Сотовый Lineage Анализы и функции генов исследований с использованием Twin-спот MARCM

Summary

Здесь мы приводим протокол для мозаичной техники маркировки, которая позволяет визуализировать нейронов, полученных из общей клетки-предшественника в двух различных цветах. Это облегчает нейронную анализ клонов с возможностью рождения-знакомства отдельных нейронов и изучения функции гена в одних и тех же нейронов разных людей.

Abstract

M osaic в НАЛИЗ с г epressible с ELL м arker (MARCM) является положительным система маркировки мозаики, которая широко применяется в Drosophila нейробиологических исследований , чтобы изобразить сложные морфологию и манипулировать функции генов в подмножества нейронов в противном случае без опознавательных знаков и невозмущенной организмы. Генетические мозаики, генерируемые в системе MARCM опосредуется через сайт-специфической рекомбинации между гомологичными хромосомами в пределах деления клеток-предшественников, чтобы производить как отмеченные знаком (MARCM клоны) и немаркированные дочерние клетки во время митоза. Расширение метода MARCM, называемый твин-спот MARCM (tsMARCM), этикетки и сдвоенных клеток, полученных от общего предка с двумя разными цветами. Этот метод был разработан для того, чтобы извлекать полезную информацию из обоих Hemi-родословных. Путем всестороннего анализа различных пар tsMARCM клонов, система tsMARCM позволяет высокого разрешения нейронального происхождения MAPPINг выявить точное порядка рождения меченых нейронов, полученных из обычных клеток-предшественников. Кроме того, система tsMARCM также расширяет исследования функции гена, позволяя фенотипический анализ идентичных нейронов различных животных. Здесь мы опишем , как применять систему tsMARCM , чтобы облегчить изучение развития нервной системы у дрозофилы.

Introduction

Мозг, состоящий из огромного количества разнообразных и типов нейронов, жертвует животных со способностью воспринимать, обрабатывать и реагировать на вызовы от внешнего мира. Нейроны взрослого Drosophila центрального мозга получают из ограниченного количества нервных стволовых клеток, называемых нейробласты (NBS), в течение развития ^{1, 2.} Большинство НБС участвующих в нейрогенез головного мозга у дрозофилы проходят асимметричное деление для генерации самообновляющихся NBS и ганглий материнские клетки (GMCS), и GMCs затем пройти через еще один раунд разделения , чтобы произвести две дочерние клетки , которые дифференцируются в нейроны ³ (рис 1А ). Из-за запутанности нейронного морфологии и проблемы, связанные с определением конкретных нейронов, положительно мозаичную технологии маркировки, мозаика анализ с репрессируемый клеток маркером (MARCM), был изобретен для того, чтобы visualizatион одного нейрона или небольшой группы нейронов из популяции окружающих, немеченых нейронов ^4.

MARCM использует флиппазы (FLP) / ФЛП целевой системы распознавания (FRT) посредничать сайт-специфической рекомбинации между гомологичными хромосомами внутри клетки - предшественника разделяющая несущего гетерозиготную аллель гена репрессора, экспрессия которого обычно ингибирует экспрессию гена - репортера ^4. После того, как митотического деления, рекомбинантные хромосомы разделены на близнецов клетки, таким образом, что одна клетка содержит гомозиготные аллели гена репрессора и другая ячейка не имеет репрессор гена-экспрессию репортера в этой ячейке (и его потомков) больше не является ⁴ заблокирован. Три клоновых узоры обычно встречаются в MARCM эксперименте, когда ФЛП стохастически индуцируется в NBS или ГМО: одноклеточные и двухкамерные-GMC клоны, которые изображают нейронную морфологию в одноклеточных Resolutioп, и многоклеточные-NB клонов, раскрывающие целые морфологические закономерности нейронов , происходящих от общего NB (рис. 1В) Методика MARCM широко применяется в Drosophila нейробиологических исследований, в том числе в идентификации нейронов типа для реконструкции мозга по всей проводки сетей, нейронная линия анализа для раскрытия истории развития нейронов, фенотипической характеризации генов функций , участвующих в спецификации клеточных судеб, и нейронный морфогенез и дифференциация изучает ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Поскольку обычные MARCM только этикетки одну из двух дочерних клеток (и родословных) после индуцированного события митотической рекомбинации, потенциально полезной информации от немаркированной стороны теряется. Это ограничение исключает применение основного МСистема ARCM с высокой разрешающей способностью анализа многих нейронных линий , которые переключают клеточные судьбы в быстром темпе или точности анализа функций генов в одинаковых нейронов различных животных ^{11, 12.}

