 ड्राइवरों एक पैन-सेल ड्राइवर के साथ दोहरे अभिव्यक्ति नियंत्रण MARCM में ब्याज की न्यूरॉन्स के अपने कवरेज के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए (जैसे, tubulin प्रमोटर LexA :: जीएडी) 22 । हम ध्यान दें कि tsMARCM क्लोन कभी कभी असंदिग्ध रूप से विश्लेषण नहीं किया जा सकता है, खासकर जब एक जटिल तंत्रिका अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ एक GAL4 ड्राइवर प्रयोग किया जाता है (उदाहरण के लिए, हरी पार्श्व सींग (एलएच) न्यूरॉन्स चित्रा 3 बी में VL2p adPN की axonal विस्तार पैटर्न का स्पष्ट दृश्य को रोकने और (जैसे, MARCM, क्यू MARCM, और जुड़वां मौके जनरेटर) 4, 20, 21, क्योंकि सीमा GAL4 ड्राइवर के साथ निकलती है। हम यह भी ध्यान दें कि, जीन कार्यों के प्रमाणीकरण के लिए बचाव प्रयोगों का संचालन करने, बचाव ट्रांसजीन 5 में आरएनएआई दमन का लक्ष्य दृश्यों 'या' 3 ट्रांसजेनिक बचाव निर्माणों की ग़ैर-अनुवादित क्षेत्रों, या एक वैकल्पिक जुड़वां मौके साथ इंजीनियर किया जाना चाहिए लेबलिंग प्रणाली (जैसे, मिलकर MARCM, क्यू MARCM और पारंपरिक MARCM का एक संयोजन) 21 अपनाया जाना चाहिए।

मौजूदा / वैकल्पिक तरीके के लिए सम्मान के साथ तकनीक का महत्व

tsMARCM, जुड़वां मौके जनरेटर और युग्मित MARCM इसके अलावा भी, सिद्धांत में कम से कम, के दृश्य के लिए अनुमति होगीदो अलग-अलग रंगों में आम तंत्रिका progenitors से निकाली गई न्यूरॉन्स (इन तीन पच्चीकारी लेबलिंग प्रौद्योगिकियों की तुलना में पहले से प्रस्तुत किया गया है 15)। जुड़वां मौके जनरेटर, tsMARCM के मूल संस्करण (या tsMARCM का नया संस्करण) के संयोजन के लिए आवश्यक transgenes की न्यूनतम संख्या, और युग्मित MARCM 4, 8 (या 6), और 9, क्रमशः है। हालांकि, tsMARCM केवल प्रणाली है कि व्यापक तंत्रिका वंश का विश्लेषण करती है 12, 15, 18, 23 का संचालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। साइट विशिष्ट पुनर्संयोजन जुड़वां मौके जनरेटर प्रणाली में गैर mitotic कोशिकाओं में पाए जाते है, और यह एक ही सेल में दो पत्रकारों के सह-अभिव्यक्ति की ओर जाता है, यह चुनौतीपूर्ण केंद्रीय के विकास का अध्ययन करने के लिए इस प्रणाली का उपयोग करने के लिए बना तंत्रिका तंत्र 15। इसके विपरीत, पच्चीकारी क्लोन tsMARCM में प्राप्त और युग्मित MARCM सिस्टम एकmitotic कोशिकाओं से व्युत्पन्न रहे हैं। हालांकि, क्योंकि मिलकर MARCM प्रणाली क्यू MARCM और पारंपरिक MARCM प्रणाली में विभिन्न पत्रकारों की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए दो स्वतंत्र ड्राइवरों की आवश्यकता है, इस आम तंत्रिका progenitors से निकाली गई न्यूरॉन्स की लेबलिंग के बारे में चिंताओं को यदि दो स्वतंत्र ड्राइवरों ईमानदारी से नहीं कर उठाती है ब्याज 15 के तंत्रिका प्रजातियों में एक ही न्यूरॉन्स लेबल।

