Summary
여기서 우리는 두 가지 색상으로 일반 전구 세포에서 파생 된 신경 세포의 시각화를 허용하는 모자이크 라벨 기술에 대한 프로토콜을 제시한다. 이것은 다른 사람의 동일한 뉴런에서 출생 데이트 개별 뉴런의 기능과 공부 유전자 기능과 신경 계통 분석을 용이하게한다.
Abstract
M은 R의 epressible C의 엘 m 개의 arker와 nalysis (MARCM) 널리 복잡 모폴로지를 도시하고, 그렇지 않으면 표시되지 않은 및 교란 내 뉴런의 서브 세트에서 유전자의 기능을 조작하는 초파리 신경 생물학적 연구에 적용되어 포지티브 모자이크 표시 시스템이다 osaic 생물. MARCM 시스템에서 발생하는 유전 모자이크는 유사 분열하는 동안 모두 표시 (MARCM 클론) 및 표시되지 않은 딸 세포를 생성하는 전구 세포를 분할 내에서 상동 염색체 사이의 부위 특이 적 재조합을 통해 매개된다. MARCM 방법의 확장이라는 쌍둥이 자리 MARCM (tsMARCM)는, 두 가지 색상으로 공통 조상에서 유래 쌍둥이 세포의 두 레이블. 이 기술은 모두 헤미 계통에서 유용한 정보의 검색을 가능하게하기 위해 개발되었다. 종합적 tsMARCM 클론의 다른 쌍을 분석함으로써, tsMARCM 시스템은 고해상도 신경 계통 mappin 허용g는 일반 전구 세포에서 생성 된 레이블 뉴런의 정확한 출생 순서를 공개합니다. 또한, tsMARCM 시스템은 또한 다른 동물 동일한 뉴런 표현형 분석을 허용하여 유전자 기능 연구를 확장한다. 여기, 우리는 초파리에서 신경 발달의 연구를 용이하게하기 위해 tsMARCM 시스템을 적용하는 방법에 대해 설명합니다.
Introduction
방대한 수의 뉴런 다양한 형태로 구성 뇌가, 지각 처리와 외부 세계로부터의 도전에 대응하는 능력을 동물 부여한다. 성인 초파리 중앙 뇌의 신경 세포는 신경 줄기 세포의 수가 제한으로부터 유도되는 현상 (1, 2) 동안 호출 neuroblasts (NBS). 새로운 기지국이 초파리의 뇌 신경에 참여하는 대부분의 자기 갱신 NBS 및 신경절 어머니 세포 (GMCs)를 생성하는 비대칭 분열을 받아야하고, GMCs는 (그림 1A를 신경 세포 3로 분화 두 개의 딸 세포를 생산하는 부문의 또 다른 라운드 통과 ). 때문에 신경 형태의 복잡함과 특정 신경 세포, 긍정적 인 모자이크 레이블 기술하는 repressible 세포 마커 (MARCM) 모자이크 분석을 식별과 관련된 문제의의 visualizat 수 있도록 발명되었다하나의 신경 세포 또는 주변, 레이블이없는 뉴런 (4)의 인구 중 신경 세포의 작은 부분 집합의 이온.
MARCM는 flippase (FLP) 식 일반적으로 리포터 유전자 4의 발현을 억제하는 리프레 서 유전자의 이형 접합 대립 유전자를 운반하는 분할 전구 세포 내에서 상동 염색체 사이의 부위 특이 적 재조합을 중재하기 / FLP 인식 대상 (FRT) 시스템을 사용합니다. 유사 분열 분할 한 후, 재조합 염색체가 더 이상없는 하나의 셀은 동형 접합 리프레 유전자의 대립 유전자와 다른 세포가 더 리프레 서 유전자 - 더 그 셀 (및 그 자손)에 기자의 발현이 없습니다를 포함하도록, 트윈 세포로 분리된다 (4)를 차단했습니다. FLP가 확률 적 NBS 또는 GMCs 유도 할 때 세 가지 클론 패턴은 일반적으로 MARCM 실험에서 발견된다 : 단일 셀 resolutio에서 신경 세포의 형태를 묘사 단일 셀 및 2 셀 - GMC 클론을,일반적인 NB (그림 1B)에서 파생 된 신경 세포의 전체 형태 학적 패턴을 보여 n 및 다세포-NB 클론. MARCM 기술이 널리 뇌 전체의 배선 네트워크를 재구성 신경 유형 식별을 포함하여, 초파리 신경 생물학적 연구에 적용되어, 신경 계통은 신경 세포 운명 사양에 관여하는 유전자의 기능 표현형 특성의 개발 역사를 공개에 대해 분석하고, 신경 세포의 형태 형성 분화는 5, 6, 7, 8, 9, 10 연구. 종래 MARCM 만 유도 분열 재조합 이벤트 이후 개의 딸세포 (및 계통) 중 한 라벨 때문에, 표시되지 않은 측면에서 잠재적으로 유용한 정보가 손실된다. 이 제한은 기본 M의 적용을 배제고해상도로 ARCM 시스템은 빠른 템포 세포 운명 전환 많은 신경 계통 분석 또는 다른 동물 정밀도 11, 12의 동일한 뉴런 유전자 기능 분석한다.
