Le analisi delle cellule lignaggio e studi la funzione del gene Impiegando doppi loco MARCM

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per una tecnica di etichettatura mosaico che permette la visualizzazione dei neuroni derivati ​​da una cellula progenitrice comune in due colori distinti. Questo facilita l'analisi lignaggio neurale con la capacità di singoli neuroni nascita aggiornamento e la funzione del gene studiando negli stessi neuroni di diversi individui.

Abstract

M osaic un nalisi con una r epressible c ell m Arker (MARCM) è un sistema di etichettatura mosaico positivo che è stato ampiamente applicato in Drosophila studi neurobiologici per descrivere morfologie intricate e di manipolare la funzione dei geni in sottoinsiemi di neuroni all'interno altrimenti non marcato e imperturbabile organismi. mosaici genetici generati nel sistema MARCM sono mediati attraverso la ricombinazione sito-specifica tra cromosomi omologhi all'interno di divisione delle cellule precursori per la produzione di entrambi marcati (cloni marcm) e cellule figlie non marcate durante la mitosi. Una estensione del metodo MARCM, chiamato twin-spot MARCM (tsMARCM), etichette sia delle cellule gemelle derivate da un progenitore comune con due colori distinti. Questa tecnica è stata sviluppata per consentire il reperimento di informazioni utili da entrambe le emi-linee. Con completo Analizzando diverse coppie di cloni tsMARCM, il sistema consente di tsMARCM ad alta risoluzione neurale lignaggio Mapping di rivelare l'esatto nascita ordine dei neuroni marcati prodotte dalle cellule progenitrici comuni. Inoltre, il sistema tsMARCM estende anche studi di funzione genica consentendo l'analisi fenotipica dei neuroni identici di diversi animali. Qui, descriviamo come applicare il sistema tsMARCM per facilitare gli studi di sviluppo neurale in Drosophila.

Introduction

Il cervello, costituito da un vasto numero e diversi tipi di neuroni, dota gli animali con la capacità di percepire, di processo e rispondere alle sfide provenienti dal mondo esterno. I neuroni dell'adulto Drosophila cervello centrale sono derivati da un numero limitato di cellule staminali neurali, chiamati neuroblasti (NBS), durante lo sviluppo ^{1, 2.} La maggior parte di NBS partecipare a neurogenesi cerebrale in Drosophila sottoposti divisione asimmetrica per generare NBs auto-rinnovamento e cellule madri gangliari (GMC), e le GMCs poi passare attraverso un altro giro di divisione per la produzione di due cellule figlie che si differenziano in neuroni ³ (Figura 1A ). A causa della complessità della morfologia neuronale e le sfide connesse con l'identificazione neuroni specifici, una tecnologia positiva etichettatura mosaico, analisi mosaico con un marker delle cellule reprimibile (MARCM), è stato inventato per consentire la visualizatione di un singolo neurone o un piccolo sottoinsieme di neuroni dalla popolazione di neuroni circostanti, senza etichetta ^4.

MARCM utilizza il sistema / target riconoscimento FLP (FRT) mediare ricombinazione sito-specifica tra cromosomi omologhi all'interno di una cella di divisione precursore portando un allele eterozigote di un gene repressore, la cui espressione normalmente inibisce l'espressione di un gene reporter ⁴ flippase (FLP). Dopo la divisione mitotica, i cromosomi ricombinanti sono segregati in cellule gemelle, tale che una cella contiene alleli omozigoti del gene repressore e l'altra cella ha repressore gene-espressione del reporter in quella cella (ei suoi discendenti) non è più bloccato ^4. Tre modelli clonali si trovano di solito in un esperimento MARCM quando FLP è stocasticamente indotta in NBs o GMCs: unicellulari e due celle-GMC cloni, che raffigurano la morfologia dei neuroni a resolutio cella singolan, e multi-cellulare-NB cloni, che rivelano interi modelli morfologici di neuroni derivati da una NB comune (Figura 1B). La tecnica MARCM è stato ampiamente applicato in Drosophila studi neurobiologici, compresa l'identificazione di tipo neuronale per ricostruire le reti di cablaggio in tutto il cervello, neurali lignaggio analisi per rivelare la storia dello sviluppo dei neuroni, la caratterizzazione fenotipica delle funzioni dei geni coinvolti nella determinazione del fato cellulare, e la morfogenesi neuronale e differenziazione studia ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Poiché MARCM convenzionale etichetta solo una delle due cellule figlie (e linee) dopo l'evento di ricombinazione mitotica indotta, informazioni potenzialmente utili dal lato marcato viene persa. Questa limitazione osta all'applicazione della base MSistema ARCM a ad alta risoluzione le analisi di molti lignaggi neuronali che si attivano destino delle cellule in tempo veloce o per la precisione di analisi delle funzioni dei geni nei neuroni identici di diversi animali ^{11, 12.}