भविष्य के अनुप्रयोगों या दिशा-निर्देश तकनीक माहिर के बाद

उच्च संकल्प तंत्रिका वंश विश्लेषण आचरण tsMARCM का प्रयोग
82 न्यूरॉन्स की कुल के साथ, चित्रा 3 में इस्तेमाल व्यवस्थित adPNs की tsMARCM क्लोन, adPNs के 40 प्रकार का विश्लेषण करने के दृष्टिकोण को लागू करके, पिछले एक अध्ययन में 12 की पहचान की गई। AdPNs के इन 40 प्रकार के अलावा, 35 विश्वविद्यालय glomerular adPNs है, जो रिलायंस एनर्जी (यानी, antennal पालि (AL) में एक भी glomerulus innervating) थेप्र ड्रोसोफिला मस्तिष्क 12 के अन्य क्षेत्रों के लिए घ्राण जानकारी (देखें यू एट अल में 2-4 आंकड़े।, 2010)। AdPNs के अन्य पांच प्रकार पाली glomerular adPNs (यानी, अल में कई केशिकागुच्छ innervating) है, जो अल से घ्राण जानकारी को एकीकृत और (घ्राण प्रणाली से 12 कार्यात्मक जटिलता के एक अतिरिक्त स्तर प्रदान को देखने के आंकड़े 3E-3H सकता है और थे यू में 4Z एट अल।, 2010)। भ्रूण में जन्मे adPNs, जबकि लार्वा में जन्मे adPNs प्रकार प्रति कई न्यूरॉन्स द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, (आंकड़े देख यू में 2-4 प्रकार के प्रति केवल एक न्यूरॉन है सुझाव घ्राण प्रणाली 12 में विशिष्टता और अतिरेक के बीच परस्पर क्रिया है कि वहाँ एट अल।, 2010)। दिलचस्प है, कुछ विकास संबंधी खिड़कियों के भीतर उत्पादन न्यूरॉन्स मरने के लिए किस्मत में हैं, और adPNs के कई प्रकार ALad1 तंत्रिका वंश में न्यूरॉन्स की एक निश्चित संख्या के साथ पाए जाते हैं, कि कट्टरपंथी घुड़दौड़ का घोड़ा सुझावआर और घ्राण प्रणाली के संयोजन के लिए adPNs के प्रकार कसकर विनियमित रहे 12 (यू एट अल, 2010 के आंकड़े 2H, 4V, और 5 देखते हैं;। भी चित्रा 3 पी देख - 3T)।

TsMARCM का उपयोग सही ढंग से जीन कार्यों का अध्ययन करने के लिए
जन्म-डेटिंग adPNs इसके अलावा, tsMARCM भी छह केंद्रीय जटिल GAL4-OK107 द्वारा लेबल न्यूरॉन्स के जन्म के आदेश का निर्धारण करने के लिए लागू किया गया है। इन छह न्यूरॉन्स LALv1 तंत्रिका वंश में न्यूरॉन्स कि ड्रोसोफिला केंद्रीय परिसर के circuitry जटिल मोटर पैटर्न को नियंत्रित करने के 2, 11 के लिए योगदान के एक छोटे सबसेट श्रृंगार (यू में चित्रा -4 ए और 4 बी को देखने एट अल।, 2009)। दिलचस्प बात यह है कि इन छह केंद्रीय जटिल न्यूरॉन्स से प्रत्येक एक अलग न्यूरोनल आकृति विज्ञान 11 के पास (यू में चित्रा 4D-4H और 4o देख एट अल।, 2009)। वे सब के सब देर में अलग axonal पैटर्न लेRAL गौण पालि (लाल)। पहले चार न्यूरॉन्स, noduli, केंद्रीय परिसर का एक उप-संरचना के उप-डिब्बों को उनकी डेन्ड्राइट वितरित जबकि शेष दो न्यूरॉन्स दीर्घवृत्ताभ शरीर, केंद्रीय परिसर के एक उप-संरचना करने के लिए उनके dendrites परियोजना। विशेष रूप से, 3 आरडी जन्मे केंद्रीय जटिल न्यूरॉन उदर noduli करने के लिए अपनी परियोजनाओं डेन्ड्राइट, लाल में एक कॉम्पैक्ट axonal पैटर्न के साथ, जबकि 4 वें जन्मे केंद्रीय जटिल न्यूरॉन पृष्ठीय noduli करने के लिए अपने डेन्ड्राइट वितरित करता है, में एक व्यापक axonal पैटर्न के साथ LAL 11 (यू में चित्रा 4F और 4 जी को देखने एट अल।, 2009)।