트윈 스폿 MARCM (tsMARCM)는 이렇게 원래 MARCM 시스템 (11)의 한계 (극복 트윈 셀의 양측에서 유용한 정보의 회복을 가능하게 두 개의 별개의 색상이 공통 조상으로부터 유래 신경 라벨 고급 시스템이다 그림 2A - 2C). tsMARCM 시스템에서, 두 개의 RNA 간섭 (RNAi) 억제제는 전구 세포 내에서 상동 염색체의 트랜스 위치에 놓인다 기반, 이러한 억제제의 발현이 독립적으로 각각의 기자 (도 2B)의 발현을 억제한다. FLP / FRT 시스템을 통해 매개되는 부위 특이 적 분열 재결합 후, TWO가 RNAi를 기반 억제 별개 기자 (도 2B)의 발현을 허용하는 트윈 세포로 분리. 두 클론 패턴 다세포-NB 클론과 연관된 단일 세포 클론과 두 셀 GMC와 연관된 단일 셀은 전형적 tsMARCM 실험 (도 2c)에서 볼 수있다. 정보는 출생 데이트 표지 뉴런 신경 혈통 분석 고해상도를 가능 타측에 대한 기준으로서 이용 될 수있는 트윈 셀의 한쪽에서 유래하고, 표현형은 정확한 조사 다른 동물에서 동일 뉴런 분석 신경 유전자 기능 (11), (12). 여기서, 우리는 (가능한 경우뿐만 아니라, 다른 조직의 발달) 초파리 신경 발달 공부 범위를 확장하기 위해 다른 실험실에서 사용될 수있는 tsMARCM 실험을 수행하는 방법을 설명하는 단계별 프로토콜을 제시한다.
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Protocol
1. 필수 유전자 (11), (13)를 사용하여 tsMARCM 준비 파리 구축
- 개별 플라이 (11)에 의해 수행되는 유전자로부터 tsMARCM 준비 파리의 원래 버전을 생성 (표 1 참조). 같은 비행 주식 13에서 여러 유전자를 넣어, 이전에 설명 된 표준 비행 유전자 교차 제도를 실시한다.
- 한 부모의 라인에서, FRT 40A, UAS-mCD8 :: GFP (첫 번째 기자, mCD8 :: GFP의 유전자를 조립, 형질 전환 유전자의 발현이 막 닿는 기자를 생산하는 업스트림 활성화 시퀀스 프로모터의 제어하에 쥐 클러스터 (O)의 발현에 대하여 RNAi에, 녹색 형광 단백질을 융합 단백질의 분화 8 마우스 클러스터)와 UAS-rCD2RNAi (제 리포터의 발현을 억제 레서의F 차별화 2, rcd2) 2 차 염색체의 왼쪽 팔에. 장소 조직 특이 가능한 경우 X 또는 3 번째 염색체에 -GAL4 드라이버.
- 다른 부모의 라인에서, FRT 40A, UAS-rCD2 :: RFP의 유전자 조립 (제 기자, rCD2 :: RFP를, 다른 막 닿는 기자가 적색 형광 단백질 융합 rCD2 단백질로 구성)와 UAS-GFPRNAi (mCD8 :: GFP의 발현을 억제 억압, GFP의 발현에 대한 RNAi의) 2 차 염색체의 왼쪽 팔에. 는 X 또는 제 3 염색체 가능한 경우에 열 충격 (HS) -FLP 또는 조직 특정 - FLP를 놓습니다.
- 개별 파리 (14)에 의해 수행되는 유전자에서 tsMARCM 준비 파리의 새 버전을 생성 (표 1 참조). P는 설명 된 표준 비행 유전자 교차 제도를 실시reviously, 동일한 플라이 주식 13에서 여러 유전자를 넣어.
- 한 부모 행에서 같은 팔에 함께 FRT 사이트와 UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (mCD8 :: GFP 및 rCD2의 발현 :: RFP를 억제하는 서프 레서의 결합 된 유전자)의 유전자를 조립 2 차 또는 3 차 염색체 (FRT와 UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i의 유전자들의 적절한 쌍이 표 1에 나타내었다). 가능하면, 선택한 FRT 사이트의 염색체 이외의 다른 염색체에 조직 특이-GAL4 드라이버를 놓습니다.
- 다른 부모의 라인에서, FRT 사이트와 UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (다른 결합 rCD2의 유전자 :: RFP 및 mCD8 :: GFP의 발현 억제 서프 레서) 같은 팔을의 유전자를 조립 FRT의 도입 유전자의 2 차 또는 3 차 염색체 (적절한 쌍 UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi)은 표 1에 표시됩니다. 장소 HS-FLP 또는 가능하면, 선택한 FRT 사이트의 염색체 이외의 다른 염색체에 조직 특이-FLP.
2. 크로스 tsMARCM 준비는 그들의 자손에 tsMARCM 클론을 생성 (으)로 운항하는 항공사
- 함께 간 tsMARCM 준비 파리 신선한와 플라이 식품 유리 병에 (예를 들어, 함께 단계 1.1.2 또는 1.2.2에서 날아 단계 1.1.1 또는 1.2.1 및 20 ~ 30 버진 여성에서 10 ~ 15 남성 파리를 넣어) 유리 병의 벽에 - 만든 효모 붙여 넣기.
- 수정 된 알을 수집하기 전에 상대의 기회를 향상시키기 위해 2 일 동안 25 ° C에서 넘어 tsMARCM 준비 파리를 유지한다.
- 자주 전송을 용이하게하기 위해 (군집 피 파리를 누르거나 파리를 마취하는 이산화탄소를 사용하는 갓 yeasted 유리 병에 넘어 tsMARCM 준비 파리를 전송;를 통해 10 mL의 플라이 식품에 80-100 수정란보다 더 이상 유지하지난) 너무 많은 부화 유충을 방지 할 수 있습니다.
- 문화 tsMARCM 동물 (즉, 수정란, tsMARCM 동물의 유전자형의 예를 들어, 그림 3에서 사용이며, HS-FLP [22], w / w, UAS-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT (40A) , GAL4-GH146 / UAS-rCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT 40A, + 그들은 원하는 단계 (예를 들어, 배아, 유충에 개발 될 때까지 25 ° C에서 직렬로 전송 유리 병에 배치 된 +), 또는 번데기).
- 를 생성 FLP의 발현을 유도하는 열 충격을 최적의 시간을 결정하기 위해 전송 (10) 37 °의 C 수조, 20, 30, 40와 동일한 발달 단계에서 tsMARCM 동물을 포함 바이알에서 50 분간 배치 관심 tsMARCM 클론. 조직 특정 - FLP는 tsMARCM 실험에 사용하는 경우이 단계를 건너 뜁니다 (HS-FLP는 신경 계통에 대한 선호 분석,이 설정에 대한 이유는 이전에 15 설명 하였다).
참고 : 관심이 더 tsMARCM 클론이 원하는 경우 향후 tsMARCM 실험에서 열 충격의 최적의 시간을 사용하여 단계를 반복 2.5; 일반적으로, 더 FLP 표현이 비교에서 HS-FLP [22] 유도 HS-FLP [1] 같은 열 충격 시간. - 문화는 25 ° C에서 열 충격 tsMARCM 동물을 적절한 발달 단계에 도달 한 다음 3 단계로 진행 될 때까지.
3. 얼룩을 준비하고 마운트 플라이 두뇌는 tsMARCM 클론을 포함하는
- 집게 보호 요리를 준비합니다. 파트 A (30g) 및 활성탄 (0.25 g)와 실리콘 엘라스토머 키트의 부품 B (3 g)을 섞는다. 해당 요리에 혼합물을 부어.
- 해부 현미경을 통해 볼 집게 보호 접시에 집게를 사용 1X 인산 완충 식염수에 tsMARCM 동물 (PBS) 중 애벌레, 번데기, 또는 성인의 뇌를 해부하다. 참고 : 플라이 뇌 해부를위한 프로토콜은 내림차순하고있다이전 16 ribed.
- 1X PBS을 실온에서 20 분간 4 % 포름 알데히드를 함유하는 유리 스폿 접시 플라이 머리를 고정한다. 단계의 나머지 부분이 유리 자리 접시에 플라이 뇌를 처리합니다.
- 제거 PBT :; 세척 PBT를 제거하고 신속하게 새로운 PBT를 추가 플라이 뇌를 1 % PBT (1X PBS 1 % 트리톤 X-100 포함) 및 1 % PBT (씻어 30 분 동안 그들에게 각각 세 번 씻어로 3 회 씻어 새로운 PBT를 추가하고, 궤도 쉐이커를 사용하여 새 PBT에서 플라이 두뇌)를 품어.
- 밤새 4 ℃ 또는 실온에서 4 시간 동안 일차 항체의 혼합물 플라이 뇌 인큐베이션. 포함하고, 마우스 항 Bruchpilot (BRP) 항체 (1시 50분) 1 % PBT에서 : 토끼 항을 DsRed 항체 (800 1) 일차 항체의 혼합물의 예는 쥐 항 CD8 항체 (1 : 100) 인 5 % 정상 염소 혈청 (NGS).
- 플라이 두뇌 1 %의 PBT로 3 회 씻어, 다음 1 % PBT와 30 분마다 그들에게 세 번 씻는다.
- 플라이 두뇌 1 %의 PBT로 3 회 씻어, 다음 1 % PBT와 30 분마다 그들에게 세 번 씻는다. 반 담금질 시약 마이크로 슬라이드를 탑재합니다. 플라이 머리를 커버하고 보호하기 위해 마이크로 슬라이드에 마이크로 커버 유리를 넣습니다. 투명한 매니큐어를 사용하여 마이크로 커버 유리 마이크로 슬라이드의 가장자리를 밀봉. 이러한 장착하고 4 ℃에서 뇌 표본을 비행 밀봉 보관하십시오.
4. 프로세스를 가지고, 그리고 tsMARCM 클론의 형광 이미지 분석
- tsMARCM 클론의 FR의 형광 이미지를 캡처OM 샘플을 원하는 초점 현미경 시스템을 이용하여 단계 380에서 생성.
- 두 차원에 tsMARCM 공 초점 형광 이미지의 프로젝트 스택은, 선택의 공 초점 현미경 시스템과 함께 제공되는 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 평평 (그림 3B 참조 - 평평의 예 3T - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O, 3 분기를 공 초점 형광 이미지).
- 적절한 화상 처리 소프트웨어 (ImageJ에 17 예, "셀 카운터"기능을 이용하여 tsMARCM 클론의 다세포-NB 측의 세포 수를 세어 상기 셀의 예는도 3e, 3J, 3O 및 3T 참조 신경 세포의 시체).
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Representative Results
tsMARCM 시스템은 공통 NBS 유래의 신경 세포에 대한 중요한 정보를 입수하여 신경 혈통 분석하여 유전자 기능 연구를 용이하게하기 위해 사용되어왔다. 이 시스템은 신경 세포의 종류 (모든 경우) 대부분을 식별 각각의 신경 세포 유형의 세포 수를 결정하고,에 tsMARCM를 사용하여 이러한 신경 세포의 출생 순서 11, 12, 18 (자세한 내용은 토론 섹션을 참조를 확인하는 데 사용되었습니다 신경 계통을 실시하는 것은) 분석이나 유전자 기능 연구. 여기, 우리는 tsMARCM 실험 1, 2를 수행하는 방법을 설명하기 위해 예로서 GAL4-GH146으로 표시 anterodorsal 후각 투사 뉴런 (초파리의 후각 시스템의 ALad1 신경 계통에 adPNs)의 네 tsMARCM 클론을 사용했다. FLP 표현은 배아 단계하는시에서 유도 한 후45 마젠타 adPNs과 관련된 ngle, 녹색 VL2p adPN는 tsMARCM 클론 (- 3E도 3a)에서 검출되었다. FLP가 다른 세에서 관찰되었다 다른 애벌레 단계, 하나, 녹색 adPNs (DL1 adPN 또는 DC3 adPN) 또는 마젠타 adPNs 다른 수의 (31, 21, 15)과 관련된 노 GH146 + adPNs에서, 나중에 유도 반면에 tsMARCM 클론 (그림 3 층 - 3T). DL1-, DC3-없이-GH146 + -adPNs의 탄생 이전에 VL2p adPNs의 탄생은 tsMARCM 클론 (45, 31, 21의 관련 다세포-NB 측면에서 adPNs의 세포 수를 계산하여 결정 하였다 및도 15는 각각도 3E, 3J, 3O 및 3T에서). tsMARCM 클론의 다세포-NB 측의 셀 번호, 축삭의 복잡성 및 돌기 패턴 카운트 이외에 그들의 연관된 두 셀 GMC 측의 상대 탄생 순서를 결정하기 위해 사용될 수있다tsMARCM 클론. 초기 개발 단계에서 유도 된 모자이크 클론은 일반적으로 더 많은 뉴런을 포함 늦게 발달 단계에서 유도 모자이크 클론 적은 수의 신경 세포가 포함되어있어 덜 복잡 축삭과 수상 돌기 패턴 (그림 3C있는 반면, 따라서 더 복잡한 축삭과 수상 돌기 패턴이 - 3D, 3H를 - 3I를 , 3M - 3N 및 3R - 3S).
그림 1 : 도식 초파리 신경의 그림과 MARCM 실험에서 발견 된 클론 패턴의 세 가지 유형. (A) 중부 초파리 뇌의 대부분의 신경 계통의 개략도 나타내는 신경 : neuroblasts (NBS)은 자기 갱신 NBS 및 신경절 모 세포 (생성하는 비대칭 분열을 거쳐GMCs), 그리고 GMCs 두 딸 뉴런 NS ()를 생산하는 일에 더 많은 시간을 나눕니다. (B) 세 클론 패턴이 MARCM 실험에서 관찰된다 : 단일 세포 클론 (A), flippase (FLP)을 GMCs 유도되고, 두 셀 GMC 클론 (b) 및 다중 셀룰러 NB 클론 (c ), FLP가 NBS에서 유도되는 경우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : tsMARCM 시스템의 개략도. (A) tsMARCM 준비 파리 : 한 부모의 비행은 FRT 사이트와 UAS-mCD8 :: GFP (첫 번째 기자), UAS-rCD2RNAi (제 기자의 발현을 억제하는 최초의 억제)하고, 조직의 유전자를 포함 -GAL4 - 특정; 다른 부모의 비행은 FRT를 포함 UAS-rCD2 :: RFP (제 기자), UAS-GFPRNAi (첫 번째 기자의 발현을 억제하는 두 번째 회로) 및 HS-FLP. (B)를 넘어 tsMARCM 준비 파리의 자손에서 두 RNAi의 기반 억제제의 존재는 기자들 (즉, mCD8 :: GFP 및 rCD2 :: 패널 B의 G1과 G2 단계에서 RFP)의 발현을 억제한다. FLP의 발현은 열 쇼크에 의해 유도되고, FLP는 FLP 인식 대상 (FRTS)에 결합시 분할 전구 세포 내에서 상동 염색체 부위 특이 적 재조합을 매개한다. 이것은 별개의 리포터의 발현을 허용하는 유사 분열 분할 후 트윈 세포에서 RNAi를 억제 계의 편석을 초래한다. (C)는 두 개의 클론 패턴은 tsMARCM 실험에서 관찰된다 : 단일 세포 클론과 연관된 단일 셀 (a) FLP는 GMCs 유도 한 경우 다세포-NB 클론과 연관된 두 셀 GMC,(b)는 FLP NBS에서 유도되는 경우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 신경 계통 분석에 tsMARCM 실험을 수행하는 방법에 대한 예로서 adPNs 네 tsMARCM 클론을 사용. adPNs 네 tsMARCM 클론은 신경 패턴 (A, F, K, 및 P)의 도면으로 도시되어있다; 전체 뇌의 공 초점 화상 (B, G, L 및 Q), 횡 혼 도시 (LH, C, H, M 및 R)은 더듬이 로브 (AL, D, I, N, 및 S)를하고 소마(E, J, O, 및 T); 그들의 신경 형태학의 패턴입니다. 단일 adPNs (VL2p, DL1, DC3 및 노 GH146 + adPNs, 녹색)이 tsMARCM 클론의 다세포-NB adPNs (마젠타)과 관련이 배아에서 adPN NB에서 유사 분열 재조합을 중재하기 위해 FLP의 유도에 의해 도출 된 (A - E)와 애벌레 (F - T) 단계. adPNs가 ALad1의 신경의 다른 헤미 혈통에서 마젠타 알 수없는 이유로 그림 3 adPNs (뉴런과 관련된 하나의 녹색 adPN의 tsMARCM 클론 초래 ALad1 신경 계통에있는 헤미 계통 중 하나 있습니다 계보 다이). VL2p, DL1, DC3 및 노 GH146 + adPNs의 출생 순서는 점선 내 tsMARCM 클론 (45, 31, 21의 마젠타 다세포-NB 측면에서 adPNs의 세포 수를 계산에 의해 결정, 15되었다 패널 E, J 라인, O, 및 T). 신경 돌기 패턴 일반적 tsMARCM 클론은 초기 발달 단계에서 유도 될 때, 마젠타 다세포-NB 측면에서 더 복잡하다 (예를 들면, 돌기 패턴은 패널 I, N, 및 S에 비해 패널 E 더 복잡한이다). tsMARCM 때때로 다른 신경 계통의 뉴런이 같은 GAL4 드라이버가 표시 될 때 혼동 분석 (예를 들어, 두 번 화살표로 표시된 녹색 LH 뉴런은, 패널 B와 C의 VL2p adPNs의 축삭 정교 패턴의 시각화를 방해) . (파란색으로 표시) 뇌 neuropiles는 Bruchpilot (BRP)에 대한 항체로 염색 하였다. 열 충격 시간 : 12 분 (패널 A - E), 15 분 (패널 F - J), 35 분 (패널 K - T). 패널 B의 스케일 바 -
