Análises celular linhagem e estudos da função de genes utilizando marcm Twin-ponto

Summary

Aqui, nós apresentamos um protocolo para uma técnica de marcação de mosaico que permite a visualização dos neurónios derivados de uma célula progenitora comum em duas cores distintas. Isso facilita a análise de linhagem neural com a capacidade de neurônios individuais-datando de nascimento e função do gene estudar nos mesmos neurônios de diferentes indivíduos.

Abstract

M osaic uma nálise com um r epressible c ell m arker (marcm) é um sistema de rotulagem mosaico positivo que tem sido amplamente aplicado em estudos neurobiológicos Drosophila para descrever morfologias intrincadas e de manipular a função de genes em subconjuntos de neurônios dentro de outra forma não marcado e imperturbável organismos. mosaicos genéticos gerados no sistema marcm são mediadas através de recombinação específica do local entre os cromossomas homólogos dentro de divisão de células precursoras para produzir ambos os clones (marcm) marcados e não marcados células filhas durante a mitose. Uma extensão do método marcm, chamado duplo-spot marcm (tsMARCM), etiquetas, tanto das células individuais derivadas de um antepassado comum com duas cores distintas. Esta técnica foi desenvolvida para permitir a recuperação da informação útil a partir de ambos os hemi-linhagens. Por abrangente análise de diferentes pares de clones tsMARCM, o sistema permite tsMARCM de alta resolução mappin linhagem neuralg para revelar o nascimento-ordem exacta dos neurónios marcados produzidos a partir de células progenitoras comuns. Além disso, o sistema também se estende tsMARCM estudos de função do gene, permitindo a análise fenotípica de neurónios idênticas de diferentes animais. Aqui, descrevemos como aplicar o sistema tsMARCM para facilitar estudos sobre o desenvolvimento neural em Drosophila.

Introduction

O cérebro, composta por um vasto número e diversos tipos de neurônios, dota animais com a capacidade de perceber, processar e responder aos desafios do mundo externo. Os neurónios do adulto de Drosophila cérebro central são derivados a partir de um número limitado de células estaminais neurais, chamados neuroblastos (RN), durante o desenvolvimento ^{1, 2.} A maioria dos RN participando de neurogênese cerebral em Drosophila sofrem divisão assimétrica para gerar RN auto-renovação e células-mãe gânglio (GMCS), e os GMCs seguida, passar por outra rodada de divisão para produzir duas células-filhas que se diferenciam em neurónios ³ (Figura 1A ). Devido à complexidade da morfologia neuronal e os desafios associados com a identificação de neurônios específicos, uma tecnologia positiva rotulagem mosaico, análise de mosaico com um marcador de células reprimível (marcm), foi inventada para permitir que o visualizatião de um único neurónio, ou um pequeno subconjunto de neurónios para fora da população de neurónios não marcados circundantes, ^4.

Marcm utiliza o sistema / alvo de reconhecimento da FLP (FRT) para mediar a recombinação específica do local entre os cromossomas homólogos dentro de uma célula precursora divisória transportando um alelo heterozigoto de um gene repressor, cuja expressão normalmente inibe a expressão de um gene repórter ⁴ flipase (FLP). Após a divisão mitótica, os cromossomas recombinantes são segregadas em células individuais, de modo a que uma célula contenha alelos homozigóticos do gene repressor e a outra célula não tem gene do repressor de expressão do repórter em que a célula (e seus descendentes) não é mais bloqueadas ^4. Três padrões clonais são normalmente encontrados em um experimento marcm quando FLP é estocasticamente induzida em RNs ou GMCs: clones de uma única célula e dois de células-GMC, que retratam a morfologia neuronal na Resolução de uma única célulan, e multi-celular-NB clones, que revelam padrões morfológicos inteiras de neurônios derivados de um NB comum (Figura 1B). A técnica marcm tem sido amplamente aplicado em estudos neurobiológicos Drosophila, inclusive na identificação do tipo neuronal para reconstruir redes de fiação em todo o cérebro, a linhagem neural análises para revelar a história do desenvolvimento dos neurônios, caracterização fenotípica das funções dos genes envolvidos na especificação do destino celular e morfogênese neuronal e diferenciação estuda ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Porque marcm convencional única de etiquetas uma das duas células filhas (e linhagens) após o evento mitótico recombinação induzida, informações potencialmente úteis a partir do lado não marcado está perdido. Esta limitação se opõe à aplicação do M básicaSistema ARCM a de alta resolução análises de muitas linhagens neuronais que mudar destinos celulares em tempo rápido ou precisão análises de funções de genes em neurônios idênticas de diferentes animais ^{11, 12.}

Cama local marcm (tsMARCM) é um sistema avançado que rotula neurónios derivados a partir de um antepassado comum com duas cores distintas, o que permite a recuperação de informação útil a partir de ambos os lados das células individuais, superando assim a limitação do sistema marcm inicial ¹¹ ( Figura 2A - 2C). No sistema tsMARCM, dois interferência de RNA (RNAi) -based eliminadores estão situados em locais de trans-cromossomas homólogos dentro de uma célula precursora, e a expressão dessas supressores independentemente inibir a expressão dos respectivos repórteres (Figura 2B). Na sequência específica do local recombinações mitóticas mediada através do sistema FLP / FRT, a twsupressores S baseado em RNAi ser segregados em células individuais para permitir a expressão dos repórteres distintos (Figura 2B). Dois padrões clonais, de uma única célula associada a clones de uma única célula e de duas células-GMC associados com clones multi-celular-NB, são tipicamente vistos em um experimento tsMARCM (Figura 2C). Informação derivada a partir de um lado das células individuais podem ser utilizados como a referência para o outro lado, permitindo-alta resolução analisa linhagem neural, tais como-datado de nascimento os neurónios marcados, e analisa fenotípica de neurónios idênticas em diferentes animais para a investigação exacta da função do gene neural ^{11, 12.} Aqui, nós apresentamos um protocolo passo-a-passo que descreve como realizar uma experiência tsMARCM, que pode ser utilizado por outros laboratórios para alargar os seus estudos de desenvolvimento neural (bem como o desenvolvimento de outros tecidos, se aplicável) em Drosophila.

Protocol

1. Construir tsMARCM pronto Flies Usando o Requerido transgenes ^{11, 13}

1. Gerar a versão original de moscas tsMARCM-prontos de transgenes que são transportadas por moscas individuais ¹¹ (ver Tabela 1). Realizar esquemas de passagem padrão mosca genéticos, que foram descritas anteriormente, colocando vários transgenes nas mesmas populações de moscas ^13.
   1. Em uma linha progenitora, montar os transgenes de FRT ^40A, UAS-mCD8 :: GFP (o primeiro repórter, mCD8 :: GFP; a expressão do transgene está sob o controlo do promotor da sequência de activação a montante, que produz um repórter membrana-tethered aglomerado de diferenciação de rato 8 proteína de fusão com a proteína verde fluorescente), e UAS-rCD2RNAi (o supressor que inibe a expressão do segundo repórter; o ARNi contra a expressão do cluster do rato of diferenciação 2, rcd2) no braço esquerdo do cromossoma 2 ^nd. Lugar, colocar -GAL4 condutor no X ou 3 ^rd cromossoma, se possível, específico do tecido.
   2. No outro lado da linha parental, montar os transgenes de FRT ^40A, UAS-rCD2 :: RFP (o segundo repórter, rCD2 :: RFP, o outro repórter membrana-tethered consistindo de proteína rCD2 fundida com a proteína fluorescente vermelha) e UAS-GFPRNAi (o supressor que inibe a expressão de GFP mCD8 ::; a de ARNi contra a expressão de GFP) no braço esquerdo do cromossoma 2 ^nd. Coloque-choque térmico (hs) -FLP ou FLP tecido especificidade no X ou 3 ^rd cromossomo, se possível.
2. Gerar a nova versão de moscas tsMARCM-prontos de transgenes que são transportadas por moscas individuais ¹⁴ (ver Tabela 1). Realizar genética da mosca esquemas de passagem de padrão, que foram descritos Previously, colocando vários transgenes nas mesmas populações de moscas ^13.
   1. Em uma linha progenitora, montar os transgenes de um local DRF e UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (um transgene combinada de mCD8 :: GFP e o supressor que inibe a expressão de rCD2 :: RFP) juntos no mesmo braço de ^2º ou ^3º cromossoma (pares apropriados de transgenes de FRT e UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i são indicados na Tabela 1). Coloque condutor tecido-específicos por GAL4 em outras do que o cromossoma do local DRF escolhido, se possível cromossomas.
   2. No outro lado da linha parental, montar os transgenes de um local DRF e UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (o outro transgene combinada de rCD2 :: RFP e o supressor que inibe a expressão de mCD8 :: GFP) no mesmo braço do ^2º ou ^3º cromossómicas (pares apropriados de transgenes de FRT UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi são indicados na Tabela 1). Coloque HS-FLP ou tecido-específicos de FLP em diferentes do cromossoma do local DRF escolhido, se possível cromossomas.