Twin-loco MARCM (tsMARCM) è un sistema avanzato che etichette neuroni derivati da un progenitore comune con due colori distinti, che permette il recupero delle informazioni utili da entrambi i lati delle celle gemelle, superando la limitazione del sistema MARCM originale ¹¹ ( Figura 2A - 2C). Nel sistema tsMARCM, due interferenza RNA (RNAi) a base di soppressori sono situati trans siti di cromosomi omologhi all'interno di una cellula precursore, e l'espressione di tali soppressori inibiscono in maniera indipendente l'espressione dei rispettivi reporter (Figura 2B). A seguito di site-specific ricombinazione mitotica mediata attraverso il sistema FLP / FRT, la TWsoppressori o basati RNAi diventare segregati in cellule gemelle per consentire l'espressione del reporter distinti (Figura 2B). Due modelli clonali, cella singola associata con cloni unicellulari e due celle-GMC associati con cloni multi-cellulari-NB, sono in genere visti in un esperimento tsMARCM (Figura 2C). Informazioni derivato da un lato delle celle singoli possono essere utilizzati come riferimento per l'altro lato, consentendo ad alta risoluzione analizza neurale lineage, come nascita-incontra i neuroni marcati, e fenotipica analisi dei neuroni identici in diversi animali per l'indagine precisa della funzione del gene neurale ^{11, 12.} Qui, vi presentiamo un protocollo passo-passo che descrive come condurre un esperimento tsMARCM, che può essere utilizzato da altri laboratori per ampliare gli studi di sviluppo neurale (nonché lo sviluppo di altri tessuti, se del caso) in Drosophila.

Protocol

1. Costruire tsMARCM-ready mosche Uso del Required transgeni ^{11, 13}

1. Generare la versione originale di mosche tsMARCM-ready da transgeni che vengono effettuate da singoli mosche ¹¹ (vedi tabella 1). Condurre programmi di incrocio standard di mosca genetiche, che sono stati descritti in precedenza, mettendo più transgeni nelle stesse scorte Fly ^13.
   1. In una linea parentale, assemblare i transgeni di FRT ^40A, UAS-mCD8 :: GFP (primo giornalista, mCD8 :: GFP, espressione del transgene è sotto il controllo del promotore upstream sequenza di attivazione, che produce un reporter membrana legato del gruppo murino di differenziazione 8 proteina fusa con la proteina fluorescente verde), e UAS-rCD2RNAi (il soppressore che inibisce l'espressione del secondo giornalista, l'RNAi contro l'espressione di cluster di ratto of differenziazione 2, RCD2) sul braccio sinistro del cromosoma 2 ^nd. Posto conducente -GAL4 sulla X o 3 ^° cromosoma, se possibile specifici tessuti.
   2. In altra linea dei genitori, assemblare i transgeni di FRT ^40A, UAS-RCD2 :: RFP (il secondo giornalista, RCD2 :: RFP, l'altro giornalista membrana-tethered composto da RCD2 proteina fusa con la proteina fluorescente rossa), e UAS-GFPRNAi (il soppressore che inibisce l'espressione di mCD8 :: GFP; RNAi contro l'espressione di GFP) sul braccio sinistro del cromosoma 2 ^nd. Posizionare heat-shock (HS) -FLP o FLP tessuto-specific- sulla X o 3 ^° cromosoma, se possibile.
2. Generare la nuova versione di mosche tsMARCM-ready da transgeni che vengono effettuate da singoli mosche ¹⁴ (vedi tabella 1). Condurre mosca genetica schemi di incrocio standard, che sono stati descritti previously, mettendo più transgeni nelle stesse scorte Fly ^13.
   1. In una linea parentale, assemblare i transgeni di un sito FRT ed UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (un transgene combinato di mCD8 :: GFP e il soppressore che inibisce l'espressione di RCD2 :: RFP) insieme nello stesso braccio il 2 ^° o 3 ^° cromosoma (coppie appropriate di transgeni di FRT e UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i vengono riportati in Tabella 1). Posizionare conducente tessuto-specifico GAL4 sui cromosomi diversi cromosoma del sito FRT prescelto, se possibile.
   2. In altra linea parentale, assemblare i transgeni di un sito FRT ed UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (l'altra transgene combinato di RCD2 :: RFP e il soppressore che inibisce l'espressione di mCD8 :: GFP) nello stesso braccio dei 2 ^° o 3 ^° cromosomiche (appropriate coppie di transgeni di FRT UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi sono indicati nella Tabella 1). Inserire hs-FLP o tessuto-specifici FLP su cromosomi diversi cromosoma del sito FRT prescelto, se possibile.

2. Croce tsMARCM pronto vola a generare cloni tsMARCM a loro progenie

1. Mosche Croce tsMARCM-ready insieme (ad esempio, mettere 10-15 mosche maschio dal punto 1.1.1 o 1.2.1 e 20-30 femmina vergine vola dal punto 1.1.2 o 1.2.2 insieme) in un flaconcino fly-cibo con fresco pasta di lievito -made sulla parete del flaconcino.
2. Mantenere le incrociate mosche tsMARCM-ready a 25 ° C per 2 giorni per migliorare le possibilità di accoppiamento prima di raccogliere uova fecondate.
3. trasferire Spesso i incrociate mosche tsMARCM-ready in flaconcini appena yeasted per evitare affollamento (toccare le mosche o utilizzare anidride carbonica per anestetizzare le mosche per facilitare il trasferimento; tenere non più di 80-100 uova fecondate in 10 mL fly-alimentare tramiteL Per evitare troppi larve tratteggiata).
4. Culture gli animali tsMARCM (vale a dire, uova fecondate, un esempio del genotipo di animali tsMARCM, utilizzato in figura 3, è hs-FLP ^[22], w / w; UAS-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT ^40A , GAL4-GH146 / UAS-RCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT ^40A; +; +) che sono state previste nelle fiale in serie trasferiti a 25 ° C fino a quando si sviluppano alle fasi desiderata (ad esempio, gli embrioni, larve, o pupe).
5. Posizionare le fiale trasferite che contengono animali tsMARCM allo stesso stadio di sviluppo in un bagno 37 ° C acqua per 10, 20, 30, 40, e 50 minuti per determinare il tempo ottimale di heat-shock che induce l'espressione di FLP per generare la cloni tsMARCM di interesse. Ignorare questo passaggio se FLP tessuto-specific- viene utilizzato nell'esperimento tsMARCM (hs-FLP è preferito per lignaggio neurale analisi, le ragioni di questa preferenza sono stati descritti in precedenza ¹⁵).
   NOTA: Ripetere il passaggio 2,5 utilizzando il tempo ottimale di heat-shock in esperimenti tsMARCM successivi se più tsMARCM cloni di interesse sono ricercati; in generale, più l'espressione FLP è indotta in hs-FLP ^[22] rispetto al hs-FLP ^[1] con lo stesso tempo di calore-shock.
6. Cultura le calore scioccato animali tsMARCM a 25 ° C fino a quando non hanno raggiunto la fase di sviluppo appropriato, quindi passare al punto 3.

3. Preparare, Mordente, e Brains Monte Fly contenenti tsMARCM cloni

1. Preparare piatti pinze-protezione. Miscelare la parte A (30 g) e la parte B (3 g) del Kit elastomero di silicone con carbone attivo (0,25 g). Versare il composto in piatti appositi.
2. Sezionare larvali, pupa, o cervello adulto fuori degli animali tsMARCM in 1x PBS (PBS) utilizzando una pinza su un piatto pinze protezione viste attraverso un microscopio dissezione. NOTA: Un protocollo per la dissezione mosca cervello è stato discribed in precedenza ^16.
3. Fissare il cervello mosca in un posto piatto di vetro con 1x PBS contenente 4% di formaldeide a temperatura ambiente per 20 min. Elaborare i cervelli volano in questo posto piatto di vetro per il resto dei passaggi.
4. Risciacquare il cervello volare tre volte con 1% PBT (1x PBS contenente 1% Triton X-100) e lavarli tre volte per 30 minuti ciascuno in 1% PBT (risciacquo: rimuovere PBT e aggiungere nuovi PBT rapidamente; lavare: rimuovere PBT, aggiungere nuove PBT, e incubare il cervello mosca nel nuovo PBT utilizzando un agitatore orbitale).
5. Incubare le cervelli mosca con la miscela di anticorpi primari notte a 4 ° C o per 4 ore a temperatura ambiente. Un esempio della miscela di anticorpi primari è rat anticorpo anti-CD8 (1: 100), coniglio anticorpo anti-DsRed (1: 800), e Bruchpilot anti-anticorpo di topo (BPA) (1:50) in 1% PBT contenente 5% di siero normale di capra (NGS).
6. Risciacquare il cervello volare tre volte con 1% PBT, e poi lavarli tre volte per 30 minuti ciascuno con 1% PBT.
7. Risciacquare il cervello volare tre volte con 1% PBT, e poi lavarli tre volte per 30 minuti ciascuno con 1% PBT. montarli su un micro diapositiva con un reagente anti-tempra. Mettere un vetro di copertura micro sul micro vetrino per coprire e proteggere il cervello mosca. Sigillare i bordi del micro vetrino di copertura in vetro e micro con smalto trasparente. Memorizzare questi montati e sigillati volare campioni di cervello a 4 ° C.

4. Prendere, di processo, e analizzare le immagini fluorescenti di tsMARCM cloni

1. Cattura immagini fluorescenti di cloni fr tsMARCMom i campioni creati nel passaggio 3,8 utilizzando il sistema di microscopia confocale di scelta.
2. Pile progetto di tsMARCM immagini fluorescenti confocale in due dimensioni, immagini appiattite utilizzando il software di elaborazione delle immagini fornito con il sistema di microscopia confocale di scelta (vedi Figura 3B - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O, e 3Q - 3T per esempi di appiattito immagini fluorescenti confocale).
3. Contare il numero di cellule dei lati multi-cellulare-NB dei cloni tsMARCM utilizzando un software di elaborazione delle immagini appropriata (ad esempio, la funzione "Cell Counter" in ImageJ ^17; vedi Figura 3E, 3J, 3O e 3T per gli esempi della cellula corpi dei neuroni).

Representative Results

Il sistema tsMARCM è stato utilizzato per facilitare neurale lignaggio analisi e studi la funzione del gene per il recupero delle informazioni importanti sui neuroni derivati ​​da NBs comuni. Il sistema è stato utilizzato per identificare la maggior parte (se non tutti) i tipi neuronali, determinare il numero di cellule di ogni tipo neuronale, e accertare la nascita di ordine di questi neuroni ^{11, 12, 18} (si veda la sezione di discussione per i dettagli sull'uso tsMARCM a condurre lignaggio neurale analisi o studi di funzione genica). Qui, abbiamo usato quattro cloni tsMARCM di neuroni olfattivi anterodorsale di proiezione (adPNs nel ALad1 neurali lignaggio del sistema olfattivo Drosophila) etichettati con GAL4-GH146 come esempi per illustrare come condurre un esperimento tsMARCM ^{1, 2.} Dopo espressione FLP è stata indotta allo stadio embrionale, un SIngle, verde VL2p adPN associata con 45 adPNs magenta è stato rilevato in un clone tsMARCM (Figura 3A - 3E). Al contrario, quando FLP è stata indotta in seguito, a diversi stadi larvali, singoli, adPNs verdi (DL1 adPN o DC3 adPN) o no-GH146 + adPNs associato a un diverso numero di adPNs magenta (31, 21, o 15) sono stati osservati in altri tre cloni tsMARCM (Figura 3F - 3T). La nascita di VL2p adPNs prima della nascita di DL1-, DC3- e nessuno GH146 + -adPNs è stato determinato contando il numero di cellule di adPNs nelle loro associati lati multi-cellulare-NB dei cloni tsMARCM (45, 31, 21, e 15 in figura 3E, 3J, 3O e 3T rispettivamente). Oltre a contare i numeri di cellule, la complessità del assonale e modelli dendritiche nei lati pluricellulare-NB dei cloni tsMARCM può essere utilizzato per determinare l'ordine di nascita dei loro associati lati due celle-GMC delcloni tsMARCM. Cloni mosaico indotte nelle fasi iniziali di sviluppo normalmente contenere più neuroni e quindi hanno assonale più complesse e modelli dendritiche, mentre cloni mosaico indotte nelle fasi tardive di sviluppo contenere un minor numero di neuroni e quindi hanno assonale e dendritiche modelli meno complessi (Figura 3C - 3D, 3H - 3I , 3M - 3N, e 3R - 3S).

Figura 1: schema dell'architettura Drosophila neurogenesi e tre tipi di modelli clonali disponibili a un esperimento MARCM. (A) uno schema che illustra la neurogenesi nei lignaggi più neurali del cervello centrale Drosophila: neuroblasti (NBS) subiscono una divisione asimmetrica per generare NBs auto-rinnovamento e cellule madri ganglio (GMC), e GMC dividono ancora una volta per la produzione di due neuroni figlie (ns). (B) tre modelli clonali sono osservati in un esperimento MARCM: cloni monocellulari (a), quando flippase (FLP) è indotta in GMCs e cloni due celle-GMC (b) e cloni pluricellulare-NB (c ), quando FLP è indotta in NBs. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Diagrammi di sistema tsMARCM. (A) linea tsMARCM-ready: uno volare parentale contiene transgeni di un sito FRT ed UAS-mCD8 :: GFP (primo giornalista), UAS-rCD2RNAi (il primo soppressore che inibisce l'espressione del secondo giornalista), e un tessuto SPECIFICI -GAL4; l'altra mosca genitori contiene un FRT UAS-RCD2 :: RFP (il secondo giornalista), UAS-GFPRNAi (secondo soppressore che inibisce l'espressione del primo giornalista), e hs-FLP. (B) La presenza dei due soppressori RNAi-based nella progenie dei incrociate mosche tsMARCM-ready inibisce l'espressione di giornalisti (cioè, mCD8 :: GFP e RCD2 :: RFP nelle fasi G1 e G2 del pannello B). L'espressione di FLP è indotta da shock termico, e quindi FLP media la ricombinazione sito-specifica dei cromosomi omologhi all'interno di una cellula precursore di separazione dal legame di obiettivi di riconoscimento FLP (FUz). Ciò comporta la segregazione dei soppressori RNAi basati nelle cellule gemelle dopo la divisione mitotica per consentire l'espressione del reporter distinte. (C) due modelli clonali sono osservati in un esperimento tsMARCM: cella singola, associata a cloni monocellulari (a) quando FLP è indotta a GMC, e due celle-GMC, associata a cloni multi-cellulare-NB(B) quando FLP è indotta in NBs. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Utilizzando quattro cloni tsMARCM di adPNs come esempi di come condurre un esperimento tsMARCM in un'analisi lignaggio neurale. Quattro cloni tsMARCM di adPNs sono illustrate, con diagrammi di loro modelli di neurogenesi (A, F, K, e P); immagini confocali del cervello generale (B, G, L, e Q), che mostra il corno laterale (LH, C, H, M e R), il lobo antennale (AL, D, I, N e S) e la soma(E, J, O e T); e gli schemi delle loro morfologie neuronali. adPNs singoli (VL2p, DL1, DC3, e nessuno GH146 + adPNs; verde) associati con multi-cellulare-NB adPNs (magenta) dei cloni tsMARCM sono stati derivati ​​dalla induzione di FLP di mediare ricombinazione mitotica nel adPN NB al embrionali (A - e) e larvali - fasi (F T). Si noti che adPNs sono una delle emi-lignaggi nel ALad1 lignaggio neurale, che si traduce in tsMARCM cloni di un unico, adPN verde associato con adPNs magenta in figura 3 (per ragioni sconosciute, i neuroni dall'altro emi-lignaggio del neurale ALad1 die stirpe). La nascita-ordine di VL2p, DL1, DC3, e nessuno GH146 + adPNs è stato determinato contando il numero di cellule di adPNs nei lati magenta multi-cellulare-NB dei cloni tsMARCM (45, 31, 21, e 15, all'interno della tratteggiata linee di pannelli E, J, O e T). I modelli neuriti sono generalmente più complessi negli magenta lati pluricellulare-NB quando i cloni tsMARCM sono indotti nelle fasi iniziali dello sviluppo (per esempio, il pattern dendritico è più complessa in pannello E rispetto ai pannelli I, N e S). tsMARCM analizza talvolta confusione quando i neuroni di altre linee neurali sono etichettati anche dal conducente stesso GAL4 (ad esempio, i neuroni LH verdi, indicati dalle doppie frecce, ostacolano la visualizzazione del modello dell'elaborazione assonale delle adPNs VL2p in pannelli B e C) . neuropiles cerebrali (in blu) sono state colorate con l'anticorpo contro Bruchpilot (BPA). Tempo di calore-shock: 12 min (pannelli A - E), 15 min (pannelli F - J), e 35 min (pannelli K - T). Barra della scala in pannelli B - G - J, L - O, e Q - S = 10 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

I passaggi critici all'interno del protocollo

I passi 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5 e 3.2 sono fondamentali per ottenere buoni risultati tsMARCM. Driver -GAL4 tessuto-specifica che non esprimono GAL4 in progenitori neurali sono preferiti per passi 1.1.1 e 1.2.1. Evitare di sovraffollamento gli animali cresciuti in fiale fly-alimentari nella fase 2.3. Poiché la latenza di induzione, il livello di espressione di FLP upon heat-shock, e il tempo medio di divisione dei progenitori neurali (cioè, NBS e GMC) non sono noti, è meglio variare il tempo di shock termico (10, 20, 30 , 40 e 50 min) su diversi campioni dello stesso genotipo e stadio di sviluppo al passo 2.5. Ciò consentirà per la determinazione del tempo ottimale shock termico al fine di ottenere il miglior rapporto tra tsMARCM cloni di interesse. Inoltre, fare attenzione durante la dissezione volo cervello in fase 3.2, al fine di ottenere campioni di cervello intatto; questo è fondamentale per contare con precisione il numero di cellule neuronali. per RESEarcieri che sono interessati ad utilizzare tsMARCM per lo studio della funzione dei geni su altri bracci del cromosoma (ad esempio, 2R, 3L e 3R), mosche tsMARCM-ready deve essere assemblato come al punto 1.2, scegliendo coppie appropriati di transgeni di FRT, UAS- mCD8.GFP.UAS-rCD2i e UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi, che sono indicati nella tabella 1. Si raccomanda anche che le mosche tsMARCM-ready femminili portano hs-FLP sul cromosoma X (per esempio, hs-FLP ^[22], w; UAS-RCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT ^40A; +; +), che facilita esperimenti tsMARCM ripetuti.

Modifiche, risoluzione dei problemi e limiti della tecnica

L'efficienza e perdurance di soppressori RNAi e giornalisti sono le principali determinanti per se neurale lignaggio analisi e studi di funzione del gene può essere eseguita con successo in esperimenti tsMARCM. In generale, la combinazione di bassa perdurance di soppressori RNAi ereporter derivati ​​da progenitori neurali, insieme con l'alta espressione di soppressori RNAi e giornalisti nei neuroni post-mitotico, permette migliori risultati tsMARCM. Poiché l'espressione di soppressori RNAi e giornalisti è controllata da driver GAL4, i ricercatori dovrebbero selezionare i driver GAL4 forti che esprimono GAL4 nei neuroni differenziati, ma non in progenitori neurali. Ad esempio, GAL4-OK107 è un driver GAL4 forte che esprime GAL4 nel corpo di funghi (MB) progenitori e loro derivati, γ MB, α '/ β', e alfa / beta neuroni ^{11, 19.} Etichettatura Unfaithful di MB neuroni γ è stata osservata in due modelli clonali (cioè cella singola associata con cloni unicellulari e due celle-GMC associati con cloni multi-cellulare-NB) quando GAL4-OK107 è stato utilizzato negli esperimenti tsMARCM ¹¹ . Curiosamente, la questione di cui sopra può essere risolto utilizzando MB247-GAL4, un driver MB GAL4 diversoche esprime GAL4 nei neuroni differenziati MB ^11.

Non tutti i driver GAL4 possono essere utilizzati nel sistema tsMARCM o in altri sistemi di etichettatura mosaico (ad esempio, MARCM, Q-MARCM e generatore twin-spot) ^{4, 20, 21} se il conducente non è espresso nei neuroni di interesse. Pertanto, prima di usare tsMARCM per lignaggio neurale le analisi, i conducenti GAL4 devono essere valutati per la loro copertura dei neuroni di interesse nella MARCM dual-espressione di controllo con un driver pan-cellule (ad esempio, tubulina promotore-Lexa :: GAD) ²² . Notiamo che i cloni tsMARCM volte non possono essere analizzati senza ambiguità, soprattutto quando si utilizza un driver GAL4 con un complesso espressione modello neurale (ad esempio, verde corno laterale (LH) neuroni impediscono chiara visualizzazione del modello dell'elaborazione assonale del VL2p adPN in Figura 3B e esempio, MARCM, Q-MARCM, e generatore di twin-spot) ^{4, 20, 21} perché la limitazione nasce con l'autista GAL4. Notiamo anche che, per condurre esperimenti di salvataggio per l'autenticazione delle funzioni dei geni, i transgeni di soccorso devono essere progettati con le sequenze bersaglio dei soppressori di RNAi in 5 'o 3' le regioni non tradotte dei costrutti di soccorso transgenici, o un gemello-spot alternativa sistema di etichettatura (ad esempio, accoppiato MARCM, una combinazione di Q-MARCM e MARCM convenzionale) ²¹ dovrebbe essere adottato.

Importanza della tecnica con rispetto agli attuali metodi alternativi /

Inoltre tsMARCM, generatore twin-spot e MARCM accoppiato sarebbe anche, almeno in teoria, consentire la visualizzazione dineuroni derivati da progenitori neurali comuni in due colori distinti (un confronto di queste tre tecnologie di etichettatura mosaico è stato presentato in precedenza ^15). Il numero minimo di transgeni necessari per l'assemblaggio generatore twin-spot, la versione originale di tsMARCM (o la nuova versione di tsMARCM), e MARCM accoppiata è di 4, 8 (o 6), e 9, rispettivamente. Tuttavia, tsMARCM è l'unico sistema che è stato usato per condurre completo lineage neurale analizza ^{12, 15, 18, 23.} ricombinazione sito-specifica si verifica in cellule non-mitotiche nel sistema generatore twin-spot, e questo porta alla co-espressione di due reporter nella stessa cella, il che rende difficile utilizzare questo sistema per studiare lo sviluppo del centro sistema nervoso ^15. Al contrario, cloni mosaico ottenuti nella tsMARCM e sistemi marcm accoppiati ari derivati ​​da cellule mitotiche. Tuttavia, poiché il sistema di MARCM accoppiato richiede due piloti indipendenti per controllare l'espressione dei diversi giornalisti nei sistemi marcm convenzionali Q-MARCM e, questo solleva preoccupazioni circa l'etichettatura dei neuroni derivati ​​da progenitori neurali comuni se i due piloti indipendenti non fanno fedelmente etichettare gli stessi neuroni nelle linee neurali di interesse ^15.

Le applicazioni future o Indicazioni Dopo aver imparato la tecnica

Utilizzando tsMARCM per condurre ad alta risoluzione analisi neurale lignaggio
Applicando l'approccio utilizzato in Figura 3 per analizzare sistematicamente tsMARCM cloni di adPNs, 40 tipi di adPNs, con un totale di 82 neuroni, sono stati identificati in un precedente studio ^12. Tra questi 40 tipi di adPNs, 35 erano adPNs uni-glomerulare (cioè, innervano un singolo glomerulo nel lobo antennale (AL)), che relay informazioni olfattive ad altre regioni del cervello Drosophila ¹² (vedi Le figure 2-4 in Yu et al., 2010). Gli altri cinque tipi di adPNs erano adPNs poli-glomerulare (vale a dire, che innervano glomeruli multipla nel AL), che potrebbe integrare le informazioni olfattive dal AL e fornire un ulteriore livello di complessità funzionale al sistema olfattivo ¹² (vedi figure 3E-3H e 4Z in Yu et al., 2010). AdPNs embrionali di origine hanno un solo neurone per ogni tipo, mentre adPNs larvali di origine sono rappresentati da più neuroni per tipo, suggerendo che vi sia interazione tra specificità e la ridondanza del sistema olfattivo ¹² (si vedano le figure 2-4 in Yu et al., 2010). È interessante notare che i neuroni prodotte entro certi finestre di sviluppo sono destinati a morire, e molti tipi di adPNs sono trovati con un numero fisso di neuroni nel ALad1 lignaggio neurale, suggerendo che il numbeR e tipi di adPNs per il montaggio del sistema olfattivo sono strettamente regolati ¹² (si vedano le figure 2H, 4V, e 5 in Yu et al, 2010;. anche vedere Figura 3P - 3T).