परे व्यापक पहचान के न्यूरॉन्स, tsMARCM की शक्ति, बेहतर ब्याज की न्यूरॉन्स में जीन कार्यों का अध्ययन द्वारा उदाहरण है क्योंकि tsMARCM प्रणाली बेहतर प्ररूपी विभिन्न जानवरों में समान न्यूरॉन्स की परीक्षा को सक्षम करने से विश्लेषण परमिट। उदाहरण के लिए, tsMARCM एक भी अस्थायी वसा का पता लगाता हैई परिवर्तन है कि कालक्रम के अनुसार अनुचित morphogenesis की आवश्यकता है (chinmo, एक बीटीबी-जस्ता उंगली परमाणु प्रोटीन) 3 जन्मे केंद्रीय जटिल न्यूरॉन्स 11 में (यू में चित्रा 4i, 4P, और 4W देख एट अल।, 2009)। Chinmo उत्परिवर्तन मूल MARCM प्रणाली में विशेषता किया गया था (यानी, एक हरे-लेबल न्यूरॉन्स, संदर्भ के रूप में जुड़वां कोशिकाओं के संबद्ध पक्षों से निकाली गई न्यूरॉन्स की लेबलिंग के बिना), chinmo -deficient न्यूरॉन चित्रा 4i में से दिखाया यू एट अल। 2009, 4 वें जन्मे, बजाय 3 जन्मे, केंद्रीय जटिल न्यूरॉन के रूप में गलत पहचान की गई है |। यह axonal मार्गदर्शन को नियंत्रित करने के बजाय अस्थायी भाग्य 11 को निर्दिष्ट के रूप में chinmo समारोह की गलत व्याख्या के परिणामस्वरूप होता है (यू से चित्रा 4i में डबल तीर एट अल।, 2009)। हालांकि, वें के रूप में tsMARCM क्लोन की मैजेंटा बहु सेलुलर-एनबी पक्षों का उपयोग करकेई संदर्भ में (सेल नंबर की गिनती के माध्यम से चित्रा 4m, 4N, और 4P यू एट अल से। , 2009), chinmo -deficient न्यूरॉन यू एट अल से चित्रा 4i में दिखाया गया है। 2009) 3 जन्मे केंद्रीय जटिल न्यूरॉन, जो इसलिए सही निष्कर्ष यह है कि केंद्रीय जटिल न्यूरॉन्स 11 के लिए अस्थायी भाग्य विनिर्देश में कार्य करने के लिए नेतृत्व chinmo साबित हो गया था। साथ में ले ली, ऊपर परिणाम उच्च संकल्प प्ररूपी विश्लेषण करती है, जिससे सही न्यूरॉन्स में जीन कार्यों का खुलासा (या कोशिकाओं के अन्य प्रकार, यदि लागू हो) भविष्य तंत्रिका विकास अध्ययन के लिए के लिए tsMARCM प्रणाली के महत्वपूर्ण लाभ (या अन्य की विकासात्मक अध्ययन पर प्रकाश डाला ऊतकों)।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Acknowledgments