2. Cruz tsMARCM pronto voa para gerar tsMARCM Clones na sua descendência

1. Moscas Cruz tsMARCM-prontos juntos (por exemplo, colocar 10-15 moscas macho do passo 1.1.1 ou 1.2.1 e 20-30 fêmea virgem voa a partir do passo 1.1.2 ou 1.2.2 juntos) num frasco de fly-food com fresco pasta de levedura-made na parede do frasco.
2. Manter as moscas tsMARCM-prontos cruzadas a 25 ° C durante 2 dias para aumentar a probabilidade de acoplamento, antes de recolher ovos fertilizados.
3. transferir frequentes as moscas tsMARCM-prontos cruzados em frascos recém-Yeasted para evitar aglomeração (toque para baixo as moscas ou usar o dióxido de carbono para anestesiar as moscas para facilitar a transferência, manter não mais do que 80-100 ovos fertilizados em 10 mL fly-food vial para evitar demasiadas larvas eclodidas).
4. Culturas os animais tsMARCM (isto é, ovos fertilizados; um exemplo do genótipo de animais tsMARCM, como utilizados na Figura 3, é Hs-FLP ^[22], W / W; UAS-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT ^40A , GAL4-GH146 / UAS-rCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT ^40A; +; +) que foram colocados em frascos transferidos em série a 25 ° C até que elas se desenvolvem para a fase desejada (por exemplo, embriões, larvas, ou pupas).
5. Colocar os tubos transferidos que contêm animais tsMARCM no mesmo estágio de desenvolvimento para uma temperatura de 37 ° de banho C água para 10, 20, 30, 40, e 50 minutos para determinar o tempo óptimo de choque térmico que induz a expressão de FLP para gerar o clones tsMARCM de interesse. Pule esta etapa se FLP tecido especificidade está sendo usado no experimento tsMARCM (é preferível hs-FLP para a linhagem neural analisa; as razões para esta preferência foram previamente descritos ¹⁵).
   NOTA: Repita o passo 2,5 utilizando o tempo ideal de choque térmico em futuras experiências tsMARCM se mais clones tsMARCM de interesse são procurados; Geralmente, mais de expressão de FLP é induzida em HS-FLP ^[22] em comparação com HS-FLP ^[1] com o mesmo tempo de choque de calor.
6. Cultura dos animais chocados ao calor tsMARCM a 25 ° C até que tenham atingido o estágio de desenvolvimento apropriado e, em seguida, vá para a etapa 3.

3. Prepare-se, Stain, e cérebros Mount Fly Contendo tsMARCM Clones

1. Preparar pratos forceps de proteção. Misture parte A (30 g) e a parte B (3 g) do Kit de Elastómero de Silicone com carvão activado (0,25 g). Despeje a mistura em pratos adequados.
2. Dissecar larvas, pupas, ou cérebros adultos fora dos animais tsMARCM em 1X solução salina tamponada com fosfato (PBS) utilizando uma pinça sobre um prato de pinças-protecção visto através de um microscópio de dissecção. NOTA: Um protocolo para dissecção mosca cérebro tem sido descRiBED anteriormente ^16.
3. Fixar os cérebros voar em uma placa de ponto de vidro com 1x de PBS contendo 4% de formaldeído à temperatura ambiente durante 20 min. Processar os cérebros voar neste placa de ponto de vidro para o restante das etapas.
4. Lavar os cérebros mosca três vezes com 1% de PBT (1x PBS contendo 1% de Triton X-100) e lava-se três vezes durante 30 minutos cada um em 1% de PBT (enxaguar: remover PBT e adicionar novo PBT rapidamente; lavar: remover PBT, adicionar novos PBT, e incubar os cérebros da mosca no novo PBT utilizando um agitador orbital).
5. Incubar os cérebros voar com a mistura de anticorpos primários durante a noite a 4 ° C ou durante 4 h à temperatura ambiente. Um exemplo da mistura dos anticorpos primários é o anticorpo de rato anti-CD8 (1: 100), anticorpo de coelho anti-DsRed (1: 800), e o anti-anticorpo de ratinho Bruchpilot (Brp) (01:50) em 1% de PBT contendo soro de cabra normal a 5% (NGS).
6. Lavar os cérebros mosca três vezes com 1% de PBT e, em seguida lavar três vezes durante 30 minutos cada um com 1% de PBT.
7. Lavar os cérebros mosca três vezes com 1% de PBT e, em seguida lavar três vezes durante 30 minutos cada um com 1% de PBT. Montá-los em um micro de slides com um reagente anti-têmpera. Coloque uma tampa de vidro micro no micro slide para cobrir e proteger o cérebro da mosca. Selar as bordas da lâmina de vidro tampa e micro micro usando unha polonês claro. Armazená-los montados e selados voar espécimes cerebrais a 4 ° C.

4. Tome-se, processar e analisar imagens fluorescentes de tsMARCM Clones

1. Capturar imagens fluorescentes de tsMARCM clones from as amostras criada no passo 3.8 utilizando o sistema de microscopia confocal de escolha.
2. Pilhas projeto de tsMARCM imagens fluorescentes confocal em bidimensional, achatada imagens usando o software de processamento de imagem fornecido com o sistema de microscopia confocal de escolha (ver Figura 3B - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O e 3T - 3T para exemplos de achatada imagens fluorescentes confocal).
3. Contar o número de células dos lados multicelular-NB dos clones tsMARCM utilizando um software de processamento de imagem apropriado (por exemplo, a função "celular counter" no ImageJ ^17; ver Figura 3E, 3J, 3O, e 3T para exemplos da célula corpos de neurônios).

Representative Results

O sistema tsMARCM tem sido usado para facilitar a linhagem neural análises e estudos da função gênica por recuperar informações importantes sobre os neurônios derivados do RN comuns. O sistema tem sido utilizado para identificar a maioria (se não todos) os tipos neuronais, determinar o número de células de cada tipo neuronal, e determinar a ordem de nascimento desses neurônios ^{11, 12, 18} (ver a seção de discussão para mais detalhes sobre o uso tsMARCM para conduzir linhagem neural análises ou estudos da função do gene). Aqui, usamos quatro clones tsMARCM de neurônios olfativos ântero-dorsal de projeção (adPNs na linhagem neural ALad1 do sistema olfativo Drosophila) marcado com GAL4-GH146 como exemplos para ilustrar como conduzir um experimento de tsMARCM ^{1, 2.} Após expressão de FLP foi induzida na fase embrionária, uma Single, verde VL2p adPN associada com 45 adPNs magenta foi detectado em um clone tsMARCM (Figura 3A - 3E). Em contraste, quando FLP foi induzida depois, em diferentes estágios larvais, adPNs individuais verdes (DL1 adPN ou DC3 adPN) ou no-GH146 + adPNs associado com diferentes números de adPNs Magenta (31, 21, ou 15) foram observados em três outros tsMARCM clones (Figura 3F - 3T). O nascimento de VL2p adPNs antes do nascimento de DL1-, DC3- e não-GH146 + -adPNs foi determinada por contagem dos números de células de adPNs nos seus lados multicelular-NB associadas dos clones tsMARCM (45, 31, 21, e 15 na Figura 3E, 3J, 3O, e 3T, respectivamente). Além disso a contagem do número de células, a complexidade do axonal e padrões dendríticas nos lados multicelular-NB dos clones tsMARCM pode ser utilizado para determinar a ordem de nascimento em relação dos seus lados associados de duas células-GMC daclones tsMARCM. Clones mosaico induzidos em estágios iniciais de desenvolvimento normalmente contêm mais neurônios e, portanto, têm axonal mais complexo e padrões dendríticas, enquanto clones mosaico induzidos em estágios de desenvolvimento final contêm menos neurônios e, portanto, têm padrões axonais e dendríticas menos complexos (Figura 3C - 3D, 3H - 3I , 3M - 3N, e 3R - 3S).

