Summary
ここで、我々は、2つの異なる色で共通の前駆細胞由来の神経細胞の可視化を可能にモザイク標識技術のためのプロトコルを提示します。これは、出生付き合っ個々のニューロンを、異なる個体の同じ神経細胞に遺伝子機能を研究する能力を持つ神経系統解析を容易にします。
Abstract
Mは、r の epressible Cのエルのメートルの arker（MARCM）でnalysisをosaic広く複雑な形態を描写する、そうでなければマークされていないと非摂動内のニューロンのサブセットにおける遺伝子の機能を操作するために、ショウジョウバエの神経生物学の研究に適用されている正のモザイク標識システムです生物。 MARCMシステムで生成された遺伝的モザイクは、有糸分裂中にマーク（MARCMクローン）とマークされていない娘細胞の両方を生成する前駆細胞を分割内の相同染色体間の部位特異的組換えを介して媒介されます。ツインスポットMARCM（tsMARCM）と呼ばれるMARCM法の拡張は、2つの異なる色で共通の前駆細胞由来ツイン細胞の両方にラベルを付けます。この技術は、両方の半系統から有用な情報の検索を可能にするために開発されました。総合tsMARCMクローンの異なるペアを分析することによって、tsMARCMシステムは、高解像度の神経系統マッピンを可能Gは共通の前駆細胞から産生される標識されたニューロンの正確な出生順序を明らかにする。また、tsMARCMシステムは、異なる動物の同一ニューロンの表現型分析を可能にすることにより、遺伝子機能研究を拡張します。ここでは、 ショウジョウバエの神経発達の研究を促進するためにtsMARCMシステムを適用する方法を説明します。
Introduction
ニューロンの膨大な数と多様な種類からなる脳は、プロセスを知覚し、外界からのチャレンジに応答する能力を有する動物を付与します。成体ショウジョウバエ中央脳のニューロンは開発1,2中、神経芽細胞（NBS）と呼ばれる神経幹細胞の限られた数から導出されます。 ショウジョウバエでは、脳の神経新生に関与するのNBのほとんどは、（ニューロン3に分化する2つの娘細胞を生成するために部門の別のラウンドを通過した後、自己再生のNBと神経節母細胞（GMCS）、およびGMCSを生成するために、非対称分裂を起こし、図1A ）。そのため神経形態の複雑さや特定のニューロンを識別するに伴う課題の、正のモザイクラベリング技術、抑制性細胞マーカー（MARCM）とのモザイク解析は、visualizatを有効にするために発明されました単一ニューロンまたは周囲の、非標識ニューロン4の人口のうち、ニューロンの小さなサブセットのイオン。
MARCMはフリッパーゼ（FLP）の発現通常レポーター遺伝子4の発現を阻害するリプレッサー遺伝子のヘテロ接合性対立遺伝子を保有する分割前駆細胞内で相同染色体間の部位特異的組換えを媒介する/ FLP認識標的（FRT）システムを利用します。有糸分裂後、組換え染色体が1つのセルはリプレッサー遺伝子のホモ接合対立遺伝子を含まず、他のセルは全く抑制遺伝子-そのセル内のレポーターの発現（とその子孫）はもはやいないように、ツインセルに分離されています4を遮断しました 。三つのクローンのパターンFLPが確率的のNBまたはGMCSに誘導されるとき、通常MARCM実験で発見さ：単細胞resolutioで神経形態を示している単一セルおよび2セル-GMCクローン、nと、共通のNB（ 図1B）由来のニューロンの全体の形態学的なパターンを明らかに多細胞-NBクローン、。 MARCM技術が広く脳全体の配線ネットワークを再構成するための神経細胞タイプ識別を含め、 ショウジョウバエ神経生物学の研究に適用されている、神経系統は、ニューロン、細胞運命の仕様に関与する遺伝子の機能の表現型の特徴の発達史を開示するための分析、および神経細胞の形態形成分化研究5、6、7、8、9、10。従来MARCMのみ誘発される有糸分裂組換え事象の後に2つの娘細胞（および系統）のいずれかをラベルするので、マークされていない側からの潜在的に有用な情報が失われます。この制限は、基本的なMの適用を排除します高解像度にARCMシステムは、高速テンポで細胞の運命を切り替える多くの神経系統の解析や精度に異なる動物11、12の同一の神経細胞に遺伝子機能の解析します。