इस काम के विज्ञान एवं प्रौद्योगिकी मंत्रालय द्वारा समर्थित किया गया (सबसे 104-2311-बी-001-034) और सेलुलर के संस्थान और organismic जीवविज्ञान, एकेडेमिया सिनिका, ताइवान।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carbon dioxide (CO2) Local vendor n.a. Anesthetize flies
CO2 pad Local vendor n.a. Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4 Uniregion Bio-Tech (or other vendors) PBS001 Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549 Fix fly brains
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat Jackson ImmunoResearch  005-000-121 Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody Invitrogen MCD0800 Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody Clonetech 632496 Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody Developmental Studies Hybridoma Bank nc82 Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488 Invitrogen A11006 Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546 Invitrogen A11035 Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647 Invitrogen A21236 Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent Molecular Probes S36936 Mount fly brains and protect quenching of fluorescence 
PYREX 9 depression glass spot plate Corning 7220-85 Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit World Precision Instruments SYLG184 Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal Sigma-Aldrich 242276-250G Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11252-30 Dissect and mount fly brains
Micro slide Corning 2948-75x25 Mount fly brains
Micro cover glass No. 1.5 VWR International 48366-205 Mount fly brains
Nail polish Local vendor not available Seal micro cover glass on micro slides
Incubator  Kansin Instruments LTI603 culture flies at 25 °C
(or other vendors)
Water bath Kansin Instruments WB212-B2 Induce heat-shock in flies at 37 °C
(or other vendors)
Orbital shaker Kansin Instruments OS701 Wash and immunostain fly brains
(or other vendors)
Dissection microscope Leica EZ4 Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope Zeiss (or other vendors) LSM 700 (or other models) Image tsMARCM clones
image-processing software 1
(e.g., Zeiss LSM image browser) 		 Zeiss not available Project stacks of confocal images
image-processing software 2
(e.g., ImageJ) 		 not available not available Count cell number of tsMARCM clones

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ito, M., Masuda, N., Shinomiya, K., Endo, K., Ito, K. Systematic analysis of neural projections reveals clonal composition of the Drosophila brain. Curr Biol. 23 (8), 644-655 (2013).
  2. Yu, H. H., et al. Clonal development and organization of the adult Drosophila central brain. Curr Biol. 23 (8), 633-643 (2013).
  3. Goodman, C. S., Doe, C. Q. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1993).
  4. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
  5. Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
  6. Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
  7. Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Curr Biol. 21 (1), 1-11 (2011).
  8. Jefferis, G. S., Marin, E. C., Stocker, R. F., Luo, L. Target neuron prespecification in the olfactory map of Drosophila. Nature. 414 (6860), 204-208 (2001).
  9. Hong, W., Luo, L. Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system. Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).
  10. Zhu, S., et al. Gradients of the Drosophila Chinmo BTB-zinc finger protein govern neuronal temporal identity. Cell. 127 (2), 409-422 (2006).
  11. Yu, H. H., Chen, C. H., Shi, L., Huang, Y., Lee, T. Twin-spot MARCM to reveal the developmental origin and identity of neurons. Nat Neurosci. 12 (7), 947-953 (2009).
  12. Yu, H. H., et al. A complete developmental sequence of a Drosophila neuronal lineage as revealed by twin-spot MARCM. PLoS Biol. 8 (8), (2010).
  13. Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
  14. Awasaki, T., et al. Making Drosophila lineage-restricted drivers via patterned recombination in neuroblasts. Nat Neurosci. 17 (4), 631-637 (2014).
  15. Lee, T. Generating mosaics for lineage analysis in flies. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (1), 69-81 (2014).
  16. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  18. Lin, S., Kao, C. F., Yu, H. H., Huang, Y., Lee, T. Lineage analysis of Drosophila lateral antennal lobe neurons reveals notch-dependent binary temporal fate decisions. PLoS Biol. 10 (11), e1001425 (2012).
  19. Zhan, X. L., et al. Analysis of Dscam diversity in regulating axon guidance in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 43 (5), 673-686 (2004).
  20. Griffin, R., et al. The twin spot generator for differential Drosophila lineage analysis. Nat Methods. 6 (8), 600-602 (2009).
  21. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  22. Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
  23. Kao, C. F., Yu, H. H., He, Y., Kao, J. C., Lee, T. Hierarchical deployment of factors regulating temporal fate in a diverse neuronal lineage of the Drosophila central brain. Neuron. 73 (4), 677-684 (2012).

Tags

विकास जीवविज्ञान अंक 121 जुड़वां मौके MARCM सेल वंश विश्लेषण जन्म के आदेश एकल कोशिका संकल्प न्यूरोनल आकृति विज्ञान जीन कार्यों
सेल वंश विश्लेषण और जीन समारोह अध्ययन ट्विन मौके MARCM का प्रयोग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shen, H. C., Hsu, T. C., Chung, P.… More

Shen, H. C., Hsu, T. C., Chung, P. C., Yu, H. H. Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM. J. Vis. Exp. (121), e55278, doi:10.3791/55278 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter