Cell Lineage Analyser och genfunktion studier Använda Twin plats MARCM

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för en mosaik märkningsteknik som tillåter visualisering av neuron härledda från en gemensam ursprungscell i två distinkta färger. Detta underlättar neurala härstamning analys med möjlighet att födelsehållande enskilda nervceller och studera geners funktion i samma nervceller i olika individer.

Abstract

M osaic ANALYS med en r epressible c ell m Arker (MARCM) är en positiv mosaik märkningssystem som har i stor utsträckning i Drosophila neurobiologiska studier för att skildra intrikata morfologier och manipulera funktionen av gener i delmängder av nervceller inom annars omärkta och ostörda organismer. Genetiska mosaiker genereras i MARCM systemet förmedlas genom ställesspecifik rekombination mellan homologa kromosomer inom dividera föregångarceller för att producera både märkta (MARCM kloner) och omärkta dotterceller under mitos. En förlängning av MARCM metod, kallad twin-spot MARCM (tsMARCM), etiketter både av tvilling celler härledda från en gemensam stamfader med två distinkta färger. Denna teknik har utvecklats för att göra det möjligt för hämtning av nyttig information från både hemi-linjerna. Genom omfattande analys av olika par av tsMARCM kloner tillåter tsMARCM systemet högupplösta neurala härstamning Mapping för att avslöja den exakta födelseordning de märkta nervceller som produceras från vanliga stamceller. Dessutom tsMARCM systemet sträcker sig också genfunktion studier genom att tillåta fenotypisk analys av identiska nervceller av olika djur. Här beskriver vi hur man tillämpa tsMARCM systemet för att underlätta studier av neural utveckling i Drosophila.

Introduction

Hjärnan, består av ett stort antal och olika typer av nervceller, begåvar djur med förmåga att uppfatta, bearbeta och svara på utmaningarna från den yttre världen. Neuroner i den vuxna Drosophila centrala hjärnan är härledda från ett begränsat antal av neurala stamceller, som kallas neuroblaster (NBS), under utveckling ^{en, två.} De flesta av NBS deltar i hjärnan neurogenes i Drosophila genomgå asymmetrisk division att generera självförnyande NBs och ganglion moderceller (GMC), och GMC går sedan genom ytterligare en runda av division för att producera två dotterceller som differentierar till neuroner ³ (Figur 1A ). På grund av intrikat av neuronal morfologi och de utmaningar som är förknippade med att identifiera specifika nervceller, en positiv mosaik märkning teknik, mosaik analys med en undertryckcellmarkör (MARCM), uppfanns för att göra det möjligt för visualization av en enda neuron eller en liten delmängd av nervceller av befolkningen i omgivande, omärkta neuron ^4.

MARCM utnyttjar flippas (FLP) / FLP måligenkännande (FRT) system för att förmedla platsspecifik rekombination mellan homologa kromosomer inom en skiljeföregångare cell som bär en heterozygot allel av en repressorgen, vars uttryck normalt hämmar uttryck av en reportergen ^4. Efter den mitotiska delning, är de rekombinanta kromosomer segregeras till enkelceller, så att en cell innehåller homozygota alleler av repressor-genen och den andra cellen har ingen repressorgen-expressionen av reportern i den cellen (och dess ättlingar) är inte längre blockerad ^4. Tre klonala mönster finns vanligen i en MARCM experiment när FLP är stokastiskt induceras i NBs eller GMC: encelliga och två-cell-GMC-kloner, som skildrar neuronal morfologi vid encelliga Upplösning in, och flercelliga-NB-kloner, som avslöjar hela morfologiska mönster av neuron härledda från en gemensam NB (Figur 1B). Den MARCM teknik har i stor utsträckning i Drosophila neurobiologiska studier, bland annat i neuronal typbeteckning för att rekonstruera hjärnan hela kabelnätverk, analyser neurala härstamning för att avslöja utvecklingshistoria av nervceller, fenotypisk karakterisering av genfunktioner involverade i cell öde specifikation, och neuronal morfogenes och differentiering Studier ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Eftersom konventionell MARCM etiketter endast en av de två dotterceller (och härstamningar) efter den inducerade mitotiska rekombinationshändelsen, är potentiellt användbar information från den omärkta sidan förlorade. Denna begränsning hindrar tillämpningen av den grundläggande MARCM systemet till högupplösta analyser av många neurala linjer som byter cell öden i tempo eller precision analyser av genfunktioner i identiska neuroner i olika djur ^{11, 12.}

Twin plats MARCM (tsMARCM) är ett avancerat system som märker neuroner som härrör från en gemensam stamfader med två distinkta färger, vilket möjliggör återvinning av nyttig information från båda sidor av de två celler och därmed övervinna begränsningen av den ursprungliga MARCM systemet ¹¹ ( Figur 2A - 2C). I tsMARCM systemet två RNA-interferens (RNAi) baserade suppressorer ligger på trans-platser av homologa kromosomer inom en föregångare cell, och uttrycket av dessa suppressorer hämma självständigt uttryck för deras respektive reportrar (Figur 2B). Efter platsspecifik mitotiska rekombination förmedlad genom FLP / FRT-systemet, TWo RNAi-baserade suppressorer blivit segregerade till enkelceller för att tillåta uttrycket av distinkta reportrar (figur 2b). Två klonala mönster, encelliga samband med encelliga kloner och två-cell-GMC i samband med flercelliga-NB-kloner, typiskt sett i en tsMARCM experiment (figur 2C). Information som härrör från den ena sidan av de två cellerna kan användas som referens för den andra sidan, vilket möjliggör hög upplösning neurala härstamning analyser, såsom födelsehållande av märkta nervceller, och fenotypiska analyser av identiska nervceller i olika djur för exakt undersökning av nerv geners funktion ^{11, 12.} Här presenterar vi en steg-för-steg-protokollet beskriver hur man genomför en tsMARCM experiment, som kan användas av andra laboratorier för att bredda sina studier av neural utveckling (liksom utvecklingen av andra vävnader, i förekommande fall) i Drosophila.

Protocol

1. Bygg tsMARCM-ready Flugor Använda Obligatorisk Transgener ^{11, 13}

1. Generera den ursprungliga versionen av tsMARCM-färdiga flugor från transgener som genomförs av enskilda flugor ¹¹ (se tabell 1). Genomföra standardgylf genetiska korsningsscheman, som har beskrivits tidigare, genom att sätta multipla transgener i samma gylf lagren ^13.
   1. I en föräldralinje, montera de transgenerna enligt FRT ^40A, UAS-mCD8 :: GFP (den första reportern, mCD8 :: GFP; expression av transgenen är under kontroll av den uppströms belägna aktiveringssekvensen promotor, som producerar ett membran-bunden reporter av mus kluster av differentiering 8 protein fuserat med grönt fluorescerande protein), och UAS-rCD2RNAi (suppressor som hämmar uttrycket av den andra reportern; RNAi mot uttrycket av rått-kluster of differentiering 2, rcd2) på vänster arm 2: ^a kromosomen. Plats vävnadsspecifika -GAL4 drivrutin på X eller ^{3: e} kromosom, om möjligt.
   2. I den andra föräldralinjen, montera de transgenerna enligt FRT ^40A, UAS-rCD2 :: RFP (den andra reportern, rCD2 :: RFP, den andra membran tjudrad reporter som består av rCD2 protein fuserat med röd fluorescerande protein), och UAS-GFPRNAi (suppressor som hämmar uttrycket av mCD8 :: GFP; RNAi mot uttryck av GFP) på den vänstra armen av den 2: ^{a-kromosomen.} Placera värmechock (hs) -FLP eller vävnads specific- FLP på X eller ^{3: e} kromosom, om möjligt.
2. Generera den nya versionen av tsMARCM-färdiga flugor från transgener som genomförs av enskilda flugor ¹⁴ (se tabell 1). Genomför standard flyga genetisk korsande system som har beskrivits pidigare, genom att sätta flera transgener i samma flyga lagren ^13.
   1. I en föräldralinje, montera de transgener i ett FRT-säte och UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (en kombinerad transgen av mCD8 :: GFP och suppressor som hämmar uttrycket av rCD2 :: RFP) tillsammans i samma arm av den ^{2: a} eller ^{3: e} kromosom (lämpliga par av transgener av FRT och UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i anges i tabell 1). Placera vävnadsspecifika-GAL4 drivrutin på andra än kromosomen av den valda FRT plats, om möjligt kromosomer.
   2. I den andra föräldralinjen, montera de transgener i ett FRT-säte och UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (den andra kombinerade transgen av rCD2 :: RFP och suppressor som hämmar uttrycket av mCD8 :: GFP) i samma arm av 2: ^a eller ^{3: e} kromosom (lämpliga par av transgener i FRT UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi anges i tabell 1). Placera hs-FLP eller vävnadsspecifika-FLP på andra än kromosomen av den valda FRT plats, om möjligt kromosomer.

2. Cross tsMARCM-redo Flugor att generera tsMARCM kloner i deras avkomma

1. Cross tsMARCM-ready flugor tillsammans (t.ex. sätta 10-15 manliga flugor från steg 1.1.1 eller 1.2.1 och 20-30 jungfru kvinnliga flyger från steg 1.1.2 eller 1.2.2 tillsammans) i en injektionsflaska fly-mat med färska tillverkade jäst pasta på väggen av flaskan.
2. Bibehålla de korsade tsMARCM-redo flugor vid 25 ° C under 2 dagar för att öka risken för parning före uppsamling av befruktade ägg.
3. Vanliga överföra korsade tsMARCM-ready flugor i färskt yeasted flaskor för att undvika trängsel (knacka ner flugorna eller använd koldioxid söva flugorna att underlätta överföring, hålla högst 80-100 befruktade ägg i en 10 ml fly-mat vial för att undvika alltför många kläckta larver).
4. Kultur de tsMARCM djur (dvs befruktade ägg; ett exempel på genotypen för tsMARCM djur, som användes i fig 3, är hs-FLP ^[22], vikt / vikt; UAS-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT ^40A , GAL4-GH146 / UAS-rCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT ^40A, +, +) som har lagts i de serie överförda flaskor vid 25 ° C tills de utvecklas till de önskade stegen (t.ex. embryon, larver, eller puppor).
5. Placera de överförda flaskorna som innehåller tsMARCM djur vid samma utvecklingsstadium till ett 37 ° C vattenbad i 10, 20, 30, 40 och 50 min för att bestämma den optimala tiden för värmechocks som inducerar expression av FLP för att generera den tsMARCM kloner av intresse. Hoppa över det här steget om vävnads specific- FLP används i tsMARCM experiment (hs-FLP är att föredra för neural härstamning analyser, orsakerna till denna inställning har beskrivits tidigare ¹⁵).
   OBS: Upprepa steg 2,5 med hjälp av den optimala tiden för värmechock i framtida tsMARCM experiment om fler tsMARCM kloner av intresse ville; i allmänhet är mer FLP uttryck induceras i hs-FLP ^[22] jämfört med hs-FLP ^[1] med samma värmechock tid.
6. Kultur de värmechock tsMARCM djur vid 25 ° C tills de har nått en lämplig utvecklingsstadiet, och sedan vidare till steg 3.

3. Förbered, Bets, och Mount Fly Brains innehållande tsMARCM Clones

1. Förbered pincett skyddsrätter. Blanda del A (30 g) och del B (3 g) av det Silikonelastomer Kit med aktivt kol (0,25 g). Häll blandningen i lämpliga rätter.
2. Dissekera larver, puppa, eller vuxna hjärnor ut ur tsMARCM djur i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med pincett på en pincett skydd maträtt betraktas genom en dissektion mikroskop. OBS: Ett protokoll för fluga hjärnan dissektion har varit fallanderibed tidigare ^16.
3. Fixera gylf hjärnorna i en glasprovplatta med 1x PBS innehållande 4% formaldehyd vid rumstemperatur under 20 min. Behandla flyga hjärnorna i denna glasprovplatta för resten av stegen.
4. Skölj fly hjärnor tre gånger med 1% PBT (1x PBS innehållande 1% Triton X-100) och tvätta dem tre gånger under 30 minuter vardera i 1% PBT (skölj: ta bort PBT och lägga till nya PBT snabbt, tvätta: ta bort PBT, lägga till nya PBT och inkubera flyga hjärnorna i nya PBT med hjälp av en orbital shaker).
5. Inkubera gylf hjärnor med blandningen av primära antikroppar över natten vid 4 ° C eller under 4 h vid rumstemperatur. Ett exempel på den blandning av primära antikroppar är rått-anti-CD8-antikropp (1: 100), kanin-anti-DsRed-antikropp (1: 800), och mus-anti-Bruchpilot (Brp) antikropp (1:50) i 1% PBT innehållande 5% normalt getserum (NGS).
6. Skölj fly hjärnor tre gånger med 1% PBT, och sedan tvätta dem tre gånger under 30 minuter vardera med 1% PBT.
7. Skölj fly hjärnor tre gånger med 1% PBT, och sedan tvätta dem tre gånger under 30 minuter vardera med 1% PBT. Montera dem på ett mikroobjektglas med ett anti-släckningsreagens. Sätt en mikrotäckglaset på mikro bilden för att täcka och skydda flyga hjärnor. Täta kanterna på mikrotäckglaset och mikroglas med genomskinligt nagellack. Lagra dessa monterade och förseglade flyga hjärnprover vid 4 ° C.

4. Ta bearbeta och analysera fluorescerande bilder av tsMARCM Clones

1. Fånga fluorescerande bilder av tsMARCM kloner frOm proverna skapade i steg 3,8 med hjälp av konfokalmikroskopi valfrihetssystem.
2. Projekt travar av tsMARCM konfokala fluorescerande bilder i två dimensioner, tillplattade bilder med bildbehandlingsprogram medföljer konfokalmikroskopi valfrihetssystem (se figur 3B - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O, och 3Q - 3T för exempel på tillplattad konfokala fluorescerande bilder).
3. Räkna antalet celler i flercelliga-NB sidor av tsMARCM kloner med användning av en lämplig bildbehandlingsprogram (t.ex. "cell Counter" -funktionen i ImageJ ^17, se figur 3E, 3J, 3O och 3T för exempel på cellen kroppar av nervceller).

Representative Results

Den tsMARCM Systemet har använts för att underlätta neurala härstamning analyser och genfunktion studier genom att hämta viktig information om nervceller som härrör från vanliga NBs. Systemet har använts för att identifiera de flesta (om inte alla) neuronala typer bestämma cellantalet av varje neuronal typ, och fastställa födelse beställning av dessa neuroner ^{11, 12, 18} (se diskussionsavsnittet för mer information om hur du använder tsMARCM till genomföra neural härstamning analyser eller genfunktion studier). Här har vi använt fyra tsMARCM kloner av anterodorsal luktprojektions neuroner (adPNs i ALAD1 neurala stammen av Drosophila luktsystemet) märkta med GAL4-GH146 som exempel för att illustrera hur man genomför en tsMARCM experiment ^{1, 2.} Efter FLP uttryck inducerades i fosterstadiet, en single, grön VL2p adPN samband med 45 magenta adPNs upptäcktes i en tsMARCM klon (Figur 3A - 3E). Däremot när FLP framkallades senare på olika larvstadier, singel, grön adPNs (DL1 adPN eller DC3 adPN) eller ingen GH146 + adPNs samband med olika antal magenta adPNs (31, 21, eller 15) observerades i tre andra tsMARCM kloner (Figur 3F - 3T). Födelsen av VL2p adPNs före födelsen av DL1-, DC3- och no-GH146 + -adPNs bestämdes genom att räkna cellantal av adPNs i deras associerade flercelliga-NB sidorna av tsMARCM kloner (45, 31, 21, och 15 i figur 3E, 3J, 3O och 3T, respektive). Förutom att räkna antalet celler, komplexiteten hos axonala och dendritiska mönster i de flercelliga-NB sidor av tsMARCM kloner kan användas för att bestämma den relativa födelse-ordning som deras associerade två-cell-GMC sidor avtsMARCM kloner. Mosaik kloner induceras i tidiga utvecklingsstadier innehåller normalt fler neuroner och därmed har mer komplexa axonal och dendritiska mönster, medan mosaik kloner induceras vid sena utvecklingsstadier innehåller färre nervceller och därmed har mindre komplicerade axonal och dendritiska mönster (Figur 3C - 3D, 3H - 3I 3M - 3N, och 3R - 3S).

Figur 1: schematiska illustrationer av Drosophila neurogenes och de tre typerna av klonala mönster som finns i ett MARCM experiment. (A) schematiskt neurogenes i de flesta neurala linjer av Drosophila centrala hjärnan: neuroblaster (NBS) genomgå en asymmetrisk division att generera självförnyande NBs och ganglion moderceller (GMC), och GMC dela upp en mer tid för att producera två dotter neuroner (NS). (B) Tre klonala mönster observeras i en MARCM experiment: single-cellkloner (a), när flippas (FLP) induceras i GMC, och två-cell-GMC-kloner (b) och multi-cellulär-NB-kloner (c ), när FLP induceras i NBs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Schematiskt diagram över den tsMARCM systemet. (A) tsMARCM-redo flugor: en föräldra fluga innehåller transgener av ett FRT-säte och UAS-mCD8 :: GFP (det första rapport), UAS-rCD2RNAi (den första suppressor som hämmar uttrycket av det andra rapport) och en vävnad -specifika -GAL4; den andra föräldra fluga innehåller en FRT UAS-rCD2 :: RFP (det andra rapport), UAS-GFPRNAi (den andra suppressor som hämmar uttrycket av det första rapport) och hs-FLP. (B) Förekomsten av de två RNAi-baserade dämpare i avkomman av de korsade tsMARCM-ready flugor hämmar uttrycket av reportrar (dvs mCD8 :: GFP och rCD2 :: RFP i G1 och G2 faser panel B). Uttrycket av FLP induceras genom värmechock, och FLP medierar därefter den platsspecifika rekombinationen av homologa kromosomer inom en skilje prekursorcell vid bindning till FLP igenkännings mål (FRTS). Detta resulterar i segregation av RNAi-baserade dämpare i två celler efter mitotiska division för att tillåta uttrycket av olika reportrar. (C) Två klonala mönster observeras i en tsMARCM experiment: encelliga, associerad med encelliga kloner (a) då FLP induceras i GMC, och två-cell-GMC, förknippad med flercelliga-NB-kloner(B) när FLP induceras i NBs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Använda fyra tsMARCM kloner av adPNs som exempel på hur man genomför en tsMARCM experiment i ett neuralt härstamning analys. Fyra tsMARCM kloner av adPNs illustreras med diagram av deras neurogenes mönster (A, F, K, och P); konfokala bilder av den totala hjärnan (B, G, L och Q), som visar den laterala hornet (LH; C, H, M och R), den Antenn lob (AL; D, I, N och S) och soma(E, J, O och T); och mönstren för deras neuronala morfologier. Enkel adPNs (VL2p, DL1, DC3, och no-GH146 + adPNs; grön) som är förknippade med multicellulära-NB adPNs (magenta) av de tsMARCM kloner härleddes genom induktion av FLP att mediera mitotisk rekombination i adPN NB i foster (A - E) och larver (F - T) steg. Notera att adPNs är en av de hemi-härstamningar i ALAD1 neurala härstamning, vilket resulterar i tsMARCM kloner av en enda, grön adPN associerad med magenta adPNs i figur 3 (för okända skäl, neuroner från den andra hemi-stammen av ALAD1 neurala lineage munstycket). Födelseordning VL2p, DL1, DC3, och no-GH146 + adPNs bestämdes genom att räkna cellantal av adPNs i magenta flercelliga-NB sidorna av tsMARCM kloner (45, 31, 21, och 15 inom den streckade rader av paneler E, J, O och T). De neurite mönster är oftast mer komplicerad i magenta flercelliga-NB sidor när tsMARCM kloner induceras i tidiga utvecklingsstadier (t.ex. är den dendritiska mönster mer komplex i panel E jämfört med paneler I, N och S). tsMARCM analyser är ibland förvirrande när neuroner av andra neurala härstamningar är också märkta med samma GAL4 föraren (t.ex. gröna LH neuroner, som visas med dubbelpilar, hindra visualisering av axonal utarbetandet mönstret för VL2p adPNs i paneler B och C) . Hjärn neuropiles (visas i blått) färgades med antikroppar mot Bruchpilot (Brp). Värmechock tid: 12 min (paneler A - E), 15 min (paneler F - J), och 35 min (paneler K - T). Skalstrecket i paneler B - G - J, L - O, och Q - S = 10 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Kritiska steg i protokollet

Steg 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5, och 3.2 är kritiska för att erhålla goda tsMARCM resultat. Vävnadsspecifika -GAL4 förare som inte uttrycker GAL4 i neurala stamceller är att föredra för steg 1.1.1 och 1.2.1. Undvik över trängs djuren odlas i fly-mat flaskor i steg 2,3. Eftersom induktionen latens, expressionsnivån av FLP vid värmechock, och den genomsnittliga delningstiden av neurala progenitorceller (dvs., NBS och GMC) inte är kända, är det bäst att variera värmechockstiden (10, 20, 30 , 40 och 50 min) på olika prov av samma genotyp och dess utvecklingsstadier i steg 2,5. Detta kommer att möjliggöra bestämning av den optimala värmechocks tid i syfte att erhålla det bästa förhållandet mellan tsMARCM kloner av intresse. Dessutom, var försiktig under fly hjärnan dissektion i steg 3,2 för att erhålla intakta hjärnprover; Detta är avgörande för att exakt räkna neuronala cellantal. för resebågskyttar som är intresserade av att använda tsMARCM för att studera funktionen av gener på andra kromosomarmar (t.ex. 2R, 3L och 3R), tsMARCM-färdiga flugor ska monteras som i steg 1,2 genom att välja lämpliga par av transgener i FRT, UAS- mCD8.GFP.UAS-rCD2i och UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi, som anges i tabell 1. Vi rekommenderar också att de kvinnliga tsMARCM färdiga flugor bär hs-FLP på X-kromosomen (t.ex. hs-FLP ^[22], w; UAS-rCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT ^40A, +, +), som underlättar upprepade tsMARCM experiment.

Ändringar, felsökning och begränsningar av tekniken

Effektiviteten och perdurance av RNAi dämpare och reportrar är de viktigaste faktorerna för om neurala härstamning analyser och genfunktion studier kan utföras framgångsrikt i tsMARCM experiment. I allmänhet kombinationen av låg perdurance av RNAi suppressorer ochreportrar härledda från neurala stamceller, tillsammans med den höga expressionen av RNAi suppressorer och reportrar i post-mitotiska neuroner, medger bättre tsMARCM resultat. Eftersom uttrycket av RNAi dämpare och reportrar styrs av GAL4 förare bör forskare väljer starka GAL4 förare som uttrycker GAL4 i differentierade neuroner men inte i neurala stamceller. Till exempel, är GAL4-OK107 en stark GAL4 drivrutin som uttrycker GAL4 i svamp kroppen (MB) progenitorer och deras derivat, MB γ, α '/ β', och a / p neuroner ^{11, 19.} Unfaithful märkning av MB y-neuroner har observerats i två klonala mönster (dvs., encelliga associerad med encelliga kloner och två-cell-GMC associerade med flercelliga-NB kloner) när GAL4-OK107 användes i tsMARCM experiment ¹¹ . Fängslande, kan ovanstående fråga kan lösas genom att använda MB247-GAL4, en annan MB GAL4 drivrutinsom uttrycker GAL4 i differentierade MB neuroner ^11.