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Discussion
프로토콜 내에서 중요한 단계
2.5, 2.3, 1.2.1, 1.1.1 단계, 3.2 좋은 tsMARCM 결과를 얻기위한 중요합니다. 신경 전구 세포에서 GAL4을 표현하지 않는 조직 별 -GAL4 드라이버 단계 1.1.1과 1.2.1 바람직하다. 단계 2.3에서 플라이 식품 유리 병에서 자란 동물을 과도하게 몰려 마십시오. 유도 지연, 열충격시 FLP의 발현 수준 및 신경 전구 세포 (즉, 새로운 기지국과 GMCs)의 평균 분할 시간이 알려져 있지 않기 때문에, 상기 열충격 시간을 변경하는 것이 최상이다 (10, 20, 30 단계 250에서 동일한 유전자형 및 발달 단계의 상이한 샘플에 대해, 40, 50 분). 이것은 관심 tsMARCM 클론의 최고 비를 얻기 위해 최적의 열 쇼크 시간의 결정을 허용한다. 또한, 그대로 뇌 샘플을 얻기 위해 단계 3.2 플라이 뇌 해부하는 동안주의; 이 정확하게 신경 세포 수를 계수 중요하다. rese에 대한(예를 들어, 2R은, 3L 및 3R), tsMARCM 준비 파리는 FRT, UAS-의 도입 유전자의 적절한 쌍을 선택하여 단계 1.2에서와 같이 조립해야 다른 염색체 팔에 유전자의 기능을 연구하기위한 tsMARCM를 사용에 관심이있는 궁수 mCD8.GFP.UAS-rCD2i, 표 1에 나타내 UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi. 우리는 또한 여성 tsMARCM 준비 파리는 X 염색체 (; UAS-rCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT 40A, +, 예를 들어, HS-FLP [22], w +)에 HS-FLP를 수행하는 것이 좋습니다되는 반복 tsMARCM 실험을 용이하게한다.
기술의 수정, 문제 해결 및 제한 사항
RNAi의 억제 및 리포터의 효율성과 perdurance 신경 혈통 분석 및 유전자 기능 연구를 성공적 tsMARCM 실험을 수행 할 수 있는지 여부에 대한 중요한 결정 인자이다. 일반적으로, RNAi의 진압 낮은 perdurance의 조합함께 포스트 유사 분열 신경 세포에서 RNAi의 진압과 기자의 높은 발현과, 신경 전구 세포에서 파생 된 기자들은 더 나은 tsMARCM 결과를 허용합니다. RNAi의 진압과 기자의 발현이 GAL4 드라이버에 의해 제어되기 때문에, 연구자들은 신경 전구 세포에서 분화 된 신경 세포에서 GAL4을 표현하지만 강한 GAL4 드라이버를 선택해야합니다. 예를 들어, GAL4-OK107 버섯 체 (MB) 전구 세포 및 이들의 유도체, MB의 γ, α '/ β'및 α / β 뉴런 11 19 GAL4를 발현하는 GAL4 강한 드라이버이다. MB γ 뉴런의 부정한 표시 두 클론 패턴에서 관찰되었다 (즉, 다세포-NB 클론과 연관된 단일 세포 클론과 두 셀 GMC와 연관된 단일 셀) GAL4-OK107가 tsMARCM 실험 11에 사용 된 . 흥미롭게도, 상기 문제가 MB247-GAL4 다른 MB의 GAL4 드라이버를 사용하여 해결 될 수있다즉, 차별화 된 MB 뉴런 (11)에 GAL4을 표현한다.