ツインスポットMARCM（tsMARCM）が（そのため、元のMARCMシステム11の限界を克服し、ツインセルの両側から有用な情報の回復を可能にする二つの異なる色で共通の前駆細胞に由来する神経細胞を標識する高度なシステムであり、 図2A - 2C）。 tsMARCMシステムでは、2つのRNA干渉（RNAi）は、抑制が前駆細胞中の相同染色体のトランスサイトに位置しているベース、及びそれらの抑制の発現は、独立して、それぞれのレポーター（ 図2B）の発現を阻害します。 FLP / FRT系を介して媒介部位特異的な有糸分裂組換えに続いて、TWなっOのRNAiベースの抑制は、異なるレポーター（ 図2B）の発現を可能にするために、ツインセルに分離しました。二つのクローンのパターンは、多細胞-NBクローンに関連付けられた単一細胞クローン及び2セル-GMCに関連付けられた単一細胞は、典型的にtsMARCM実験（ 図2C）に見られます。情報は、出生付き合っラベルされたニューロンなどの神経系統解析高解像度を可能にする、他の側面のための基準として利用することができるツインセルの一方の側に由来し、そして表現型は、正確な調査のために別の動物で同じニューロンの解析します神経遺伝子機能11、12。ここで、我々は（該当する場合だけでなく、他の組織の開発）、ショウジョウバエにおける神経発達の学業を広げるために、他の研究室で使用することができますtsMARCM実験を、実施方法を説明したステップバイステップのプロトコルを提示します。
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Protocol
1.必要なトランスジーン11、13を使用してtsMARCM対応ハエを構築
- 個々のハエ11によって運ばれた導入遺伝子からtsMARCM対応ハエの元のバージョンを生成します（ 表1参照）。同じフライ株式13で複数の導入遺伝子を置くことによって、以前に記載されている標準的なフライ遺伝的交叉スキームを実施しています。
- 1親系統では、FRT 40A、UAS-mCD8 :: GFP（第一のレポーター、mCD8 :: GFPの導入遺伝子を組み立て、導入遺伝子の発現が膜係留レポーターを生成する上流活性化配列プロモーターの制御下にありますラットクラスタoの発現に対するRNAiを、緑色蛍光タンパク質と融合させ分化8タンパク質）のマウスクラスター、およびUAS-rCD2RNAi（第二のレポーターの発現を抑制する抑制の2 番目の染色体の左腕にF分化2、RCD2）。場所 Xまたは3 番目の染色体上の組織特異的-GAL4ドライバ 、可能であれば。
- 他の親系統では、UAS-RCD2を FRT 40Aの導入遺伝子を組み立てる:: RFP（第二のレポーター、RCD2 :: RFP;赤色蛍光タンパク質と融合RCD2のタンパク質からなる他の膜係留レポーター）、およびUAS-GFPRNAi （mCD8 :: GFPの発現を抑制する抑制剤; GFPの発現に対するRNAi）2 番目の染色体の左腕に。可能な場合は、Xまたは3 番目の染色体上の熱ショック（HS）-FLPまたは組織specific- FLPを置きます 。
- 個々のハエ14によって運ばれた導入遺伝子からtsMARCM対応ハエの新バージョンを生成します（ 表1参照）。 Pが記載されている標準的なフライ遺伝交叉方式を行いますreviously、同じフライ株式13で複数の導入遺伝子を置くことによって。
- 1親系統では、同じ腕で一緒にFRT部位とUAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i（mCD8 :: GFPとRCD2の発現:: RFPを抑制するサプレッサーの組み合わせ導入遺伝子）の導入遺伝子を組み立てます2 番目または3 番目の染色体（FRTとUAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2iの導入遺伝子の適切なペアは、表1に示されています）。可能な場合、選択されたFRT部位の染色体以外の染色体上の組織特異的-GAL4ドライバーを置きます。
- 他の親系統では、同じ腕にFRT部位の導入遺伝子およびUAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi（RCD2の他の組み合わせ、導入遺伝子:: RFPとmCD8の発現を抑制するサプレッサー:: GFP）を構築FRTの導入遺伝子の2 番目または3 番目の染色体（適切なペアのUAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi）を 表1に示します。選択されたFRT部位の染色体以外の染色体上に置き、HS-FLPまたは組織特異的-FLP、可能であれば。
2.クロスtsMARCM対応はその子孫にtsMARCMクローンを生成するためのハエ
- クロスtsMARCM対応ハエ一緒には新鮮で、フライ食品のバイアル中で（ 例えば、処女雌が一緒にステップ1.1.2または1.2.2から飛ぶステップ1.1.1または1.2.1から10-15男性のハエを入れて、20〜30）バイアルの壁にメイド酵母ペースト。
- 受精卵を収集する前に、相手のチャンスを高めるために、2日間25℃で交差tsMARCM対応ハエを維持します。
- 頻繁に（ハエを下にタップするか、転送を容易にするために、ハエを麻酔するために二酸化炭素を使用混雑を避けるためにたてyeastedバイアルに交差tsMARCM対応ハエを転送;経由で10 mLのフライ食品にこれ以上80-100より受精卵を保ちますあまりにも多くの孵化した幼虫を回避するリットル）。
- 培養tsMARCM動物（ すなわち、受精卵、tsMARCM動物の遺伝子型の例を、 図3で使用される、HS-FLP [22]、w / wであり; UAS-mCD8 :: GFP、UAS-rCD2RNAi、FRT 40A 、GAL4-GH146 / UAS-RCD2 :: RFP、UAS-GFPRNAi、FRT 40A; +;それらが所望の段階（ 例えば、胚、幼虫に発展するまで25℃でシリアル転送バイアルに敷設されています+）、または蛹）。
- 生成するためにFLPの発現を誘導する熱ショックの最適な時間を決定するために、転送10を37℃の水浴に同じ発達段階にtsMARCM動物を含むバイアル、20、30、40、及び50分置き関心のtsMARCMクローン。この設定の理由は、以前に15に記載されている。組織specific- FLPは、神経系統解析のために（HS-FLPが好ましいtsMARCM実験で使用されている場合は、このステップをスキップ）。
注：関心のよりtsMARCMクローンが望まれている場合には、将来tsMARCM実験における熱ショックの最適な時間を使って繰り返し手順2.5。一般に、より多くのFLP発現は、HS-FLP [1]と同じ熱ショック時間のと比較して、HS-FLP [22]において誘導されます。 - 文化は、彼らが25℃で熱ショックを受けtsMARCM動物を適切な発達段階に達し、その後、ステップ3に進んできたまで。
tsMARCMクローンを含む3.準備し、ステイン、マウントフライブレインズ
- 鉗子保護料理を準備します。活性炭（0.25グラム）とシリコーンエラストマーキットのA部（30グラム）とパートB（3グラム）を混ぜます。適切な皿に混合物を注ぎます。
- 解剖顕微鏡を通して見た鉗子保護皿に鉗子を使用して、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でtsMARCM動物のうち、幼虫、さなぎ、または成体の脳を解剖。注：フライ脳の解剖のためのプロトコルは、DESCされています以前に16 ribed。
- 1×PBSで20分間室温で4％ホルムアルデヒドを含有するガラススポットプレート中のハエの脳を修正しました。手順の残りの部分については、このガラススポットプレートにハエの脳を処理します。
- PBTを削除し、：;洗っPBTを削除し、すぐに新しいPBTを追加します（すすぎ1％PBT（1％トリトンX-100を含む1×PBS）でハエの脳を3回洗浄し、1％のPBTで30分間ずつ、それらを3回洗浄新しいPBTを追加し、オービタルシェーカーを使用して新しいPBTでハエの脳を）インキュベートします。
- 4℃で一晩または室温で4時間、一次抗体の混合物とハエの脳をインキュベートします。 1％のPBTを含有する中、マウス抗Bruchpilot（BRP）抗体（1：50）、ウサギ抗DsRedの抗体（800 1）：一次抗体の混合物の例は、ラット抗CD8抗体（100 1）は5％正常ヤギ血清（NGS）。
- ハエの脳1％のPBTで三回すすぎ、次いで1％のPBT、30分ごとに、それらを3回洗浄します。
- ハエの脳1％のPBTで三回すすぎ、次いで1％のPBT、30分ごとに、それらを3回洗浄します。抗消光試薬とマイクロスライド上にマウントします。ハエの脳を覆って保護するために、マイクロスライド上にマイクロカバーガラスを置きます。明確なマニキュアを用いたマイクロカバーガラスとマイクロスライドの端をシールします。これらが搭載され、4℃で脳標本を飛ぶ密封して保管してください。
4.プロセスを取り、tsMARCMクローンの蛍光画像を分析
- tsMARCMクローンfrの蛍光画像をキャプチャ選択の共焦点顕微鏡システムを用いて、ステップ3.8で作成したサンプルをOM。
- 3E、3G - - 3J、3L - 3O、 と3Q -平坦化の例については、3T tsMARCM共焦点蛍光画像のプロジェクトスタック2次元には、（ 図3Bを参照してください選択した共焦点顕微鏡システムに付属の画像処理ソフトウェアを使用して画像を平坦化共焦点蛍光画像）。
- ImageJの17で適切な画像処理ソフトウェア（ 例えば、「セルカウンター」機能を使用してtsMARCMクローンの多細胞-NB側の細胞数をカウントし、 図3E、3J、3O、およびセルの例については、3Tを参照してください。ニューロンの遺体）。
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Representative Results
tsMARCMシステムは、共通のNBから誘導された神経細胞の重要な情報を検索することによって、神経系統解析および遺伝子機能の研究を容易にするために使用されてきました。このシステムは、神経細胞の種類（すべてではない）、ほとんどの識別各神経型の細胞数を決定し、にtsMARCMを使用してこれらのニューロンの出生順序11、12、18（詳細については、 議論のセクションを参照してくださいを確認するために使用されてきました）神経系統解析や遺伝子機能研究実施しています。ここでは、tsMARCM実験1、2を実施する方法を説明するための例として、GAL4-GH146で標識anterodorsal嗅覚投射ニューロン（ ショウジョウバエの嗅覚システムのALad1神経系統におけるadPNs）の4 tsMARCMクローンを使用しました。 FLPの発現は、胚の段階、SIで誘導した後ngle、45マゼンタadPNsに関連した緑色のVL2p adPNはtsMARCMクローン（ - 3E 図3A）で検出されました。 FLPは、他の三つの中で観察された異なる幼虫期、単一、緑adPNs（DL1 adPNまたはDC3 adPN）またはマゼンタadPNsの異なる数（31、21、または15）に関連付けられていない-GH146 + adPNsで、後に誘導された対照的に、 tsMARCMクローン（ 図3F - 3T）。 DL1-、DC3-と無GH146 + -adPNsの誕生に先立ってVL2p adPNsの誕生は、tsMARCMクローン（45、31、21のそれらに関連する多細胞-NB側にadPNsの細胞数を計数することによって決定しました。 図3E、3J、3O、それぞれ3T、）で15。細胞数をカウントすることに加えて、tsMARCMクローンの多細胞-NB側における軸索及び樹状突起パターンの複雑さは、それに関連する二セルGMC辺の相対出生順序を決定するために使用することができますtsMARCMクローン。 3D、3H - - 3I後期の発達段階で誘導モザイククローンが少ないニューロンが含まれているので、あまり複雑で、軸索と樹状突起のパターン（ 図3Cを持っているのに対し、早期の発達段階で誘導モザイククローンは、通常、より多くのニューロンが含まれているため、より複雑な軸索と樹状突起のパターンを持っています、3M - 3N、及び3R - 3S）。
図1：概略ショウジョウバエの神経新生のイラストやMARCM実験で見つかったクローンパターンの3種類。 （A） ショウジョウバエ中央脳のほとんどの神経系統における神経発生を説明するための模式図：神経芽細胞（NBS）は、自己再生のNBおよび神経節母細胞を（生成する非対称分裂を受けますGMCS）、およびGMCSは、2つの娘ニューロン（NS）を生成するために1より多くの時間を分割します。 （B）三クローンパターンがMARCM実験で観察される単一細胞クローン（A）、フリッパーゼ（FLP）をGMCSに誘導し、二セルGMCクローン（b）および多細胞-NBクローンされたときに（C ）、FLPはのNBに誘起されたとき。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：tsMARCMシステムの概略図。 （A）tsMARCM対応ハエ：1親のフライは、FRT部位とUAS-mCD8 :: GFP（第一のレポーター）、UAS-rCD2RNAi（第二のレポーターの発現を阻害する初めての抑制）、および組織の導入遺伝子が含まれています固有-GAL4;他の親のフライは、FRTが含まれています 、UAS-RCD2 :: RFP（第二のレポーター）、UAS-GFPRNAi（第一のレポーターの発現を阻害する第二の抑制）、およびHS-FLP。 （B）交差tsMARCM対応ハエの子孫で2のRNAiベースの抑制の存在は、（パネルBのG1およびG2期、 すなわち、mCD8 :: GFPとRCD2 :: RFP）レポーターの発現を阻害します。 FLPの発現は、熱ショックにより誘導され、そしてFLPはその後FLP認識標的（FRTS）に結合する分割前駆細胞内の相同染色体の部位特異的組換えを媒介します。これは、個別のレポーターの発現を可能にするために、有糸分裂後ツイン細胞におけるRNAiベースの抑制の分離をもたらします。単セルの単一細胞クローンに関連付けられた（a）のFLPがGMCSにおいて誘導される場合、2セルGMC、多細胞-NBクローンに関連付けられた：（C）2クローンパターンがtsMARCM実験において観察され（b）は、FLPはのNBにおいて誘導される場合。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：神経系統解析にtsMARCMの実験を行う方法の例としてadPNsの4 tsMARCMクローンを使用しました。 adPNsの四tsMARCMクローンは、それらの神経発生パターン（A、F、K、及びP）を示す図で、図示されています。横ホーン（LH; C、H、M、およびR）を示す全体的な脳（B、G、L、及びQ）の共焦点画像、触角葉（AL、D、I、N、およびS）とソーマ（E、J、O、及びT）そして、それらのニューロンの形態のパターン。シングルadPNs（VL2p、DL1、DC3、およびno-GH146 + adPNs;緑）tsMARCMクローンの多細胞-NB adPNs（マゼンタ）に関連付けられているが、胚でadPN NBで有糸分裂組換えを媒介するためにFLPの誘導によって誘導されました（A - E）と幼虫（F - T）のステージ。 adPNsは未知の理由については、 図3のマゼンタadPNsに関連した単一、緑adPN（のtsMARCMクローンになりALad1神経系統、中ヘミ系統の1、ALad1神経の他のヘミ系統からニューロンであることに注意してください系統ダイ）。 VL2p、DL1、DC3、およびno-GH146 + adPNsの出生順序は、破線内tsMARCMクローン（45、31、21、および15のマゼンタ多細胞-NB側にadPNsの細胞数を計数することによって決定しました。パネルE、Jのライン、O、及びT）。 tsMARCMクローンが早期に発達段階で誘導されたときに神経突起のパターンが（ 例えば、樹状パターンは、パネルI、N、およびSに比べてパネルEに、より複雑である）、マゼンタ多細胞-NB側に通常より複雑です。 tsMARCMは時々他の神経系統のニューロンが、同じGAL4ドライバにより標識されたときに混乱している分析（ 例えば、二重矢印で示す緑色のLHニューロンは、パネルBおよびCにおけるVL2p adPNsの軸索精緻化パターンの可視化を妨げます） 。 （青で表示）脳neuropilesはBruchpilot（BRP）に対する抗体で染色しました。ヒートショック時間：12分（パネルA - E）、15分（パネルF - J）、および35分（パネルK - T）。パネルBにおけるスケールバー-
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Discussion
プロトコル内の重要なステップ
1.1.1、1.2.1、2.3、2.5、および3.2は良いtsMARCM結果を得るために重要であるステップ。神経前駆細胞にGAL4を発現していない組織特異的-GAL4ドライバはステップ1.1.1および1.2.1のために好ましいです。ステップ2.3で、フライ食品のバイアル中で増殖させた動物を過剰混雑は避けてください。誘導待ち時間、熱ショック時にFLPの発現レベル、および神経前駆細胞（ すなわち、のNBとGMCS）の平均分割時間が知られていないので、それは熱ショック時間を変化させるために最善である（10、20、30ステップ2.5で同じ遺伝子型と発達段階の異なる試料について、40、および50分）。これは、関心のtsMARCMクローンの最高の比を得るために最適な熱ショック時間の決意を可能にします。また、無傷の脳試料を得るためにステップ3.2でハエの脳の解剖時に注意してください。これは、正確に神経細胞数を計数するために重要です。 RESEのため他の染色体腕上の遺伝子の機能を研究するためのtsMARCMを使用することに興味を持っている射手（ 例えば、2R、3L、及び3R）は、tsMARCM対応ハエは、FRTの導入遺伝子の適切なペアを選択することで、ステップ1.2のように実装してくださいUAS- mCD8.GFP.UAS-rCD2i、 および 表1に示されているUAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi、。 （ 例えば、HS-FLP [22]、ワット; UAS-RCD2 :: RFP、UAS-GFPRNAi、FRT 40A; +; +）また、女性のtsMARCM対応ハエはX染色体上のHS-FLPを運ぶことをお勧めします、その繰り返しtsMARCM実験を容易にします。
テクニックの修正、トラブルシューティング、および制限