Twin-спот MARCM (tsMARCM) представляет собой развитую систему , которая маркирует нейроны , полученные от общего предка с двумя различными цветами, что делает возможным восстановление полезной информации с обеих сторон близнецов клеток, таким образом преодолевая ограничения исходной системы MARCM ¹¹ ( Фигура 2А - 2С). В системе tsMARCM, две РНК - интерференция (RNAi) основе супрессоры расположены в транс-сайтов гомологичных хромосом в клетке - предшественника, и экспрессию этих супрессоров независимо друг от друга ингибируют экспрессию соответствующих репортеров (Фигура 2В). После сайт-специфической рекомбинации митотического опосредованное через систему FLP / FRT, то ТВто RNAi основе супрессоры стали разделены на две односпальные клетки , чтобы разрешить экспрессию различных репортеров (рис 2В). Два клоновых модели, одноклеточные , связанные с одноклеточных клонах и двуклеточной-GMC , связанных с многоклеточным-NB клонов, как правило , рассматривается в эксперименте tsMARCM (рис 2C). Информация, полученная от одной стороны сдвоенных ячеек могут быть использованы в качестве ссылки на другую сторону, что позволяет с высокой разрешающей способностью анализов нейронального происхождения, такие как рождение датирующим меченых нейронов, и фенотипический анализ идентичных нейронов у различных животных для точного расследования нейронной функции гена ^{11, 12.} Здесь мы приводим протокол шаг за шагом , описывающий , как провести эксперимент tsMARCM, который может быть использован в других лабораториях , чтобы расширить свои исследования развития нервной системы (а также развитие других тканей, если это применимо) у дрозофилы.

Protocol

1. Построить tsMARCM готовый Мухи с использованием требуемой трансгенов ^{11, 13}

1. Сформировать оригинальную версию tsMARCM-готовых мух от трансгенов, которые выполняются отдельными мухами ¹¹ (таблица 1). Проведение стандартных генетических схем пересечения летать, которые были описаны ранее, путем ввода нескольких трансгенов в одних и тех же мух акций ^13.
   1. В одной родительской линии, собрать трансгены FRT ^40а, UAS-mCD8 :: GFP (первый репортер, mCD8 :: GFP, экспрессия трансгена под контролем промотора вверх по течению последовательности активации, которая производит мембранную-привязанными репортер кластера мыши дифференциации 8 белка , слитого с белком зеленого флуоресцентного) и UAS-rCD2RNAi (супрессора , который ингибирует экспрессию второго репортера, а RNAi против экспрессии кластера крысы Oе дифференциация 2, rcd2) на левой руке на 2 - ^й хромосомы. Место тканеспецифическая драйвер -GAL4 на X или 3 - ^й хромосомы, если это возможно.
   2. В другой родительской линии, собрать трансгены FRT ^40А, УАС-rCD2 :: RFP (второй репортер, rCD2 :: RFP, другая мембрана-привязи репортер , состоящий из rCD2 белка , слитого с красным флуоресцентным белком) и UAS-GFPRNAi (супрессор , который ингибирует экспрессию mCD8 :: GFP, а RNAi против экспрессии GFP) на левой руке на 2 - ^й хромосомы. Поместите теплового шока (ГВ) -FLP или тканевую-ФЛП на специфичность Х или 3 - ^й хромосомы, если это возможно.
2. Сформировать новую версию tsMARCM-готовых мух от трансгенов, которые выполняются отдельными мухами ¹⁴ (таблица 1). Проведение стандартных схем летать генетические пересечения, которые были описаны рreviously, путем ввода нескольких трансгенов в одних и тех же мух акций ^13.
   1. В одной родительской линии, собрать трансгены на сайте FRT и UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (комбинированный трансгеном mCD8 :: GFP и глушителем , который ингибирует экспрессию rCD2 :: RFP) вместе в одной руке 2 - ^й или 3 - ^й хромосомы (соответствующие пары трансгены FRT и UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i указаны в таблице 1). Поместите драйвер тканеспецифическая-GAL4 , отличных хромосому выбранного участка FRT, если это возможно хромосом.
   2. В другой родительской линии, собрать трансгены на сайте FRT и UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (другой комбинированной трансгеном rCD2 :: RFP и глушителем , который ингибирует экспрессию mCD8 :: GFP) в той же руке 2 - ^го или 3 - ^й хромосомы (соответствующие пары трансгены FRT УАС-rCD2.RFP.UAS-GFPi указаны в таблице 1). Место HS-FLP или тканеспецифическая-ФЛП на отличных хромосому выбранного участка FRT, если это возможно хромосом.