Figura 1: ilustrações esquemáticas de Drosophila neurogénese e os três tipos de padrões clonais encontrados numa experiência marcm. (A) A ilustrando neurogênese diagrama esquemático em linhagens mais neurais do cérebro central Drosophila: neuroblastos (RN) submetidos a uma divisão assimétrica para gerar RN auto-renovação e células-mãe gânglio (As GMC), e GMCs dividem mais uma vez para produzir dois neurónios filha (NE). (B) três padrões clonais são observados numa experiência marcm: clones de uma única célula (a), quando flipase (FLP) é induzida em GMCs, e os clones de duas células-GMC (b) e os clones multicelular-NB (C ), quando FLP é induzida na RN. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Diagramas esquemáticos do sistema tsMARCM. (A) moscas tsMARCM-READY: uma mosca parental contém transgenes de um local DRF e UAS-mCD8 :: GFP (o primeiro repórter), UAS-rCD2RNAi (o primeiro supressor que inibe a expressão do segundo repórter), e um tecido espec�ico -GAL4; a outra mosca parental contém um FRT UAS-rCD2 :: RFP (o segundo repórter), UAS-GFPRNAi (o segundo supressor que inibe a expressão do primeiro repórter), e HS-FLP. (B) A presença dos dois supressores baseados em RNAi na descendência das moscas tsMARCM-prontos cruzados inibe a expressão de repórteres (ou seja, mCD8 :: GFP e rCD2 :: RFP nas fases G1 e G2 do painel B). A expressão de FLP é induzido por choque térmico, e em seguida, FLP medeia a recombinação específica do local de cromossomas homólogos dentro de uma célula precursora de divisão por ligação a alvos de reconhecimento da FLP (FRT). Isto resulta na segregação dos supressores baseados em RNAi nas células individuais após a divisão mitótica para permitir a expressão dos repórteres distintas. (C) Dois padrões clonais são observados numa experiência tsMARCM: de uma única célula, associado com os clones de uma única célula (um) quando é induzida em FLP GMCs, e de duas células-GMC, associada com os clones multicelular-NB(B) quando FLP é induzida na RN. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Usando quatro clones tsMARCM de adPNs como exemplos de como conduzir um experimento de tsMARCM em uma análise de linhagem neural. Quatro clones de tsMARCM adPNs são ilustrados, com diagramas dos seus padrões de neurogénese (A, F, K, P e); imagens confocais de cérebro total (B, G, L e Q), que mostra o corno lateral (LH; C, H, M, e R), o lobo antenal (AL; D, I, N, e S) e a soma(E, J, S e T); e os padrões de suas morfologias neuronais. adPNs individuais (VL2p, DL1, DC3, e não-GH146 + adPNs; verde) associados com multicelular-NB adPNs (magenta) dos clones tsMARCM foram derivados pela indução de FLP para mediar recombinação mitótica na adPN NB no embrionário (A - e) e larvas - fases (F T). Note-se que adPNs são um dos hemi-linhagens na linhagem neural ALad1, o que resulta em clones tsMARCM de um único adPN, verde associada com adPNs magenta na Figura 3 (por razões desconhecidas, os neurónios do outro hemi-linhagem da neural ALad1 linhagem de matriz). A ordem de nascimento de VL2p, DL1, DC3, e não-GH146 + adPNs foi determinada por contagem dos números de células de adPNs nos lados magenta multicelular-NB dos clones tsMARCM (45, 31, 21, e 15 no tracejado linhas de painéis E, J, O e T). Os padrões de neuritos são geralmente mais complexos nos lados magenta multicelular-NB quando os clones tsMARCM são induzidas nas fases iniciais do desenvolvimento (por exemplo, o padrão dendrítico é mais complexa no painel E em comparação com painéis de I, N, e S). analisa tsMARCM são por vezes confuso quando os neurônios de outras linhagens neurais também são rotulados pelo condutor mesma GAL4 (por exemplo, os neurônios LH verdes, mostradas por setas duplas, obstruir a visualização do padrão elaboração axonal dos adPNs VL2p em painéis B e C) . neuropiles cerebrais (em azul) foram coradas com anticorpo contra Bruchpilot (Brp). Tempo de choque térmico: 12 min (painéis A - E), 15 min (painéis F - J), e 35 min (painéis K - T). Barra de escala em painéis B - G - J, L - Ó, e Q - S = 10 uM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Passos críticos dentro do Protocolo