RNAiの抑制とレポーターの効率とperduranceは、神経系統を分析し、遺伝子機能の研究は、正常tsMARCM実験で行うことができるかどうかの主要な決定因子です。一般的に、RNAiの抑制の低perduranceの組み合わせと一緒に有糸分裂後ニューロンにおけるRNAi抑制やレポーターの高発現と、神経前駆細胞由来の記者は、より良いtsMARCM結果を可能にします。 RNAiの抑制やレポーターの発現はGAL4ドライバによって制御されるため、研究者らは、神経前駆細胞に分化したニューロンにGAL4を表現ではなく、強いGAL4ドライバを選択する必要があります。例えば、GAL4-OK107はキノコ体（MB）前駆細胞およびその誘導体、MBのγ、α '/β'、およびα/βニューロン11、19にGAL4を表現する強力なGAL4ドライバです。 MBγニューロンの運命の女標識は2クローンのパターンで観察されている（ すなわち、多細胞-NBクローンに関連した単一細胞クローンおよび2セル-GMCに関連した単一細胞）GAL4-OK107がtsMARCM実験11に使用しました。興味深いことに、上記の問題は、MB247-GAL4、異なるMBのGAL4ドライバーを使用することによって解決することができますそれは、分化MBニューロン11にGAL4を発現します。
運転者が関心のあるニューロンで発現されていない場合、すべてではないGAL4ドライバー（ 例えば、MARCM、Q-MARCM、ツインスポット生成器）4、20、21 tsMARCMシステムまたは他のモザイクラベリングシステムで使用することができます。したがって、神経系統のためtsMARCMを使用する前には、GAL4ドライバはパンセルドライバでデュアル発現制御MARCMへの関心のニューロンの取材のためにテストする必要があり、分析（ 例えば、チューブリンプロモーターのLexA :: GAD）22 。私たちは、tsMARCMクローンは時々複雑な神経発現パターンとGAL4ドライバが使用されている場合は特に、明確に分析することができないことに注意してください（ 例えば、グリーン横ホーン（LH）ニューロンは、図3BにVL2p adPNの軸索精緻化パターンの明確な可視化を防止し、
既存の/代替方法に関して技術の意義
tsMARCMのほか、ツインスポット発電機と結合されたMARCMはまた、少なくとも理論的には、の可視化を可能にします二つの異なる色で共通の神経前駆細胞由来のニューロン（これら三つのモザイクラベリング技術の比較は、以前に15を提示されています）。ツインスポット発生器を組み立てるために必要な導入遺伝子の最小数、tsMARCMの元のバージョン（またはtsMARCMの新バージョン）、およびMARCMの結合は、それぞれ、4,8（または6）、および9です。しかし、tsMARCM 12、15、18、23を分析包括的な神経系統を実施するために使用されている唯一のシステムです。部位特異的組換えは、ツインスポット発電システムにおいて、非分裂細胞に発生し、これは、それが困難な中央の発達を研究するためにこのシステムを使用すること、同じセル内の2つのレポーターの共発現を導きます神経系15。対照的に、モザイククローンがtsMARCMで得られMARCMシステムAに結合します有糸分裂細胞に由来する再。結合されたMARCMシステムはQ-MARCMと従来MARCMシステム内の異なるレポーターの発現を制御するために2つの独立したドライバを必要とするため、二つの独立したドライバが忠実にない場合は、これは一般的な神経前駆細胞由来の神経細胞の標識化が懸念さ興味15の神経系統で同じニューロンを標識します。
テクニックをマスターした後、将来のアプリケーションや行き方
高解像度の神経系統解析を行うためにtsMARCMを使用しました
82ニューロンの合計で、体系的tsMARCMのadPNsのクローン、adPNsの40種類を分析するために、図3に使用されるアプローチを適用することにより、以前の研究12で同定されました。 adPNsのこれら40種類のうち、35は、単糸球体adPNs REL、（ すなわち、触角葉（AL）内の単一の糸球体を支配）でしたAY ショウジョウバエの脳12の他の地域への嗅覚情報（参照 ゆうら 。、2010）内の数値2-4。 adPNsの他の5種類がALから嗅覚情報を統合し、嗅覚システム12に機能的な複雑さのレベルを追加提供することができるポリ糸球体adPNs（ すなわち、ALで複数の糸球体を支配）であった（図3E-3Hを参照してくださいゆうで4Z ら 、2010）。幼虫生まれadPNsが特異性と冗長性の間の相互作用は、嗅覚系12に存在することを示唆している、タイプごとに複数のニューロンによって表されているのに対し、胚生まれadPNsは、タイプごとに1つだけのニューロンを持っている（ゆうらの数値2-4を参照してください。、 2010）。興味深いことに、特定の発生ウィンドウ内で生成ニューロンが死ぬ運命にある、とadPNsの多くの種類がnumbeことを示唆し、ALad1神経系統におけるニューロンの一定の数で発見されました嗅覚系を組み立てるためのrとadPNsの種類は厳密に調節されている12（中Yu ら 、2010図2H、4V、および5を参照してください;。また、 図3Pを参照してください。 - 3Tを ）。