모든 GAL4 드라이버가 tsMARCM 시스템 또는 다른 모자이크 라벨링 시스템에 사용될 수 없다 (예 MARCM, Q-MARCM 및 트윈 스폿 발생기) 드라이버가 관심의 뉴런에서 발현되지 않는 경우 4, 20, 21. 따라서, 신경 계통에 대한 tsMARCM를 사용하기 전에이 GAL4 드라이버는 팬 셀 드라이버와 듀얼 발현 제어 MARCM에 대한 관심의 뉴런의 자신의 보험을 테스트해야합니다 분석 (예를 들어, 튜 불린 프로모터 LEXA : GAD) (22) . 우리 tsMARCM 클론 때때로 복합 신경 발현 패턴, GAL4 드라이버를 사용하는, 특히, 명확하게 분석 할 수 없다는 것을주의 (예를 들어, 녹색 횡 호른 (LH) 뉴런도 3b에 VL2p adPN의 축삭 정교화 패턴의 명확한 시각화가 방지
기존 / 대체 방법에 대하여 기술의 중요성
tsMARCM, 쌍둥이 자리 발생기와 결합 MARCM 외에도 또한, 이론적으로 최소한의 시각화 허용두 가지 색상에서 일반적인 신경 전구 세포로부터 유도 된 신경 세포 (이들 세 모자이크 표시 기술의 비교 이전에 (15)으로 제공되었다). 트윈 스폿 발생기 tsMARCM의 원래 버전 (또는 tsMARCM 새로운 버전)의 조립에 필요한 유전자의 최소 개수와 결합 MARCM 각각 4, 8 (6), 및도 9이다. 그러나 tsMARCM은 광범위한 신경 계보는 12, 15, 18, 23을 분석 수행하기 위해 사용 된 유일한 시스템이다. 부위 특이 적 재조합 트윈 스폿 발생기 시스템의 비 - 분열 세포에서 발생하는지, 그리고 이것은 어려운 중앙의 개발 연구를이 시스템을 사용할 수 있도록, 동일한 셀의 두 기자의 공동 발현에 이르게 신경계 15. 대조적으로, tsMARCM에서 얻은 모자이크 클론과 결합 MARCM 시스템유사 분열 세포에서 파생 된 재. 결합 MARCM 시스템은 Q-MARCM 종래 MARCM 시스템의 다른 리포터의 발현을 제어하는 두 개의 독립적 인 드라이버를 필요로하기 때문에 두 개의 독립적 인 드라이버가 충실하지 않는 경우에는,이 공통 신경 전구 세포로부터 유도 된 신경 세포의 표지에 대한 우려를 제기 관심 (15)의 신경 계통에 동일한 뉴런 레이블을 붙입니다.
기술을 마스터 한 후 미래의 응용 프로그램 또는 방향
고해상도 신경 계통 분석을 수행 할 tsMARCM를 사용하여
뉴런 82 개의 체계적 tsMARCM의 adPNs의 클론 adPNs 40 종류의 분석도 3에 사용 된 방법을 적용하여, 이전의 연구 (12)에서 발견되었다. adPNs 이러한 40 종류 중 35 유니 사구체 adPNs과 rel, (즉,의 더듬이 엽 (AL)에서 하나의 사구체를 지배하는)이었다바깥 초파리 뇌 (12)의 다른 지역에 후각 정보 (참조 유 등의 알에 2-4도., 2010). adPNs의 다른 다섯 가지 유형은 AL에서 후각 정보를 통합하고도 3E-3H를 참조하십시오 (후각 시스템 (12)에 기능적 복잡성의 수준을 추가로 제공 할 수 폴리 사구체 adPNs (즉, 아메리칸 리그에서 여러 사구체를 지배하는)이었다 유에서 4Z 등., 2010). 애벌레에서 태어난 adPNs이 유형에 여러 뉴런에 의해 표현되는 반면 배아에서 태어난 adPNs는 (그림에게 유에서 2-4를 참조 후각 시스템 (12)에 특이성과 중복 사이에 상호 작용이 있음을 시사 입력 당 하나의 신경 세포가 외., 2010). 흥미롭게도, 특정 발달 창 내에서 생성 된 신경 세포는 죽을 운명, 그리고 adPNs의 많은 유형은 한 접점 있음을 시사 ALad1 신경 계통에서 신경 세포의 고정 번호로 발견후각 시스템을 조립 연구 및 adPNs의 유형은 엄격하게 규제 12 (에서 유 등, 2010도 2H, 4V, 및 5 참조]. 또한 그림 3P 참조 - 3T)를.
정확하게 유전자 기능을 연구하기 위해 tsMARCM를 사용하여
출생 데이트 adPNs 외에, tsMARCM은 GAL4-OK107에 의해 표시 육 중앙 복잡한 신경 세포의 출생 순서를 결정하는 데 적용되었습니다. 이 여섯 신경 세포는 2, 11 복잡한 모터 패턴을 제어 할 수있는 초파리 중앙 복합체의 회로에 기여하는 LALv1 신경 계통에서 신경 세포의 작은 하위 집합 구성 (유에서도 4a 및도 4b를 참조 외., 2009). 흥미롭게도,이 여섯 중앙 복잡한 뉴런 각각 (유에서 4D-4 시간과 섭씨 40도 참조 등., 2009) 별개의 연결 형태 (11)를 보유하고있다. 그들 모두는 후반 구별 축삭 패턴을 가지고RAL 액세서리 로브 (LAL). 나머지 두 개의 뉴런 타원체 몸체 중앙 복합체의 다른 서브 - 구조에 그 돌기를 돌출하는 반면, 처음 네 개의 뉴런은 noduli 중앙 복합체의 서브 - 구조의 서브 - 구획들은 돌기를 배포한다. 4 일 -born 중앙 복잡한 신경 세포가 지느러미 noduli에 자사의 수상 돌기를 배포 반면, 구체적으로는, 제 3 -born 중앙 복잡한 신경 세포는 다양한 축삭 패턴으로는 LAL에서 소형 축삭 패턴, 복부 noduli에 자사의 수상 돌기 프로젝트 LAL (11) (유에서 그림 4 층과 4g를 참조하십시오 외., 2009).