Passos 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5, e 3.2 são críticos para a obtenção de bons resultados tsMARCM. Condutores -GAL4 específicos de tecidos que não expressam GAL4 em progenitores neurais são preferidos para os passos 1.1.1 e 1.2.1. Evitar o excesso de aglomeração dos animais cultivadas em frascos fly-alimentares no passo 2.3. Porque a latência de indução, o nível de expressão de FLP após a choque térmico, e o tempo médio de divisão de progenitores neuronais (isto é, RN e gmcs) não são conhecidos, é melhor para variar o tempo de choque de calor (10, 20, 30 , 40, e 50 min) em diferentes amostras do mesmo genótipo e fase de desenvolvimento no passo 2.5. Isto irá permitir a determinação do tempo de choque de calor óptima, a fim de obter a melhor relação de clones tsMARCM de interesse. Além disso, tenha cuidado durante a dissecção mosca cérebro no passo 3.2, a fim de obter amostras cerebrais intactas; isto é crucial para contar com precisão o número de células neuronais. para researqueiros que estão interessados em usar tsMARCM para estudar a função de genes em outros braços cromossômicos (por exemplo, 2R, 3L e 3R), moscas tsMARCM-prontos deve ser montado como no passo 1.2, escolhendo os pares adequados de transgenes de FRT, UAS- mCD8.GFP.UAS-rCD2i, e UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi, que são indicados na Tabela 1. Também recomendamos que as moscas tsMARCM-pronto do sexo feminino realizar hs-FLP no cromossomo X (por exemplo, hs-FLP ^[22], w; UAS-rCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT ^40A; +; +), que facilita experiências tsMARCM repetidas.

Modificações, solução de problemas e limitações da técnica

A eficiência e perdurance de supressores e repórteres RNAi são os principais determinantes para se analisa linhagem neural e estudos da função do gene pode ser realizada com sucesso em experimentos tsMARCM. Em geral, a combinação de baixa perdurance de supressores de ARNi erepórteres derivados de progenitores neurais, juntamente com a elevada expressão de supressores e repórteres de RNAi em neurônios pós-mitóticas, permite melhores resultados tsMARCM. Porque a expressão de supressores e repórteres RNAi é controlado por motoristas GAL4, os pesquisadores devem selecionar os drivers GAL4 fortes que expressam GAL4 em neurônios diferenciados, mas não em células progenitoras neurais. Por exemplo, GAL4-OK107 é um condutor de GAL4 forte que expressa GAL4 no corpo de cogumelo (MB) progenitores e seus derivados, γ MB, α '/ β', e a / p neurónios ^{11, 19.} Rotulagem infiel do MB neurónios y tem sido observada em dois padrões clonais (ou seja, de uma única célula associada com os clones de uma única célula e dois de células-GMC associados com clones multicelular-NB) quando GAL4-OK107 foi usada em experimentos tsMARCM ¹¹ . Curiosamente, o problema acima pode ser resolvido usando MB247-GAL4, um controlador MB GAL4 diferenteGAL4 que expressa em neurónios diferenciados MB ^11.

Nem todos os controladores de GAL4 pode ser utilizado no sistema de tsMARCM ou em outros sistemas de etiquetagem mosaico (por exemplo, marcm, Q-marcm, e gerador de duplo ponto) ^{4, 20, 21,} se o condutor não é expressa nos neurónios de interesse. Portanto, antes de usar tsMARCM para a linhagem neural análises, os motoristas GAL4 devem ser testados para a sua cobertura dos neurônios de interesse na marcm-expressão dual-control com um motorista de células pan (por exemplo, promotor-LexA tubulina :: GAD) ²² . Notamos que clones tsMARCM, por vezes, não pode ser analisado de forma inequívoca, especialmente quando um driver GAL4 com um padrão complexo expressão neural é usada (por exemplo, corno lateral verde (LH) neurônios impedir a visualização clara do padrão de elaboração axonal do VL2p adPN na Figura 3B e (por exemplo, marcm, Q-marcm e gerador de twin-spot) ^{4, 20, 21,} porque a limitação se origina com o driver GAL4. Observamos também que, para realizar experimentos de resgate para a autenticação de funções de genes, os transgenes de resgate deve ser projetado com as sequências alvo dos supressores de RNAi em 5 'ou 3' não traduzidas dos construtos de resgate transgênicos, ou um gêmeo local alternativo sistema de rotulagem (por exemplo, juntamente marcm, uma combinação de Q-marcm e marcm convencional) ²¹ devem ser adoptadas.