2. Крест tsMARCM готовых Мухи для генерации tsMARCM Клоны в их потомству

1. Кросс-tsMARCM готовые мухи вместе (например, положить 10-15 самцов мух от стадии 1.1.1 или 1.2.1 и 20-30 девственной самки мух от стадии 1.1.2 или 1.2.2 вместе) во флаконе-муха пищи со свежим -Made дрожжи пасты на стенке флакона.
2. Поддерживать скрещенные tsMARCM готовые мух при 25 ° С в течение 2-х дней, чтобы повысить шансы на спаривание до сбора оплодотворенных яиц.
3. Часто передавать скрещенные tsMARCM-готовые мух в свеже дрожжевого флаконы, чтобы избежать скученности (нажмите вниз мух или использовать углекислый газ обезболить мух для облегчения передачи; держать не более 80-100 оплодотворенных яиц в 10 мл FLY-пищи с помощьюл, чтобы избежать слишком много вылупившихся личинок).
4. Культура животных tsMARCM (т.е. оплодотворенные яйца; пример генотипа tsMARCM животных, используемый на рисунке 3, является HS-ФЛП ^[22], ж / д, УАС-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT ^40А , GAL4-GH146 / БАС-rCD2 :: ЗП, УАС-GFPRNAi, FRT ^40A + +) , которые были заложены в серийно передаваемых флаконах при температуре 25 ° с , пока они не развиваются до желаемых стадий (например, эмбрионов, личинок, или куколки).
5. Поместите переданные флаконы, которые содержат tsMARCM животных на той же стадии развития в ванну с 37 ° C водой в течение 10, 20, 30, 40 и 50 мин, чтобы определить оптимальное время теплового шока, который индуцирует экспрессию ФЛП для генерации tsMARCM клоны интерес. Пропустить этот шаг , если ткань-ФЛП специфичность используется в эксперименте tsMARCM (HS-ФЛП является предпочтительным для нейронной линии анализа, причины этого предпочтения были описаны ранее ¹⁵).
   Примечание: Повторите шаг 2,5, используя оптимальное время теплового шока в будущих экспериментах tsMARCM если больше tsMARCM клоны интерес хотели; как правило, более ФЛП экспрессия индуцируется в HS-FLP ^[22] по сравнению с ГВ-ЛПФ ^[1] с тем же время теплового шока.
6. Культура не в тепловому шоку tsMARCM животных при 25 ° С до тех пор, как они достигли соответствующего стадии развития, а затем перейти к шагу 3.

3. Подготовка, Пятно, и горы Fly Мозги Содержащие tsMARCM Клоны

1. Готовят блюда щипцов-защиты. Смешать части А (30 г) и части В (3 г) Kit силиконового эластомера с активированным углем (0,25 г). Вылейте смесь в соответствующие блюда.
2. Dissect личиночной, пупальный или взрослых мозги животных tsMARCM в 1X фосфатно-солевом буфере (PBS) с помощью щипцов на блюдо пинцеты защиты от рассматривании через микроскоп рассечение. Примечание: Протокол для рассечения муха мозга была убываниеribed ранее ^16.
3. Закрепить Муха мозги в стеклянной пластине с точечной 1X PBS, содержащего 4% формальдегида при комнатной температуре в течение 20 мин. Процесс Муха мозги в этой стеклянной пластине пятна на оставшуюся часть шагов.
4. Полоскание муха мозги три раза 1% PBT (1x PBS, содержащего 1% Тритон Х-100) и промойте их три раза в течение 30 минут каждый 1% PBT (полоскание: удалить PBT и добавлять новые PBT быстро, мыть: удалить PBT, добавить новый PBT и инкубировать муха мозги в новом ПБТ, используя орбитальный шейкер).
5. Выдержите Муха мозги со смесью первичных антител в течение ночи при 4 ° С или в течение 4 ч при комнатной температуре. Примером смеси первичных антител крысы анти-CD8 антител (1: 100), анти-кролик DsRed антитела (1: 800), и мышиное анти-Bruchpilot (Brp) антитело (1:50) в 1% PBT, содержащий 5% нормальной козьей сыворотки (NGS).
6. Промыть Муха мозги три раза с помощью 1% PBT, а затем промыть их три раза в течение 30 мин каждый с 1% PBT.
7. Промыть Муха мозги три раза с помощью 1% PBT, а затем промыть их три раза в течение 30 мин каждый с 1% PBT. Установите их на микро слайд с реагентом анти-закаливания. Положите микро покровного стекла на микро слайд, чтобы покрыть и защитить муха мозги. Печать края микро покровного стекла и микро слайд, используя ясный лак для ногтей. Храните эти смонтированы и запечатаны полететь образцов мозга при 4 ° С.

4. Возьмите, обработки и анализа флуоресцентных изображений tsMARCM Клонов

1. Захват флуоресцентных изображений tsMARCM клонов фром образцы, созданный на шаге 3.8 с помощью конфокальной микроскопии системы выбора.
2. Стеки Проектные tsMARCM конфокальной флуоресцентных изображений в двумерную, сплющенные изображения с помощью программного обеспечения для обработки изображений , поставляемый с конфокальной системой микроскопии выбора (см Рисунок 3B - 3E, 3G - 3J, 3л - 3О и 3 - й квартал - 3Т примеры сплющенные софокусные флуоресцентные изображения).
3. Подсчитайте количество клеток в многоклеточные-NB сторонах клонов tsMARCM с использованием программного обеспечения для обработки соответствующего изображения (например, функцию "Счетчик клеток" в ImageJ ^17, см Рисунок 3E, 3J, 3О и 3Т примеры клетки тела нейронов).

Representative Results

Система tsMARCM была использована для облегчения нейронального происхождения анализов и исследований функции генов путем извлечения важной информации о нейронов, происходящих от общих NBS. Система была использована для идентификации большинство (если не все) нейронные типы, определить число клеток каждого нейронного типа, а также установить порядка рождения этих нейронов ^{11, 12, 18} (смотрите обсуждение в разделе Подробные сведения об использовании tsMARCM для проводить нейронную родословие анализ или исследования функции генов). Здесь мы использовали четыре tsMARCM клонов передне обонятельных нейронов проекционных (adPNs в ALad1 нейронального происхождения системы обонятельной Drosophila) , меченных GAL4-GH146 в качестве примеров , чтобы проиллюстрировать , как проводить эксперимент tsMARCM ^{1, 2.} После того, как ФЛП экспрессию индуцируют на эмбриональной стадии, СИngle, зеленый VL2p adPN , связанный с 45 пурпурными adPNs был обнаружен в клон tsMARCM (Рисунок 3A - 3E). В противоположность этому, когда ФЛП индуцировали позже, на разных личиночной стадии, одиночные, зеленые adPNs (DL1 adPN или DC3 adPN) или не-GH146 + adPNs, связанные с различными числами пурпурного adPNs (31, 21, или 15) наблюдали в трех других tsMARCM клоны (рис 3F - 3T). Рождение VL2p adPNs до рождения DL1-, DC3- и не-GH146 + -adPNs определяли путем подсчета числа клеток из adPNs в связанных с ними многоклеточным-NB сторонах клонов tsMARCM (45, 31, 21, и 15 на рисунке 3Е, 3J, 3O и 3Т, соответственно). Помимо подсчета количества клеток, сложность аксонального и дендритные узоры в многоклеточным-NB сторонах клонов tsMARCM могут быть использованы для определения относительного порядка рождения ассоциированных с ними двухкамерные-GMC сторонахtsMARCM клоны. Мозаика клонов индуцированных на ранних стадиях развития , как правило , содержат больше нейронов и , таким образом , имеют более сложную аксонов и дендритных моделей, тогда как мозаичные клоны индуцированные на поздних стадиях развития содержат меньше нейронов и , следовательно , имеют менее сложные аксонов и дендритных шаблоны (рис 3C - 3D, 3H - 3I 3М - 3N и 3R - 3S).

Рисунок 1: Схема иллюстрации Drosophila нейрогенеза и трех типов клоновых узоров , найденные в эксперименте MARCM. (А) показана схема , иллюстрирующая нейрогенез в наиболее нейронными родословных центрального мозга дрозофилы: нейробласты (NBS) проходят асимметричное деление для генерации самообновлению NBS и ганглий материнские клетки (GMCs), и GMCs разделить еще раз, чтобы произвести две дочерние нейроны (н.с.). (B) Три клоновых модели наблюдаются в MARCM эксперименте: одноклеточные клоны (а), когда флиппазы (ФЛП) индуцируется в ГМО, и двухкамерные-GMC клоны (б) и многоклеточные-NB - клоны (с ), когда ФЛП индуцируется в НБС. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Принципиальные схемы системы tsMARCM. (А) tsMARCM-готовые мух: одна родительская муха содержит трансгены на сайте FRT и UAS-mCD8 :: GFP (первый репортер), UAS-rCD2RNAi (первый супрессор , который ингибирует экспрессию второго репортера), а также ткани -специфический -GAL4; другой родительской муха содержит FRT UAS-rCD2 :: RFP (второй репортер), UAS-GFPRNAi (второй супрессор , который ингибирует экспрессию первого репортера), и HS-ФЛП. (B) Наличие двух супрессоры RNAi основе в потомстве скрещенных tsMARCM-готовых мух ингибирует экспрессию репортеров (т.е. mCD8 :: GFP и rCD2 :: RFP в G1 и G2 фазах панели Б). Выражение ФЛП индуцируется теплового шока, а затем согласует ФЛП сайт-специфической рекомбинации гомологичных хромосом в клетке предшественника разделительную после связывания с ФЛП целей распознавания (FRTS). Это приводит к разделению RNAi основе громителей в сдвоенных клеток после митотического деления, чтобы обеспечить экспрессию различных репортеров. (C) Два клоновых модели наблюдаются в эксперименте tsMARCM: одноклеточных, связанный с одноклеточных клонов (а) , когда ФЛП индуцируется в ГМО, и двухкамерные-GMC, связанный с многоклеточным-NB клонов(Б) когда ФЛП индуцируется в НБС. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: С помощью четырех tsMARCM клонов adPNs в качестве примеров того , как провести эксперимент tsMARCM в нейроанализа ростка. Четыре tsMARCM клоны adPNs проиллюстрированы, с диаграммами их узоров нейрогенеза (A, F, К и Р); конфокальной образы общего мозга (B, G, L и Q), показывающий боковую рожок (LH; C, H, M, и R), усиков лопасть (AL, D, I, N и S) и сомы(Е, J, О и Т); и закономерности их морфологией нейронов. Одиночные adPNs (VL2p, DL1, DC3, и нет-GH146 + adPNs; зеленый), связанные с многоклеточным-NB adPNs (Magenta) клонов tsMARCM были получены путем индукции FLP посредничать митотическую рекомбинацию в adPN NB на эмбриональной (а - Е) и личиночные (F - T) стадии. Обратите внимание , что adPNs являются одним из Hemi-клонов в нейронального происхождения ALad1, что приводит к tsMARCM клонов одного, зеленого adPN , связанного с пурпурными adPNs на рисунке 3 (по неизвестным причинам, нейроны от другого полугидрата линии нервного ALad1 родословная умирают). Рождение порядка из VL2p, DL1, DC3 и не-GH146 + adPNs определяли путем подсчета числа клеток из adPNs в пурпурного многоклеточным-NB сторонах клонов tsMARCM (45, 31, 21 и 15 в пределах пунктирная линии панелей E, J, О и Т). Модели нейритов, как правило , более сложны в пурпурных многоклеточным-NB сторон , когда клоны tsMARCM наводятся на ранних стадиях развития (например, дендритные картина является более сложной в панели E по сравнению с панелями I, N и S). tsMARCM анализ иногда запутанным , когда нейроны других нервных линий также помечены драйвером же GAL4 (например, зеленые нейроны LH, показанные двойными стрелками, препятствовать визуализации аксонов шаблона разработки VL2p adPNs в панелях В и С) , Мозговые neuropiles (показаны синим цветом) окрашивали антителами против Bruchpilot (BRP). Время теплового шока: 12 мин (панели A - E), 15 мин (панели F - J) и 35 мин (панели K - T). Шкала бар в панели B - G - J, L - O и Q - S = 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Критические шаги в рамках Протокола

Шаги 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5, 3.2 и имеют решающее значение для получения хороших результатов tsMARCM. Тканеспецифические драйверы -GAL4 , которые не экспрессируют GAL4 в нервных клеток - предшественников являются предпочтительными для стадий 1.1.1 и 1.2.1. Избегайте чрезмерной скученности животных, выращиваемых в муху пищевых флаконах на этапе 2.3. Поскольку индукция задержка, уровень экспрессии ФЛП на тепловой шок, а среднее время деление нервных клеток - предшественников (например, NBS и GMCS) не известны, то лучше варьировать время теплового шока (10, 20, 30 , 40, и 50 мин) на различных образцах одного и того же генотипа и стадии развития на этапе 2.5. Это позволит для определения оптимального времени теплового шока для того, чтобы получить наилучшее соотношение tsMARCM клонов, представляющих интерес. Кроме того, будьте осторожны во время рассечения муха мозга на этапе 3.2 для того, чтобы получить неповрежденные образцы мозга; это очень важно для точного подсчета числа клеток нейронов. Для ResEлучники , которые заинтересованы в использовании tsMARCM для изучения функции генов на других хромосомных плечах (например, 2R, 3L и 3R), tsMARCM-готовые мухи должны быть собраны , как в шаге 1.2, выбирая соответствующие пары трансгены FRT, UAS- mCD8.GFP.UAS-rCD2i и УАС-rCD2.RFP.UAS-GFPi, которые указаны в таблице 1. Мы также рекомендуем женские tsMARCM готовые мухи нести HS-ФЛП на Х - хромосоме (например, HS-ФЛП ^[22], ш; UAS-rCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT ^40A; +; +), которая облегчает повторные эксперименты tsMARCM.

Модификации, устранение неполадок и ограничения техники

Эффективность и perdurance из RNAi супрессоров и репортерами являются основными факторами, определяющими для анализа ли нейронального происхождения и функции генов исследования могут быть успешно проведены в экспериментах tsMARCM. Как правило, сочетание низкой perdurance из RNAi супрессоров ирепортеры, полученные из нервных клеток-предшественников, вместе с высокой экспрессии RNAi супрессоров и репортеров в постмитотических нейронов, позволяет лучшие результаты tsMARCM. Поскольку выражение RNAi супрессоров и репортеров управляются драйверами GAL4, исследователи должны выбрать сильные драйверы GAL4, которые выражают GAL4 в дифференцированных нейронов, но не в нервных клеток-предшественников. Например, GAL4-OK107 сильный водитель GAL4 , который выражает GAL4 в грибном теле (МБ) клеток - предшественников и их производных, М. Б. у, а '/ р' и а / р нейронов ^{11, 19.} Неверная маркировка МВ у нейронов наблюдается в двух клоновых моделей (т.е. одноклеточных , связанные с одноклеточных клонах и двухкамерные-GMC , связанных с многоклеточным-NB клонов) , когда GAL4-OK107 использовали в экспериментах tsMARCM ¹¹ , Интересно, что выше проблема может быть решена с помощью MB247-GAL4, другой драйвер MB GAL4что выражается GAL4 в дифференцированных нейронов ¹¹ МБ.

Не все драйверы GAL4 могут быть использованы в системе tsMARCM или в других системах мозаики маркировки (например, MARCM, Q-MARCM и твин-спот генератор) ^{4, 20, 21} , если водитель не экспрессируется в нейронах интерес. Поэтому перед использованием tsMARCM нейронной линии анализа, драйверы GAL4 должны быть проверены на их освещение нейронов , представляющих интерес в двойного выражения контроля MARCM с водителем пан-клеток (например, промотор-тубулина LexA :: ГПП) ²² , Отметим , что tsMARCM клоны иногда не могут быть проанализированы однозначно, особенно , когда водитель GAL4 со сложной нейронной паттерна экспрессии используется (например, зеленый боковой рог (LH) нейроны предотвратить четкую визуализацию аксонов шаблона разработки VL2p adPN на фигуре 3В и (например, MARCM, Q-MARCM и твин-спот генератор) ^{4, 20, 21} , так как ограничение берет свое начало с драйвером GAL4. Отметим также, что для проведения аварийно-спасательных экспериментов для проверки подлинности функций генов, спасательные трансгены должны быть спроектированы с целевыми последовательностями супрессоры RNAi в 5 'или 3' нетранслируемые области трансгенных спасательных конструкций, или альтернативный сдвоенными месте система маркировки (например, в сочетании MARCM, сочетание Q-MARCM и обычных MARCM) ²¹ должны быть приняты.

Значимость техники в отношении существующих / альтернативных методов

К тому же tsMARCM, твин-спот генератора и соединенный MARCM бы также, по крайней мере в теории, позволяют для визуализациинейроны , полученные из общих нервных клеток - предшественников в двух различных цветов (сравнение этих трех мозаичных технологий маркировки было представлено ранее ^15). Минимальное количество трансгенов, необходимых для сборки твин-точечного генератора, оригинальная версия tsMARCM (или новая версия tsMARCM), и в сочетании MARCM 4, 8 (или 6), и 9 соответственно. Однако tsMARCM это единственная система , которая была использована для проведения всеобъемлющего анализа нейронального происхождения ^{12, 15, 18, 23.} Сайт-специфическая рекомбинация действительно происходит в не делящихся клеток в системе генератора твин-спот, и это приводит к коэкспрессией двух репортеров в той же клетке, что делает его сложным, чтобы использовать эту систему для изучения развития центральной нервной системы ^15. В противоположность этому, мозаичные клоны, полученные в tsMARCM и связанные системы MARCMповторно получены из делящихся клеток. Однако, поскольку связанная система MARCM требует наличия двух независимых драйверов для контроля экспрессии различных репортеров в Q-MARCM и обычных систем MARCM, это вызывает опасения по поводу классификации нейронов, происходящих от общих нервных клеток-предшественников, если две независимые водители не верно маркировать те же нейроны в нервной линий , представляющих интерес ^15.

Будущие приложения или направления после овладения техникой

Использование tsMARCM для проведения анализа нейронального происхождения с высокой разрешающей способностью
Применяя подход , используемый на рисунке 3 , чтобы систематически анализировать tsMARCM клоны adPNs, 40 видов adPNs, в общей сложности 82 нейронов, были определены в предыдущем исследовании ^12. Среди этих 40 видов adPNs, 35 были Uni-клубочковой adPNs (т.е., иннервирующих одну клубочек в усиков доли (AL)), которая RELау обонятельной информации в другие регионы дрозофилы мозга ¹² (см На рисунках 2-4 в Ю. и др., 2010). Остальные пять типов adPNs были поли-гломерулярные adPNs (т.е. иннервирующих несколько клубочков в AL), которые могли бы интегрировать обонятельную информацию из AL и обеспечивают дополнительный уровень функциональной сложности к обонятельной системе ¹² (см рисунки 3Е-3Н и 4Z в Ю. и др., 2010). Эмбриональные происхождения adPNs имеют только один нейрон каждого типа, в то время как личиночных происхождения adPNs представлены несколькими нейронов каждого типа, предполагая , что существует взаимодействие между специфичностью и избыточности в обонятельной системе ¹² (см фиг.2-4 в Ю и др., 2010). Интересно, что нейроны, производимые в определенных окнах развития суждено умереть, и многие виды adPNs встречаются с фиксированным числом нейронов в нейронной линии ALad1, предполагая, что количесг и типы adPNs для сборки обонятельная система жестко регулируется ¹² (см рисунки 2H, 4В и 5 в Ю. и др, 2010;. также рис 3P - 3Т).

