Cell Lineage Analyser og gen-funksjon studier med Twin-spot MARCM

Summary

Her presenterer vi en protokoll for en mosaikk merkingsteknikk som tillater visualisering av neuroner avledet fra et felles stamceller i to forskjellige farger. Dette forenkler nevrale avstamning analyse med mulighet for foster-dating enkelte nevroner og studere gen-funksjon i de samme nerveceller i ulike individer.

Abstract

M osaic en nalysis med en r epressible c ell m Arker (MARCM) er en positiv mosaikk merkeordning som har blitt mye brukt i Drosophila nevrobiologiske studier for å skildre intrikate morfologi og å manipulere funksjon av gener i undergrupper av nevroner innenfor ellers umerket og uaffisert organismer. Genetiske mosaikk generert i MARCM systemet formidles gjennom stedsspesifikk rekombinasjon mellom homologe kromosomer innenfor dele forløper celler til å produsere både merkede (MARCM kloner) og umerkede dattercellene under mitose. En forlengelse av MARCM metoden, som kalles tvilling-spot MARCM (tsMARCM), etiketter begge de to celler avledet fra en felles stamfar med to forskjellige farger. Denne teknikken ble utviklet for å muliggjøre gjenfinning av nyttig informasjon fra begge hemi-linjene. Ved omfattende analyse av forskjellige par tsMARCM kloner, tillater tsMARCM system med høy oppløsning nevrale avstamning Mapping å avsløre den eksakte fødselsorden de merkede nevroner produsert fra vanlige stamceller. Videre tsMARCM Systemet omfatter også genefunksjonsstudier ved å la den fenotypiske analyse av identiske neuroner forskjellige dyr. Her beskriver vi hvordan du bruker tsMARCM system for å lette studier av nevral utvikling i Drosophila.

Introduction

Hjernen, som består av et stort antall og ulike typer nevroner, endows dyr med evnen til å oppfatte, behandle og svare på utfordringene fra den ytre verden. Neuroner fra voksne Drosophila sentrale hjernen er avledet fra et begrenset antall av nevrale stamceller, som kalles neuroblaster (NBS), under utvikling av ^{en, to.} Mesteparten av NBs delta i hjernen neurogenesis i Drosophila gjennomgå asymmetrisk divisjon for å generere selvfornyende NBs og ganglion mor celler (GMC), og GMC deretter gå gjennom en ny runde av divisjon for å produsere to datterceller som skiller inn nevroner ³ (figur 1A ). På grunn av kompleksiteten av neuronal morfologi og utfordringene knyttet til å identifisere spesifikke nevroner, en positiv mosaikk merking teknologi, mosaikk analyse med en repressible celle markør (MARCM), ble oppfunnet for å aktivere visualization av en enkelt nervecelle eller en liten undergruppe av nevroner ut av befolkningen i omkringliggende, umerkede nevroner ^4.

MARCM benytter flippase (FLP) / FLP gjenkjennelse target (FRT) system for å formidle setespesifikk rekombinasjon mellom homologe kromosomer i en skille forløper celle som bærer en heterozygot allel av et repressor-genet hvis ekspresjon normalt inhiberer ekspresjonen av et reportergen ^4. Etter den mitotiske deling, blir de rekombinante kromosomene segregert i to celler, slik at en celle inneholder homozygote alleler av repressor-genet og den andre cellen ikke har noen repressor-gen-ekspresjon av reporter i den cellen (og dens etterkommere) er ikke lenger blokkert ^fire. Tre klonale mønstre er vanligvis å finne i en MARCM eksperiment når FLP er stokastisk indusert i NBs eller GMC: encellede og to-celle-GMC kloner, som skildrer neuronal morfologi hos encellede resolution, og multi-cellular-NB kloner, som avslører hele morfologiske mønstre av nerveceller som stammer fra en felles NB (figur 1B). Den MARCM teknikken har blitt mye brukt i Drosophila nevrobiologiske studier, blant annet i neuronal typeidentifikasjonen for å rekonstruere hjernedekkende ledningsnett nettverk, analyserer nevrale avstamning for å avsløre utviklingshistorie nevroner, fenotypiske karakterisering av genet funksjoner involvert i celle skjebne spesifikasjon, og neuronal morphogenesis og differensiering studerer ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Fordi konvensjonelle MARCM bare etiketter en av de to datterceller (og linjene) etter den induserte mitotisk rekombinasjon, er potensielt nyttig informasjon fra umerket side tapt. Denne begrensning utelukker anvendelsen av den grunnleggende MARCM system til høyoppløselig analyser av mange nevrale linjene som bytter celle skjebner i hurtig tempo eller presisjon analyser av genet funksjoner i identiske nevroner forskjellige dyr ^{11, 12.}

Twin-spot MARCM (tsMARCM) er et avansert system som etiketter nevroner avledet fra en felles stamfar med to forskjellige farger, som muliggjør gjenvinning av nyttig informasjon fra begge sider av de to cellene, og dermed overvinne begrensninger av den opprinnelige MARCM system ¹¹ ( Figur 2A - 2C). I det tsMARCM system, to RNA-interferens (RNAi) -baserte undertrykkere er plassert på trans-områder av homologe kromosomer i en forløper celle, og ekspresjon av disse dempere uavhengig hemme ekspresjon av de respektive reportere (figur 2B). Etter stedsspesifikk mitotisk rekombinasjon formidlet gjennom FLP / FRT system, two RNAi-baserte dempere blir isolert i to celler til å tillate uttrykk for forskjellige journalister (figur 2B). To klonale mønstre, enkelt-celle assosiert med enkelt-cellekloner og to-celle-GMC i forbindelse med multi-cellulær-NB kloner, blir vanligvis sett i et tsMARCM eksperiment (figur 2C). Informasjon utledet fra den ene siden av de to celler kan benyttes som referanse for den andre siden, slik at med høy oppløsning nevrale avstamning analyser, såsom fødsels-stammer de merkede nevroner, og fenotypiske analyser av identiske nevroner i forskjellige dyr for nøyaktig undersøkelse av nevrale genfunksjon ^{11, 12.} Her presenterer vi en steg-for-steg-protokoll som beskriver hvordan gjennomføre en tsMARCM eksperiment, som kan brukes av andre laboratorier for å utvide sine studier av nevral utvikling (samt utvikling av andre vev, hvis aktuelt) i Drosophila.

Protocol

1. Bygg tsMARCM-klar Flies bruke nødvendig transgener ^{11, 13}

1. Generere den opprinnelige versjonen av tsMARCM-klare fluer fra transgener som er gjennomført av private fluer ¹¹ (se tabell 1). Gjennomføre standard flue genetiske krysnings ordninger, som har blitt beskrevet tidligere, ved å sette flere transgener i de samme flue aksjer ^13.
   1. I en foreldrelinje, montere transgener i FRT ^40A, UAS-mCD8 :: GFP (den første reporter, mCD8 :: GFP, ekspresjon av transgenet er under kontroll av oppstrøms aktiveringssekvensen promoter, som frembringer et membran-bundet reporter av mus klynge av differensiering 8-proteinet fusjonert med grønt fluorescerende protein), og UAS-rCD2RNAi (suppressor som hemmer ekspresjonen av andre reporter; RNAi mot ekspresjonen av rotte klynge of differensiering 2, rcd2) på venstre arm av ^2. kromosomet. Plass vevsspesifikt -GAL4 driver på X- eller ^3. kromosom, om mulig.
   2. I den andre foreldrelinjen, montere transgener av FRT ^40A, UAS-rCD2 :: RFP (den andre reporteren, rCD2 :: RFP, den andre membran tethered reporter som består av rCD2 protein smeltet sammen med rød fluorescerende protein), og UAS-GFPRNAi (suppressor som hemmer ekspresjonen av mCD8 :: GFP, RNAi mot ekspresjon av GFP) på den venstre arm av ^2. kromosomet. Plassere varme-sjokk (hs) -FLP eller vev-specific- FLP på X- eller ^3. kromosom, om mulig.
2. Generere den nye versjonen av tsMARCM-klare fluer fra transgener som er gjennomført av private fluer ¹⁴ (se tabell 1). Gjennomføre standard flue genetiske krysnings ordninger, som har blitt beskrevet previously, ved å sette flere transgener i de samme flue aksjer ^13.
   1. I en foreldrelinje, montere transgener i en FRT område og UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (en kombinert transgen av mCD8 :: GFP og suppressor som hemmer ekspresjonen av rCD2 :: RFP) sammen i den samme arm 2 ^nd eller ^3. kromosom (passende par av transgener av FRT og UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i er angitt i tabell 1). Plasser vev-spesifikk-GAL4 driveren på andre enn kromosomet av den valgte FRT området, hvis det er mulig kromosomer.
   2. I den andre foreldrelinje, montere transgener i en FRT område og UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (den andre kombinerte transgenet av rCD2 :: RFP og suppressor som hemmer ekspresjonen av mCD8 :: GFP) i samme arm av ^2. eller ^3. kromosom (passende par av transgener av FRT UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi er angitt i tabell 1). Plasser hs-FLP eller vev-spesifikk-FLP på andre enn kromosomet av den valgte FRT området, hvis det er mulig kromosomer.

2. Cross tsMARCM-klar Fluer å generere tsMARCM Clones i deres avkom

1. Cross tsMARCM-ready fluer sammen (for eksempel sette 10-15 mannlige fluer fra trinn 1.1.1 eller 1.2.1 og 20-30 jomfru kvinnelige flyr fra trinn 1.1.2 eller 1.2.2 sammen) i et fly-mat hetteglass med frisk -laget gjær lim på veggen av hetteglasset.
2. Opprettholde de kryssede tsMARCM-ready flyr på 25 ° C i 2 dager for å øke sjansen for parring før samle befruktede egg.
3. Vanlige overføre kryssede tsMARCM-ready fluer i ferske yeasted ampuller for å unngå trengsel (trykk ned fluer eller bruke karbondioksid til bedøve fluene å lette overføringen, hold ikke mer enn 80-100 befruktede egg i en 10 ml fly-mat vial for å unngå for mange klekket larver).
4. Kultur de tsMARCM dyr (dvs. befruktede egg, et eksempel på genotype av tsMARCM dyr, som brukes i figur 3, er hs-FLP ^[22], w / w, UAS-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT ^40A , GAL4-GH146 / UAS-rCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT ^40A, + +) som har blitt lagt i serielt overført ampuller ved 25 ° C før de utvikler seg til de ønskede scener (f.eks embryoer, larver, eller puppe).
5. Plasser de overførte ampuller som inneholder tsMARCM dyrene på samme utviklingsstadiet til et 37 ° C vannbad i 10, 20, 30, 40 og 50 min for å bestemme den optimale tiden for varmesjokk som induserer ekspresjon av FLP å generere tsMARCM kloner av interesse. Hopp over dette trinnet hvis vev-specific- FLP blir brukt i tsMARCM eksperimentet (hs-FLP er foretrukket for neural avstamning analyser; årsakene til denne preferanse er blitt beskrevet tidligere ¹⁵).
   MERK: Gjenta trinn 2.5 bruker den optimale tidspunktet for varmesjokk i fremtidige tsMARCM eksperimenter hvis flere tsMARCM kloner av interesse er ønsket; generelt, er mer FLP uttrykk indusert i hs-FLP ^[22] sammenlignet med hs-FLP ^[1] med samme varmesjokk tid.
6. Kultur de varmesjokkerte tsMARCM dyr ved 25 ° C før de har nådd riktig utviklingsstadiet, og deretter gå videre til trinn tre.

3. Forbered, Stain, og Mount Fly Brains Inneholder tsMARCM Clones

1. Forbered tang-beskyttelse retter. Bland del A (30 g) og del B (3 g) av silikon-elastomer sett med aktivt kull (0,25 g). Hell blandingen i de aktuelle retter.
2. Dissekere larve, pupal eller voksne hjerner ut av tsMARCM dyrene i 1x fosfat-bufret saltvann (PBS) ved hjelp av tang på en tang-beskyttelse tallerken sett gjennom et mikroskop disseksjon. MERK: En protokoll for fly hjernen disseksjon har vært synkenderibed tidligere ^16.
3. Fest fly hjernene i en glassplate flekk med 1 x PBS inneholdende 4% formaldehyd ved romtemperatur i 20 min. Behandle fly hjerner i dette glasset sted plate for resten av trinnene.
4. Skyll flue hjernen tre ganger med 1% PBT (1x PBS som inneholder 1% Triton X-100) og vaske dem tre ganger i 30 minutter hver i 1% PBT (skyll: Fjern PBT og legge til nye PBT raskt, vask: fjerne PBT, legge til nye PBT og inkuber flue hjernen i det nye PBT ved hjelp av en orbital shaker).
5. Inkuber flue hjerne med blandingen av primære antistoffer over natten ved 4 ° C eller i 4 timer ved romtemperatur. Et eksempel på en blanding av primære antistoffer er rotte-anti-CD8-antistoff (1: 100), kanin-anti-DsRed-antistoff (1: 800), og mus anti-Bruchpilot (BRP) antistoff (1:50) i 1% PBT innehold 5% normalt geiteserum (NGS).
6. Skyll flue hjernen tre ganger med 1% PBT, og deretter vaske dem tre ganger i 30 minutter hver med 1% PBT.
7. Skyll flue hjernen tre ganger med 1% PBT, og deretter vaske dem tre ganger i 30 minutter hver med 1% PBT. Montere dem på en mikro lysbilde med et anti-quenching reagens. Sett en mikro dekkglass på mikro lysbilde å dekke og beskytte flue hjerner. Forsegle kantene på mikrodekkglass og micro lysbildet bruker klar neglelakk. Oppbevar disse montert og forseglet fly hjerneprøver ved 4 ° C.

4. Ta Process, og analysere Fluorescent Bilder av tsMARCM Clones

1. Fange fluorescerende bilder av tsMARCM kloner from prøvene ble opprettet i trinn 3.8 bruker konfokalmikroskopi system av valget.
2. Prosjekt stabler av tsMARCM confocal fluorescerende bilder til todimensjonal, flat bilder med et bildebehandlingsprogram som følger med konfokalmikroskopi system av valg (se Figur 3B - 3E, 3G - 3J, 3L - 3o, og 3Q - 3T for eksempler på flat confocal fluorescerende bilder).
3. Tell celle nummer av multi-cellular-NB sider av tsMARCM kloner ved hjelp av et egnet bildebehandlingsprogram (f.eks funksjonen "celleteller" i ImageJ ^17, se figur 3E, 3J, 3o, og 3T for eksempler på cellen likene av nevroner).

Representative Results

Den tsMARCM systemet har blitt anvendt for å lette nevrale avstamning analyser og gen-funksjonsstudier ved å hente viktig informasjon om neuroner avledet fra vanlige NBS. Systemet har blitt brukt til å identifisere de fleste (om ikke alle) nevrontyper, bestemme celle nummer av hver neuronal type, og fastslå fødselen bestilling av disse nevronene ^{11, 12, 18} (se Diskusjon Avdeling for informasjon om hvordan du bruker tsMARCM til gjennomføre nevrale avstamning analyser eller genet funksjonsstudier). Her brukte vi fire tsMARCM kloner av anterodorsal olfactory projeksjon nevroner (adPNs i ALad1 nevrale avstamning av Drosophila luktesystem) merket med GAL4-GH146 som eksempler for å illustrere hvordan man skal gjennomføre en tsMARCM forsøk ^{1, 2.} Etter FLP uttrykk ble indusert ved fosterstadiet, en single, grønn VL2p adPN assosiert med 45 magenta adPNs ble oppdaget i en tsMARCM klone (figur 3A - 3E). I kontrast, når FLP ble indusert senere, på ulike larvestadier, singel, grønne adPNs (DL1 adPN eller DC3 adPN) eller no-GH146 + adPNs forbundet med forskjellige antall magenta adPNs (31, 21 eller 15) ble observert i tre andre tsMARCM kloner (Figur 3F - 3T). Fødselen av VL2p adPNs før fødselen av DL1-, DC3- og ingen GH146 + -adPNs ble bestemt ved å telle antall celler av adPNs i deres tilknyttede multi-cellular-NB sider av tsMARCM kloner (45, 31, 21, og 15 på figur 3E, 3J, 3O, og 3T, henholdsvis). I tillegg til telling av antall celler, kompleksiteten av aksonal og dendrittiske mønstre i multi-cellulær-NB sider av tsMARCM kloner kan anvendes for å bestemme den relative fødsel-rekkefølgen av deres tilhørende to-celle-GMC sider avtsMARCM kloner. Mosaikk kloner indusert på tidlige utviklingsstadier normalt inneholde flere nevroner og dermed har mer komplekse aksonal og dendrittiske mønstre, mens mosaikk kloner indusert ved slutten utviklingsstadier inneholder færre nevroner og dermed har mindre komplekse aksonal og dendrittiske mønstre (Figur 3C - 3D, 3H - 3I 3M - 3N, og 3R - 3S).

Figur 1: skjematiske illustrasjoner av Drosophila nevrogenesen og de tre typer av klonale mønstre som finnes i en MARCM eksperiment. (A) viser skjematisk nevrogenese i de fleste nevrale linjer av Drosophila sentrale hjernen: neuroblasts (NBS) gjennomgå en asymmetrisk divisjon å generere selvfornyende NBs og ganglion mor celler (GMC), og GMC dele én gang for å frembringe to datter nevroner (NS). (B) Tre klonale mønstre er observert i en MARCM eksperiment: single-cellekloner (a), når flippase (FLP) induseres i GMC, og to-celle-GMC kloner (b) og multi-cellulær-NB kloner (c ), når FLP er indusert i NBs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Skjematisk diagrammer av tsMARCM systemet. (A) tsMARCM-ready fluer: en foreldre flue inneholder transgener av en FRT område og UAS-mCD8 :: GFP (den første reporter), UAS-rCD2RNAi (den første suppressor som hemmer ekspresjonen av andre reporter), og et vev -spesifikk -GAL4; den andre foreldre fly inneholder en FRT UAS-rCD2 :: RFP (den andre reporter), UAS-GFPRNAi (den andre suppressor som hemmer ekspresjonen av den første reporter), og hs-FLP. (B) Tilstedeværelsen av de to RNAi-baserte dempere i avkom av de kryssede tsMARCM-ready fluer hemmer uttrykk for journalister (dvs. mCD8 :: GFP og rCD2 :: RFP i G1 og G2 faser av panel B). Ekspresjonen av FLP induseres ved varmesjokk, og FLP medierer deretter den setespesifikke rekombinasjon av homologe kromosomer i en skille forløper celle ved binding til FLP gjenkjennings mål (FRTs). Dette resulterer i at segregering av de RNAi-basert dempere i de to cellene etter mitotisk deling for å tillate ekspresjon av distinkte pressen. (C) To klonale mønstre er observert i en tsMARCM eksperiment: single-celle, er forbundet med enkeltcellekloner (a) når FLP induseres i GMC, og to-celle-GMC, i forbindelse med multi-cellulær-NB kloner(B) når FLP er indusert i NBs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Bruk av fire tsMARCM kloner av adPNs som eksempler på hvordan man skal gjennomføre en tsMARCM eksperiment i en neural avstamning analyse. Fire tsMARCM kloner av adPNs er illustrert med diagrammer av sine neurogenesis mønstre (A, F, K, og P); konfokale bilder av den totale hjerne (B, G, L, og Q), som viser den sideveis horn (LH, C, H, M, og R), antennal lapp (AL, D, I, N, og S) og soma(E, J, O og T); og mønstre av sine nevronale morfologi. Enkelt adPNs (VL2p, DL1, DC3, og ingen GH146 + adPNs; grønn) assosiert med multi-cellular-NB adPNs (magenta) av tsMARCM kloner ble utledet ved induksjon av FLP å megle mitotisk rekombinasjon i adPN NB på embryonale (A - E) og larver (F - T) stadier. Legg merke til at adPNs er en av de hemi-linjene i ALad1 nevrale linjen, noe som resulterer i tsMARCM kloner av en enkelt, grønn adPN forbundet med magenta adPNs i figur 3 (for ukjente grunner, neuroner fra den andre hemi-linjen av ALad1 nevrale avstamning dør). Fødselen-order of VL2p, DL1, DC3, og ingen GH146 + adPNs ble bestemt ved å telle antall celler av adPNs i magenta multi-cellular-NB sider av tsMARCM kloner (45, 31, 21, og 15 innenfor den stiplede linjer paneler E, J, O og T). Den neuritt-mønstre er vanligvis mer komplekse i magenta multi-cellulær-NB sider når tsMARCM klonene induseres på tidlige utviklingsstadier (for eksempel, er det dendritiske mønster mer komplekse i panel E sammenlignet med paneler I, N og S). tsMARCM analyser er ofte forvirrende når neuroner i andre nevrale linjer er også merket med den samme GAL4 driveren (som grønne LH neuroner, som er vist med dobbeltpiler, hindrer visualisering av aksonal utdypning mønster av VL2p adPNs i panelene B og C) . Hjerne neuropiles (markert med blått) ble farget med antistoff mot Bruchpilot (BRP). Varmesjokk-tid: 12 min (panelene A - E), 15 min (panelene F - J), og 35 min (paneler K - T). Scale bar i paneler B - G - J, L - O, og Q - S = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Kritiske trinn i protokollen

Trinn 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5, og 3.2 er avgjørende for å oppnå gode tsMARCM resultater. Vevsspesifikke -GAL4 drivere som ikke uttrykker GAL4 i nevrale stamceller er foretrukket for trinn 1.1.1 og 1.2.1. Unngå over-crowding dyrene dyrket i fly-mat ampuller i trinn 2.3. Fordi induksjons ventetid, ekspresjonsnivået av FLP ved varmesjokk, og den gjennomsnittlige dele tiden av nevrale stamceller (dvs. NBS og GMC) ikke er kjent, er det best å variere varmesjokk-tid (10, 20, 30 , 40, og 50 min) på forskjellige prøver av den samme genotype og utviklingsstadiet i trinn 2,5. Dette vil muliggjøre bestemmelse av den optimale varmesjokk tid for å oppnå det beste forholdet mellom tsMARCM kloner av interesse. I tillegg være forsiktig under flue hjernen disseksjon i trinn 3.2 for å få intakte hjerneprøver; Dette er avgjørende for nøyaktig telling nevronale celletall. for Resebueskyttere som er interessert i å bruke tsMARCM for å studere funksjonen til gener på andre kromosomarmer (f.eks 2R, 3L, og 3R), tsMARCM-klare fluer bør settes sammen som i trinn 1,2 ved å velge riktig par av transgener av FRT, UAS- mCD8.GFP.UAS-rCD2i, og UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi, som er angitt i tabell 1. Vi anbefaler også at de kvinnelige tsMARCM-klar fluer bære hs-FLP på X-kromosomet (f.eks hs-FLP ^[22], w; UAS-rCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT ^40A, + +), som forenkler gjentatte tsMARCM eksperimenter.

Modifikasjoner, feilsøking og begrensninger ved Technique

Effektiviteten og perdurance av RNAi dempere og journalister er de viktigste determinanter for om nevrale avstamning analyser og gen-funksjon studier kan med hell utføres i tsMARCM eksperimenter. Vanligvis kombinasjonen av lav perdurance av RNAi dempere ogreportere avledet fra nevrale stamceller, sammen med den høye uttrykk for RNAi dempere og journalister i post-mitotisk nevroner, tillater bedre tsMARCM resultater. Fordi uttrykk for RNAi dempere og journalister er kontrollert av GAL4 sjåfører, bør forskerne velge sterke GAL4 drivere som uttrykker GAL4 i differensierte nevroner, men ikke i nevrale stamceller. For eksempel, er GAL4-OK107 en sterk GAL4 driver som uttrykker GAL4 i sopplegemet (MB) progenitorer og deres derivater, MB γ, α '/ β', og a / p-neuroner ^{11, 19.} Utro merking av MB y neuroner har vært observert i to klonale mønstre (dvs. enkelt-celle assosiert med enkelt-cellekloner og to-celle-GMC i forbindelse med multi-cellulær-NB kloner) når GAL4-OK107 ble anvendt i tsMARCM eksperimenter ¹¹ . Forbløffende nok kan det ovennevnte problemet løses ved hjelp av MB247-GAL4, en annen MB GAL4 driversom uttrykker GAL4 i differensiert MB nevroner ^11.

Ikke alle GAL4 drivere kan brukes i tsMARCM systemet eller i andre mosaikk merkingssystemer (f.eks MARCM, Q-MARCM, og twin-spot generator) ^{4, 20, 21} hvis føreren ikke er uttrykt i nervecellene av interesse. Derfor før du bruker tsMARCM for nevrale avstamning analyser, GAL4 sjåfører bør testes for sin dekning av nevroner av interesse i dual-uttrykk-kontroll MARCM med en pan-celle driver (f.eks tubulin promoter-Lexa :: GAD) ²² . Vi merker oss at tsMARCM kloner noen ganger ikke kan analyseres entydig, spesielt når en GAL4 driver med en kompleks nevrale uttrykk mønster brukes (for eksempel grønn side horn (LH) nevroner hindre klar visualisering av aksonal utdypning mønster av VL2p adPN i figur 3B og (f.eks MARCM, Q-MARCM, og to-sted generator) ^{4, 20, 21} fordi den begrensning stammer med den GAL4 driveren. Vi merker oss også at for å gjennomføre rednings eksperimenter for autentisering av genet funksjoner, bør redningstransgener være konstruert med målet sekvensene av RNAi dempere i 5 'eller 3' utranslaterte regioner av transgene rednings konstruksjoner, eller en alternativ tvilling-spot merkeordning (f.eks, kombinert MARCM, en kombinasjon av Q-MARCM og konvensjonell MARCM) ²¹ bør vedtas.