正確に遺伝子機能を研究するためにtsMARCMを使用しました
出生デートadPNsのほか、tsMARCMもGAL4-OK107によって標識6中心複合体のニューロンの出生順序を決定するために適用されています。これらの6つのニューロンは（ゆうらに図4aおよび図4bを参照してください。、2009）複雑な運動パターン2、11を制御するために、 ショウジョウバエ中心複合体の回路に貢献LALv1神経系統内のニューロンの小さなサブセットを構成しています。興味深いことに、これらの6つの中央の複雑な神経細胞のそれぞれは、（ らゆうに図4d-4Hおよび40を参照してください。、2009）の異なるニューロンの形態11を有しています。それらのすべては、後半に明確な軸索のパターンを運びますRALアクセサリーローブ（LAL）。残りの2つのニューロンは、楕円体、中心複合体の他のサブ構造に彼らの樹状突起を投影するのに対し、最初の4つのニューロンは、nodulusの複数形、中心複合体のサブ構造のサブ区画にその樹状突起を配布します。 4 番目 〜生まれの中心複合体ニューロンは背側nodulusの複数形への樹状突起を分配するのに対し、具体的には、 第3〜生まれの中心複合体ニューロンが広い軸索パターンで、LALでコンパクトな軸索のパターンで、腹側nodulusの複数形への樹状突起を投影しますLAL 11（ らゆうに図4Fおよび4Gを参照してください。、2009）。
tsMARCMシステムは、異なる動物において同一ニューロンの検査を可能にすることによって分析し、より良い表現型を可能にするため、総合的に識別ニューロンを越えて、tsMARCMのパワーは、関心の神経細胞における遺伝子機能を研究することによって、より良い例示でしょう。例えば、tsMARCMは、単一の時間的脂肪を検出します中央の複雑なニューロン11（図4I、4P、およびYu ら。、2009年の4ワットを参照してください）〜生まれの3 回目で時系列的に不適切な形態形成（chinmo、BTB-ジンクフィンガー核タンパク質）を必要とする電子チェンジ。 chinmo変異は、元MARCMシステムを特徴としていた場合（ すなわち、単一の緑色標識ニューロンは、基準とツインセルの関連する側面由来の神経細胞を標識することなく）、chinmo欠損ニューロンから図4Iに示しますYu ら。 2009年は第 4〜生まれのではなく、 第3〜生まれの、中央の複雑なニューロンと誤認されていたであろう。これは、軸索ガイダンスを制御するのではなく、時間的運命11指定などchinmo機能の誤解をもたらしたであろう（ゆうから図4Iに二重矢印ら。、2009）。しかし、目のようtsMARCMクローンのマゼンタ多細胞-NBの側面を使用して、における細胞数を計数するビアE参照（ 図4メートル、4N、およびYu らから4P。 、2009）、Yu らから図4Iに示すchinmo欠損ニューロン。 、2009）は、したがって、中心複合体ニューロン11のための一時的な運命仕様で機能をchinmo正しいという結論に至った中央複雑なニューロン、〜生まれの3 番目であることが証明されました。まとめると、上記の結果は、今後の神経発達研究のための高解像度（該当する場合、または他の種類の細胞）の表現型は、それによって正確に神経細胞に遺伝子機能を開示、分析するためのtsMARCMシステムの重要な利点（または他の発達の研究を強調表示しました組織）。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、科学技術省（MOST 104から2311-B-001から034）と、セルラおよび有機体生物学研究所、中央研究院、台湾によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon dioxide (CO2) | Local vendor | n.a. | Anesthetize flies |
| CO2 pad | Local vendor | n.a. | Sort, cross and transfer flies |
| 10x PBS pH 7.4 | Uniregion Bio-Tech (or other vendors) | PBS001 | Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | Fix fly brains |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Rinse, wash and immunostain fly brains |