Importância da Técnica em Matéria de Existentes / Métodos Alternativos

Além tsMARCM, gerador duplo-spot e marcm acoplado também, pelo menos em teoria, permitir a visualização deneurônios derivados de progenitores neurais comuns em duas cores distintas (uma comparação dessas três tecnologias de rotulagem mosaico foi apresentado anteriormente ^15). O número mínimo de transgenes necessários para a montagem do gerador twin-ponto, a versão original do tsMARCM (ou a nova versão do tsMARCM) e marcm acoplado é de 4, 8 (ou 6), e 9, respectivamente. No entanto, tsMARCM é o único sistema que tem sido utilizado para realizar análises linhagem neuronal global ^{12, 15, 18, 23.} a recombinação específica do local ocorrer em células não mitóticas no sistema gerador de duplo-ponto, e isto leva à co-expressão de dois repórteres na mesma célula, tornando-o difícil de usar este sistema para estudar o desenvolvimento do centro sistema nervoso ^15. Em contraste, os clones obtidos de mosaico na tsMARCM e sistemas acoplados um marcmre derivada a partir de células mitóticas. No entanto, porque o sistema marcm acoplado requer dois pilotos independentes para controlar a expressão dos diferentes repórteres na sistemas marcm convencionais Q-marcm e, isto levanta preocupações sobre a rotulagem de neurônios derivados de progenitores neurais comuns se os dois motoristas independentes não fielmente rotular os mesmos neurônios em linhagens neuronais de interesse ^15.

Aplicações futuras ou chegar após dominar a técnica

Usando tsMARCM para conduzir análises de linhagem neural de alta resolução
Ao aplicar a abordagem utilizada na Figura 3 para analisar sistematicamente clones tsMARCM de adPNs, 40 tipos de adPNs, com um total de 82 neurônios, foram identificados em um estudo anterior ^12. Entre estes 40 tipos de adPNs, 35 foram adPNs uni-glomerular (isto é, que inervam um único glomérulo no lobo antenal (AL)), que relay informação olfativa para outras regiões do cérebro Drosophila ¹² (ver As Figuras 2-4 em Yu et al., 2010). Os outros cinco tipos de adPNs foram adPNs poli-glomerular (ou seja, que inervam múltipla glomérulos no AL), o que poderia integrar informação olfativa do AL e fornecer um nível adicional de complexidade funcional para o sistema olfativo ¹² (ver Figuras 3E-3H e 4Z em Yu et al., 2010). AdPNs-nascido embrionárias tem apenas um neurônio por tipo, enquanto adPNs larvais-nascido são representados por vários neurônios por tipo, sugerindo que não há interação entre especificidade e redundância no sistema olfativo ¹² (ver Figuras 2-4 em Yu et al., 2010). Curiosamente, os neurônios produzidos dentro de determinados janelas de desenvolvimento estão destinados a morrer, e muitos tipos de adPNs são encontrados com um número fixo de neurônios na linhagem neural ALad1, sugerindo que o number e tipos de adPNs para a montagem do sistema olfativo são fortemente regulamentadas ¹² (ver Figuras 2H, 4V, e 5 em Yu et al, 2010;. Também veja a Figura 3P - 3T).