tsMARCM 시스템은 다른 동물에서 동일한 뉴런의 시험을 가능하게하여 분석하고 더 나은 표현형을 허용하기 때문에 종합적으로 식별 신경을 넘어, tsMARCM의 힘, 관심의 신경 세포에서 유전자 기능을 연구하여 더 좋은 예시가 될 것입니다. 예를 들어, tsMARCM 번의 시간 지방 검출제 3 회 -born 중앙 복잡한 뉴런 (11)에 시간적으로 부적절한 형태 형성을 필요로 전자 변경 (chinmo하는 BTB - 아연 손가락 핵 단백질) (유에서 그림 4I, 4P 및 4w를 참조하십시오 외., 2009). chinmo 돌연변이 원래 MARCM 시스템에있어서 되었다면 (즉, 단일 그린 표지 된 뉴런에서, 기준이되는 트윈 셀의 관련 측면으로부터 유래 신경 라벨없는)에 chinmo 결핍 뉴런은도 4I에 도시 유 등. 2009 년은 4 번째 -born 아닌 제 3의 -born, 중앙 복잡한 신경 세포로 잘못 식별되었을 것입니다. 이 축삭 지침을 제어하기보다는 시간적 운명 11 지정하는 것과 chinmo 함수의 오해 이어질 것입니다 (유에서 그림 4I 두 번 화살표를 외., 2009). 그러나 번째로 tsMARCM 클론 마젠타 다세포-NB의 측면을 이용하여상기 세포 수를 계수 통해 E 참조 ( 그림 4m, 4N, 그리고 유 등의 4P. , 2009), 유 등으로부터도 4I에 도시 chinmo 결핍 신경 세포. , 2009) 따라서 중앙 복잡한 뉴런 11 시간 운명 사양에 기능을 chinmo 올바른 결론을 이끄는 제 3 -born 중앙 복잡한 신경을 입증했다. 종합하면, 상기 결과는 향후 신경 발달의 연구를위한 고해상도 (해당되는 경우, 또는 다른 유형의 세포) 표현형함으로써 정확하게 뉴런에서의 유전자 기능을 개시하는, 분석 용 tsMARCM 시스템의 중요한 장점 (또는 기타의 개발 연구를 강조 조직).
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 과학 기술부에 의해 지원되었다 (MOST 104-2311-B-001-034)과 세포 연구소 유기체 생물학, 중앙 연구원, 대만.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon dioxide (CO2) | Local vendor | n.a. | Anesthetize flies |
| CO2 pad | Local vendor | n.a. | Sort, cross and transfer flies |
| 10x PBS pH 7.4 | Uniregion Bio-Tech (or other vendors) | PBS001 | Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | Fix fly brains |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Rinse, wash and immunostain fly brains |
| Normal goat | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Immunostain fly brains |
| serum | |||
| Rat anti-mouse CD8 antibody | Invitrogen | MCD0800 | Immunostain fly brains |
| Rabbit anti-DsRed antibody | Clonetech | 632496 | Immunostain fly brains |
| Mouse anti-Brp antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Immunostain fly brains |
| Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11006 | Immunostain fly brains |
| Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | Immunostain fly brains |
| Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Immunostain fly brains |
| SlowFade gold antifade reagent | Molecular Probes | S36936 | Mount fly brains and protect quenching of fluorescence |
| PYREX 9 depression glass spot plate | Corning | 7220-85 | Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | 242276-250G | Make black Sylgard dishes |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Dissect and mount fly brains |
| Micro slide | Corning | 2948-75x25 | Mount fly brains |
| Micro cover glass No. 1.5 | VWR International | 48366-205 | Mount fly brains |
| Nail polish | Local vendor | not available | Seal micro cover glass on micro slides |
| Incubator | Kansin Instruments | LTI603 | culture flies at 25 °C |
| (or other vendors) | |||
| Water bath | Kansin Instruments | WB212-B2 | Induce heat-shock in flies at 37 °C |
| (or other vendors) | |||
| Orbital shaker | Kansin Instruments | OS701 | Wash and immunostain fly brains |
| (or other vendors) | |||
| Dissection microscope | Leica | EZ4 | Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains |
| Confocal microscope | Zeiss (or other vendors) | LSM 700 (or other models) | Image tsMARCM clones |
| image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser) |
Zeiss | not available | Project stacks of confocal images |
| image-processing software 2 (e.g., ImageJ) |
not available | not available | Count cell number of tsMARCM clones |
References
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