Inte alla GAL4 förare kan användas i tsMARCM systemet eller i andra mosaik märkningssystem (t.ex. MARCM, Q-MARCM, och dubbla plats generator) ^{4, 20, 21} om föraren inte uttrycks i nervceller av intresse. Därför innan du använder tsMARCM för neural härstamning analyser, GAL4 förare bör testas för sin täckning av nervceller av intresse i dubbeluttryckskontroll MARCM med en pan-cell drivrutin (t.ex. tubulin promotor-LexA :: GAD) ²² . Vi noterar att tsMARCM kloner kan ibland inte analyseras entydigt, särskilt när en GAL4 förare med ett komplext neural uttrycksmönster används (t.ex., grönt lateral horn (LH) neuroner förhindra tydlig visualisering av axonal elaboration mönstret för VL2p adPN i figur 3B och (t.ex. MARCM, Q-MARCM, och twin-spot generator) ^{4, 20, 21} på grund av att begränsningen härrör med GAL4 föraren. Vi noterar också att för att utföra räddningsförsök för verifiering av genfunktioner, bör räddningstransgener konstrueras med målsekvenserna av RNAi dämpare i 5 'eller 3' otranslaterade regionerna av de transgena räddnings konstruktioner, eller ett alternativt dubbel plats märkningssystem (t.ex. kopplat MARCM, en kombination av Q-MARCM och konventionell MARCM) ²¹ bör antas.

Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder

Förutom tsMARCM, dubbel-spot generator och kopplade MARCM skulle också, åtminstone i teorin, möjliggör visualisering avneuroner som härrör från vanliga neurala stamceller i två distinkta färger (en jämförelse av dessa tre tekniker mosaik märkning har presenterats tidigare ^15). Det minsta antalet transgener som krävs för montering av dubbla plats generator, den ursprungliga versionen av tsMARCM (eller den nya versionen av tsMARCM) och kopplades MARCM är fyra, åtta (eller 6), och 9, respektive. Dock är tsMARCM det enda system som har använts för att genomföra omfattande neurala härstamning analyser ^{12, 15, 18, 23.} Ställespecifik rekombination inträffar i icke-mitotiska celler i twin-spot generatorsystem, och detta leder till samuttryck av de två reportrarna i samma cell, vilket gör det svårt att använda detta system för att studera utvecklingen av den centrala nervsystemet ^15. I motsats, mosaik kloner som erhållits i tsMARCM och kopplade marcm system enre härrör från mitotiska celler. Men eftersom det kopplade MARCM systemet kräver två oberoende förare att styra uttrycket av de olika reportrar i Q-MARCM och konventionella marcm system, väcker oro för märkning av neuroner som härrör från vanliga neurala stamceller om de två oberoende förarna inte troget märka samma neuroner i de neurala härstamningar av intresse ^15.

Framtida Program eller Vägbeskrivning efter Mastering Technique

Använda tsMARCM att genomföra högupplösta neurala härstamning analyser
Genom att tillämpa den metod som används i figur 3 för att systematiskt analysera tsMARCM kloner av adPNs, 40 typer av adPNs, med totalt 82 neuroner, identifierades i en tidigare studie ^12. Bland dessa 40 typer av adPNs, 35 var uni-glomerulär adPNs (dvs innerverar en enda glomeruli i antenn loben (AL)), som relay olfactory information till andra regioner i Drosophila hjärnan ¹² (se Figurerna 2-4 i Yu et al., 2010). De övriga fem typer av adPNs var poly-glomerulära adPNs (dvs innervating flera glomeruli i AL), vilket skulle kunna integrera lukt information från AL och ger en extra nivå av funktionell komplexitet till luktsystemet ¹² (se figurerna 3E-3H och 4Z i Yu et al., 2010). Embryonala födda adPNs har bara en neuron per typ, medan larver födda adPNs representeras av flera nervceller per typ, vilket tyder på att det finns samspelet mellan specificitet och redundans i luktsystemet ¹² (se figurerna 2-4 i Yu et al., 2010). Intressant är nervceller produceras inom vissa utvecklings fönster avsedda att dö, och många typer av adPNs finns med ett fast antal neuroner i ALAD1 neurala härstamning, vilket tyder på att den number och typer av adPNs för montering av luktsystemet hårt reglerad ¹² (se figurerna 2H, 4V, och 5 i Yu et al, 2010;. också se Figur 3P - 3T).