Usando tsMARCM para um estudo minucioso funções de genes
Além nascimento namoro adPNs, tsMARCM também tem sido aplicada para determinar a ordem de nascimento de seis neurônios complexas centrais rotulados por GAL4-OK107. Estes seis neurónios fazer-se um pequeno subconjunto de neurónios na linhagem neural LALv1 que contribuem para o circuito do complexo central de Drosophila para controlar os padrões intrincados de motor ^{2, 11} (ver Figura 4A e 4B, em Yu et al., 2009). Interessantemente, cada um destes seis neurónios centrais complexos possui uma distinta morfologia neuronal ¹¹ (ver Figura 4D-4H 4o e em Yu et al., 2009). Todos eles transportar padrões distintos axonal no final dos anoslobo acessório ral (LAL). Os primeiros quatro neurónios distribuir suas dendrites de sub-compartimentos do noduli, uma sub-estrutura central, do complexo, ao passo que os restantes dois neurónios projectam as suas dendrites ao corpo elipsóide, um outro sub-estrutura do complexo central. Especificamente, o ^3º -born neurônio complexo central, projeta suas dendrites aos noduli ventral, com um padrão axonal compacto na LAL, enquanto o ^4º -born neurônio complexo central distribui seus dendritos ao noduli dorsal, com um padrão axonal amplo a LAL ¹¹ (veja a Figura 4F e 4G no Yu et al., 2009).

Além neurônios abrangente de identificação, o poder de tsMARCM seria melhor exemplificada através do estudo das funções dos genes em neurônios de interesse, uma vez que o sistema tsMARCM permite uma melhor fenotípica análises, permitindo o exame de neurônios idênticos em diferentes animais. Por exemplo, tsMARCM detecta uma única gordura temporaise mudança que requer cronologicamente inadequado morfogênese (chinmo, uma proteína nuclear dedo BTB-zinco) no ^3º -born neurônios complexas centrais ¹¹ (veja a Figura 4i, 4p, e 4W em Yu et al., 2009). Se a mutação chinmo tinha sido caracterizado por o sistema original marcm (isto é, neurónios simples marcado com verde, sem a rotulagem de neurónios derivados dos lados associados das células individuais como referência), o chinmo neurónio -deficient mostrado na Figura 4i de Yu et al. De 2009 teria sido identificado erroneamente como o ^4º -born, ao invés do ^3º -born, neurônio complexo central. Isso teria resultado na má interpretação da função chinmo como controlar a orientação axonal em vez de especificar o destino temporal, ¹¹ (seta dupla na Figura 4i de Yu et al., 2009). No entanto, usando os lados magenta multicelular-NB de clones tsMARCM como the de referência (por contagem do número de células em Figura 4m, 4n, 4p e de Yu et al. , 2009), o neurónio -deficient chinmo mostrado na Figura 4i de Yu et al. , 2009) foi provado ser neurônio complexo central, o ^3º -born, que, portanto, levou à conclusão correta que chinmo funções na especificação destino temporais para os neurônios complexas centrais ^11. Tomados em conjunto, os resultados acima destacar as vantagens importantes do sistema tsMARCM para de alta resolução análises fenotípica, assim, revelar com precisão as funções dos genes em neurônios (ou outros tipos de células, se for o caso) para futuros estudos de desenvolvimento neural (ou os estudos de desenvolvimento de outros tecidos).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon dioxide (CO2)	Local vendor	n.a.	Anesthetize flies
CO2 pad	Local vendor	n.a.	Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (or other vendors)	PBS001	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fix fly brains
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody	Invitrogen	MCD0800	Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody	Clonetech	632496	Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent	Molecular Probes	S36936	Mount fly brains and protect quenching of fluorescence
PYREX 9 depression glass spot plate	Corning	7220-85	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments	SYLG184	Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	242276-250G	Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30	Dissect and mount fly brains
Micro slide	Corning	2948-75x25	Mount fly brains
Micro cover glass No. 1.5	VWR International	48366-205	Mount fly brains
Nail polish	Local vendor	not available	Seal micro cover glass on micro slides
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	culture flies at 25 °C
(or other vendors)
Water bath	Kansin Instruments	WB212-B2	Induce heat-shock in flies at 37 °C
(or other vendors)
Orbital shaker	Kansin Instruments	OS701	Wash and immunostain fly brains
(or other vendors)
Dissection microscope	Leica	EZ4	Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope	Zeiss (or other vendors)	LSM 700 (or other models)	Image tsMARCM clones
image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	not available	Project stacks of confocal images
image-processing software 2 (e.g., ImageJ)	not available	not available	Count cell number of tsMARCM clones