Utilizzando tsMARCM di studiare con precisione le funzioni dei geni
Oltre alla nascita di datazione adPNs, tsMARCM è stata anche applicata per determinare la nascita di ordine di sei neuroni complessi centrali etichettati da GAL4-OK107. Questi sei neuroni costituiscono un piccolo sottoinsieme di neuroni nel LALv1 lineage neurale che contribuiscono alla circuiteria del complesso centrale Drosophila per controllare schemi motori intricati ^{2, 11} (vedi figura 4a e 4b in Yu et al., 2009). È interessante notare che ognuno di questi sei neuroni complesso centrale possiede una distinta morfologia neuronale ¹¹ (si veda la Figura 4d-4h e 4o in Yu et al., 2009). Tutti loro portano modelli assonale distinti nel tardoral lobo accessorio (LAL). I primi quattro neuroni distribuiscono loro dendriti di sotto-compartimenti della noduli, una sub-struttura del complesso centrale, mentre i rimanenti due neuroni proiettano loro dendriti al corpo ellissoidale, un'altra sub-struttura del complesso centrale. In particolare, il 3 ^° -Born complesso neurone centrale proietta i suoi dendriti ai noduli ventrali, con un modello compatto assonale nella LAL, mentre il 4 ^° -Born complesso neurone centrale distribuisce i suoi dendriti al noduli dorsale, con un vasto modello assonale in il LAL ¹¹ (vedere Figura 4f e 4g in Yu et al., 2009).

Oltre neuroni completo identificazione, la potenza di tsMARCM sarebbe meglio esemplificato studiando le funzioni del gene nei neuroni di interesse, in quanto il sistema tsMARCM permette una migliore fenotipica analisi, consentendo l'esame dei neuroni identici in diversi animali. Ad esempio, tsMARCM rileva un unico grasso temporalee cambiamento che richiede cronologicamente morfogenesi inadeguato (chinmo, una proteina nucleare dito BTB-zinco) nei neuroni complesso centrale del 3 ^° -Born ¹¹ (vedere Figura 4i, 4p, e 4w in Yu et al., 2009). Se la mutazione chinmo era stata caratterizzata nel sistema MARCM originale (cioè, singoli neuroni verdi marcato, senza l'etichettatura dei neuroni derivati dai lati associati celle gemelle come riferimento), il neurone chinmo -carente mostrati nella Figura 4i da Yu et al. 2009 sarebbe stato erroneamente identificato come il 4 ^° -Born, piuttosto che il 3 ^° -Born, neurone complesso centrale. Ciò avrebbe comportato l'errata interpretazione della funzione chinmo come il controllo di guida assonale piuttosto che specificare temporale destino ¹¹ (doppia freccia nella figura 4i da Yu et al., 2009). Tuttavia, utilizzando i lati magenta multi-cellulare-NB di cloni tsMARCM come esimoe di riferimento (tramite contando i numeri di cellulare in Figura 4m, 4n, e 4p da Yu et al. , 2009), il neurone chinmo -carente mostrato nella figura 4i da Yu et al. 2009) è stato dimostrato di essere neurone complesso centrale del 3 ^° -Born, che, pertanto, ha portato alla conclusione corretta che chinmo funzioni specifiche destino temporale per i neuroni complessi centrale ^11. Nel loro insieme, i risultati di cui sopra mettono in luce i vantaggi importanti del sistema tsMARCM per alta risoluzione analisi fenotipica, così accuratamente rivelare funzioni dei geni nei neuroni (o altri tipi di cellule, se del caso) per i futuri studi sullo sviluppo neurale (o gli studi di sviluppo di altri tessuti).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon dioxide (CO2)	Local vendor	n.a.	Anesthetize flies
CO2 pad	Local vendor	n.a.	Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (or other vendors)	PBS001	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fix fly brains
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody	Invitrogen	MCD0800	Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody	Clonetech	632496	Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent	Molecular Probes	S36936	Mount fly brains and protect quenching of fluorescence
PYREX 9 depression glass spot plate	Corning	7220-85	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments	SYLG184	Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	242276-250G	Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30	Dissect and mount fly brains
Micro slide	Corning	2948-75x25	Mount fly brains
Micro cover glass No. 1.5	VWR International	48366-205	Mount fly brains
Nail polish	Local vendor	not available	Seal micro cover glass on micro slides
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	culture flies at 25 °C
(or other vendors)
Water bath	Kansin Instruments	WB212-B2	Induce heat-shock in flies at 37 °C
(or other vendors)
Orbital shaker	Kansin Instruments	OS701	Wash and immunostain fly brains
(or other vendors)
Dissection microscope	Leica	EZ4	Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope	Zeiss (or other vendors)	LSM 700 (or other models)	Image tsMARCM clones
image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	not available	Project stacks of confocal images
image-processing software 2 (e.g., ImageJ)	not available	not available	Count cell number of tsMARCM clones