Med användning tsMARCM att noggrant studera genfunktioner
Förutom födelse dejting adPNs har tsMARCM också använts för att bestämma födelseordningen sex centrala komplexa neuroner märkta av GAL4-OK107. Dessa sex neuroner utgör en liten undergrupp av neuroner i LALv1 neurala härstamning som bidrar till kretsarna av Drosophila centrala komplexa att styra intrikata motoriska mönster ^{2, 11} (se fig 4a och 4b i Yu et al., 2009). Intressant nog var och en av dessa sex centrala komplexa neuroner har en distinkt neuronal morfologi ¹¹ (se figur 4d-4h och 4o i Yu et al., 2009). Alla av dem bär tydliga axonal mönster i slutetral tillbehör lob (LAL). De första fyra neuroner distribuera sina dendriter till underavdelningarna av noduli, en underbyggnad av det centrala komplexet, medan de återstående två nervceller projicerar sina dendriter till ellipsoiden kroppen, en annan sub-struktur centrala komplexet. Specifikt projekt den 3: ^e -born centrala komplex neuron dess dendriter till ventrala noduli, med en kompakt axonal mönster i LAL, medan den 4: ^e -born centrala komplex neuron distribuerar sina dendriter till rygg noduli, med en bred axonal mönster i LAL ¹¹ (se figur 4f och 4g i Yu et al., 2009).

Utöver omfattande identifiera neuroner, skulle kraften i tsMARCM bättre exemplifieras genom att studera genfunktioner i nervceller av intresse, eftersom tsMARCM Systemet tillåter bättre fenotypisk analyser genom att möjliggöra granskning av identiska nervceller i olika djur. Exempelvis detekterar tsMARCM en enda temporal fette förändring som kräver kronologiskt olämplig morfogenes (chinmo en BTB-zinkfinger nukleärt protein) i den 3: ^e -born centrala komplexa neuroner ¹¹ (se figur 4i, 4p, och 4W i Yu et al., 2009). Om chinmo mutationen hade karaktäriserats i den ursprungliga MARCM system (dvs., enstaka grön-märkta neuroner, utan märkning av neuroner härledda från de associerade sidorna av de två cellerna som referens), den chinmo med brist på neuron visas i fig 4i från yu et al. , 2009 skulle ha misidentified som den ^{4: e} -born, snarare än den ^{3: e} -born, central komplex neuron. Detta skulle ha lett till feltolkning av chinmo funktion som styrning axonal vägledning snarare än att ange tids öde ¹¹ (dubbel-pilen i figur 4i från Yu et al., 2009). Men genom att använda magenta flercelliga-NB sidor tsMARCM kloner som the referens (via räkna cellantal i Figur 4m, 4n och 4p från Yu et al. 2009), den chinmo med brist på neuron visas i figur 4i från Yu et al. 2009) visade sig vara den 3: ^e -born centrala komplex neuron, som därför lett till rätt slutsats som chinmo funktioner i tids öde specifikation för centrala komplexa neuroner ^11. Sammantaget ovanstående resultat belysa de viktiga fördelarna med tsMARCM systemet för hög upplösning fenotypisk analys, och därmed exakt avslöja genfunktioner i neuroner (eller andra typer av celler, i förekommande fall) för framtida neurala utvecklingsstudier (eller utvecklingsstudier av andra vävnader).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon dioxide (CO2)	Local vendor	n.a.	Anesthetize flies
CO2 pad	Local vendor	n.a.	Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (or other vendors)	PBS001	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fix fly brains
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody	Invitrogen	MCD0800	Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody	Clonetech	632496	Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent	Molecular Probes	S36936	Mount fly brains and protect quenching of fluorescence
PYREX 9 depression glass spot plate	Corning	7220-85	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments	SYLG184	Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	242276-250G	Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30	Dissect and mount fly brains
Micro slide	Corning	2948-75x25	Mount fly brains
Micro cover glass No. 1.5	VWR International	48366-205	Mount fly brains
Nail polish	Local vendor	not available	Seal micro cover glass on micro slides
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	culture flies at 25 °C
(or other vendors)
Water bath	Kansin Instruments	WB212-B2	Induce heat-shock in flies at 37 °C
(or other vendors)
Orbital shaker	Kansin Instruments	OS701	Wash and immunostain fly brains
(or other vendors)
Dissection microscope	Leica	EZ4	Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope	Zeiss (or other vendors)	LSM 700 (or other models)	Image tsMARCM clones
image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	not available	Project stacks of confocal images
image-processing software 2 (e.g., ImageJ)	not available	not available	Count cell number of tsMARCM clones