Betydningen av Technique For eksisterende / alternative metoder

Dess tsMARCM, tvilling-generator sted og koblet MARCM vil også, i det minste i teorien, tillater visualisering avnevroner avledet fra vanlige nevrale stamceller i to forskjellige farger (en sammenligning av disse tre mosaikk merking teknologier har blitt presentert tidligere ^15). Det minste antall transgener som kreves for montering av tvilling-generator flekk, den opprinnelige versjon av tsMARCM (eller den nye versjonen av tsMARCM), og koplet MARCM er 4, 8 (eller 6), og 9, respektivt. Imidlertid er tsMARCM det eneste system som er blitt brukt for å utføre omfattende nevrale avstamning analyser ^{12, 15, 18, 23.} Stedsspesifikk rekombinasjon gjør oppstå i ikke-mitotiske celler i tomanns-spot generatorsystem, og dette fører til co-uttrykk av de to journalistene i samme celle, noe som gjør det vanskelig å bruke dette systemet til å studere utviklingen av den sentrale nervesystemet ^15. I kontrast, mosaikk kloner oppnådd i tsMARCM og kombinert MARCM systemer enre avledet fra mitotiske celler. Men fordi kombinert MARCM systemet krever to uavhengige drivere for å kontrollere uttrykk for de forskjellige journalister i Q-MARCM og konvensjonelle MARCM systemer, reiser dette spørsmål om merking av nevroner avledet fra vanlige nevrale stamceller hvis de to uavhengige sjåfører ikke trofast merke de samme nevronene i de nevrale linjer av interesse ^15.

Fremtidige søknader eller Veibeskrivelse Etter å mestre teknikken

Bruke tsMARCM å gjennomføre høyoppløselige nevrale avstamning analyser
Ved å anvende fremgangsmåten som brukes i figur 3 for systematisk å analysere tsMARCM kloner av adPNs, 40 typer av adPNs, med totalt 82 neuroner, ble identifisert i en tidligere studie ^12. Blant disse 40 typer adPNs, 35 var uni-glomerulær adPNs (dvs. innervating en enkelt glomerulus i antennal lapp (AL)), som relay olfactory informasjon til andre regioner av Drosophila hjernen ¹² (se Figurene 2-4 i Yu et al., 2010). De øvrige fem typer adPNs var poly-glomerulær adPNs (dvs. innervating flere glomeruli i AL), som kan integrere olfactory informasjon fra AL og gir et ekstra nivå av funksjonell kompleksitet til luktsystemet ¹² (se figur 3E-3H og 4Z i Yu et al., 2010). Embryonale-born adPNs har bare en neuron fra type til type, mens larver-born adPNs er representert ved flere neuroner pr typen, noe som tyder på at det er et samspill mellom spesifisitet og redundans i det olfaktoriske systemet ¹² (se figurene 2-4 i Yu et al., 2010). Interessant, nevroner produsert innenfor visse utviklings vinduer forutbestemt til å dø, og mange typer adPNs er funnet med et fast antall nevroner i ALad1 nevrale avstamning, noe som tyder på at number og typer av adPNs for montering av luktsystemet er tett regulert ¹² (se figurene 2 H, 4V, og 5 i Yu et al, 2010;. også se Figur 3P - 3T).