| Normal goat | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Immunostain fly brains |
| serum | |||
| Rat anti-mouse CD8 antibody | Invitrogen | MCD0800 | Immunostain fly brains |
| Rabbit anti-DsRed antibody | Clonetech | 632496 | Immunostain fly brains |
| Mouse anti-Brp antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Immunostain fly brains |
| Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11006 | Immunostain fly brains |
| Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | Immunostain fly brains |
| Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Immunostain fly brains |
| SlowFade gold antifade reagent | Molecular Probes | S36936 | Mount fly brains and protect quenching of fluorescence |
| PYREX 9 depression glass spot plate | Corning | 7220-85 | Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | 242276-250G | Make black Sylgard dishes |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Dissect and mount fly brains |
| Micro slide | Corning | 2948-75x25 | Mount fly brains |
| Micro cover glass No. 1.5 | VWR International | 48366-205 | Mount fly brains |
| Nail polish | Local vendor | not available | Seal micro cover glass on micro slides |
| Incubator | Kansin Instruments | LTI603 | culture flies at 25 °C |
| (or other vendors) | |||
| Water bath | Kansin Instruments | WB212-B2 | Induce heat-shock in flies at 37 °C |
| (or other vendors) | |||
| Orbital shaker | Kansin Instruments | OS701 | Wash and immunostain fly brains |
| (or other vendors) | |||
| Dissection microscope | Leica | EZ4 | Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains |
| Confocal microscope | Zeiss (or other vendors) | LSM 700 (or other models) | Image tsMARCM clones |
| image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser) |
Zeiss | not available | Project stacks of confocal images |
| image-processing software 2 (e.g., ImageJ) |
not available | not available | Count cell number of tsMARCM clones |
References
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