Использование tsMARCM для точного изучения функций генов
К тому же при рождении знакомств adPNs, tsMARCM также применяется для определения порядка рождения из шести центральных сложных нейронов, меченных GAL4-OK107. Эти шесть нейронов составляют небольшое подмножество нейронов в нейронной линии LALv1 , которые вносят вклад в схему центрального комплекса Drosophila для управления замысловатые узоры двигателя ^{2, 11} (рис 4а и 4b в Ю и др., 2009). Интересно, что каждый из этих шести центральных сложных нейронов обладает ярко выраженный нейронную морфологию ¹¹ (см Рисунок 4d-4h и 4o в Ю. и др., 2009). Все они несут различные узоры аксонов в концеRAL аксессуар лопасть (LAL). Первые четыре нейроны распространяют свои дендриты к подразделам отсеков noduli, вложенной структуры центрального комплекса, в то время как остальные два нейроны проецировать свои дендриты к эллипсоидной тела, другой к югу от структуры центрального комплекса. В частности, 3 - ^й -born центральный комплекс нейрон проекты своих дендритов к вентральной noduli, с компактным аксонов рисунком в LAL, в то время как 4 - ^й -born центральный комплекс нейрон распределяет свои дендриты на дорсальную noduli, с широким рисунком в аксонов ¹¹ блок контроля пламени (см рисунок 4f и 4g в Ю и др., 2009).

Помимо комплексно идентифицирующих нейронов, сила tsMARCM будет лучше в качестве примера при изучении функций генов в нейронах интерес, так как система tsMARCM позволяет лучше фенотипические анализы, позволяя исследование идентичных нейронов у разных животных. Например, tsMARCM обнаруживает единственную временную жираизменение е , которое требует хронологически неуместное морфогенез (chinmo, A BTB-цинковый палец ядерный белок) в 3 - ^м -born центральных комплексных нейронов ¹¹ (рис 4i, 4p и 4w в Ю. и др., 2009). Если мутация chinmo характеризовались в исходной системы MARCM (т.е. один зеленый меченных нейронов, без маркировки нейронов , полученных из связанных сторон сдвоенных ячеек в качестве эталона), то chinmo дефицитных нейрон показано на рисунке 4i из Ю. и др. 2009 был бы ошибочно , как 4 - ^й -born, а не 3 - ^го -born, центрального комплекса нейроне. Это привело бы к неправильной интерпретации функции chinmo как контроль аксонов руководство , а не с указанием временной судьбы ¹¹ (двойной стрелкой на рисунке 4i из Ю. и др., 2009). Тем не менее, с использованием пурпурного многоклеточным-NB стороны tsMARCM клонов, как гое задание (с помощью подсчета числа клеток в Рисунок 4м, 4л, и 4p из Ю. и др. , 2009) chinmo дефицитных нейрон показано на рисунке 4i из Ю. и др. , 2009) было доказано, что центральный комплекс нейрон 3 - ^го -born, который , следовательно , привело к правильному выводу о том, что chinmo функции во временной спецификации судьбы для центральных сложных нейронов ^11. Взятые вместе, приведенные выше результаты подчеркивают важные преимущества системы tsMARCM для высокого разрешения анализирует фенотипический, таким образом, точно раскрытия функции генов в нейронах (или другие типы клеток, если это применимо) для будущих нейронных исследований в области развития (или исследования в области развития на другой ткани).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon dioxide (CO2)	Local vendor	n.a.	Anesthetize flies
CO2 pad	Local vendor	n.a.	Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (or other vendors)	PBS001	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fix fly brains
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody	Invitrogen	MCD0800	Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody	Clonetech	632496	Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent	Molecular Probes	S36936	Mount fly brains and protect quenching of fluorescence
PYREX 9 depression glass spot plate	Corning	7220-85	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments	SYLG184	Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	242276-250G	Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30	Dissect and mount fly brains
Micro slide	Corning	2948-75x25	Mount fly brains
Micro cover glass No. 1.5	VWR International	48366-205	Mount fly brains
Nail polish	Local vendor	not available	Seal micro cover glass on micro slides
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	culture flies at 25 °C
(or other vendors)
Water bath	Kansin Instruments	WB212-B2	Induce heat-shock in flies at 37 °C
(or other vendors)
Orbital shaker	Kansin Instruments	OS701	Wash and immunostain fly brains
(or other vendors)
Dissection microscope	Leica	EZ4	Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope	Zeiss (or other vendors)	LSM 700 (or other models)	Image tsMARCM clones
image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	not available	Project stacks of confocal images
image-processing software 2 (e.g., ImageJ)	not available	not available	Count cell number of tsMARCM clones