Bruke tsMARCM å nøyaktig studere genet funksjoner
Foruten p-dating adPNs har tsMARCM også blitt brukt til å bestemme fødselsorden seks sentrale komplekse nerveceller merket med GAL4-OK107. Disse seks neuroner utgjør en liten del av nevroner i LALv1 nevrale avstamning som bidrar til kretsen i Drosophila sentrale komplekset til å styre motor intrikate mønstre ^{2, 11} (se figur 4a og 4b i Yu et al., 2009). Interessant, besitter hver av disse seks sentrale komplekse neuroner en distinkt neuronal morfologi ¹¹ (se figur 4d-4h og 4o i Yu et al., 2009). Alle av dem bærer tydelige aksonal mønstre på sluttenral tilbehør lapp (LAL). De første fire neuroner distribuere sine dendritter til underrommene i noduli, en sub-struktur av den sentrale komplekset, mens de resterende to neuroner projisere sine dendritter til ellipsoiden kroppen, en annen sub-struktur av den sentrale komplekset. Nærmere bestemt rager det ^3. -born sentrale komplekset neuron sine dendritter til de ventrale noduli, med en kompakt aksonal mønster i LAL, mens den ^4. -born sentrale komplekset neuron distribueres dendritter til dorsal noduli, med en bred aksonal mønster i ^LAL-11 (se Figur 4f og 4g i Yu et al., 2009).

Utover omfattende identifisere nevroner, ville kraften i tsMARCM være bedre eksemplifisert ved å studere genet funksjoner i nevroner av interesse, siden tsMARCM systemet gir bedre fenotypiske analyser ved at undersøkelsen av identiske nevroner i forskjellige dyr. For eksempel oppdager tsMARCM et enkelt temp fette endring som krever kronologisk upassende morphogenesis (chinmo, en BTB-sink finger atom protein) i ^3. -born sentrale komplekse nevroner ¹¹ (se figur 4i, 4p, og 4w i Yu et al., 2009). Hvis chinmo mutasjonen hadde blitt karakterisert i den opprinnelige MARCM system (dvs. enkle grønne-merket nevroner, uten merking av nevroner avledet fra de tilknyttede sider av de to cellene som referanse), den chinmo -deficient nevron vist i figur 4i fra Yu et al. 2009 ville ha blitt feilidentifisert som den ^4. -born, snarere enn ^3. -born, sentral komplekse nervecellen. Dette ville ha ført til feiltolkning av chinmo funksjon som kontrollerende aksonal veiledning enn å angi tidsmessige skjebne ¹¹ (dobbelt-pil i figur 4i fra Yu et al., 2009). Men ved hjelp av magenta multi-cellular-NB sider av tsMARCM kloner som the referansen (via telle celle tall i Figur 4m, 4n, og 4p fra Yu et al. 2009), den chinmo -deficient nevron vist i Figur 4i fra Yu et al. , 2009) ble påvist å være den ^3. -born sentrale komplekset neuron, som derfor førte til den konklusjon at riktig chinmo funksjoner i tidsmessig skjebnen spesifikasjon for sentral komplekse nerveceller ^11. Til sammen resultatene ovenfor fremheve de viktige fordelene med tsMARCM system for høyoppløselig fenotypiske analyser, og dermed gi dem tilgang genet funksjoner i nevroner (eller andre typer celler, hvis det er aktuelt) for fremtidige nevrale utviklingsstudier (eller utviklingsmessige studier av andre vev).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon dioxide (CO2)	Local vendor	n.a.	Anesthetize flies
CO2 pad	Local vendor	n.a.	Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (or other vendors)	PBS001	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fix fly brains
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody	Invitrogen	MCD0800	Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody	Clonetech	632496	Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent	Molecular Probes	S36936	Mount fly brains and protect quenching of fluorescence
PYREX 9 depression glass spot plate	Corning	7220-85	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments	SYLG184	Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	242276-250G	Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30	Dissect and mount fly brains
Micro slide	Corning	2948-75x25	Mount fly brains
Micro cover glass No. 1.5	VWR International	48366-205	Mount fly brains
Nail polish	Local vendor	not available	Seal micro cover glass on micro slides
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	culture flies at 25 °C
(or other vendors)
Water bath	Kansin Instruments	WB212-B2	Induce heat-shock in flies at 37 °C
(or other vendors)
Orbital shaker	Kansin Instruments	OS701	Wash and immunostain fly brains
(or other vendors)
Dissection microscope	Leica	EZ4	Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope	Zeiss (or other vendors)	LSM 700 (or other models)	Image tsMARCM clones
image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	not available	Project stacks of confocal images
image-processing software 2 (e.g., ImageJ)	not available	not available	Count cell number of tsMARCM clones