Çift nokta MARCM kullanılması Hücre Lineage Analizleri ve Gen Fonksiyonu Çalışmaları

Summary

Burada, iki ayrı renk ortak bir progenitör hücreden türetilen nöron görselleştirme izin veren bir mozaik etiketleme tekniği için bir protokol mevcut. Bu, farklı bireylerin aynı nöronlarda doğum kalma bireysel nöronların kapasitesi ve eğitim gen fonksiyonu ile sinir soy analizi kolaylaştırır.

Abstract

M r epressible c ell m arker bir nalysis (MARCM) yaygın karmaşık morfolojileri tasvir ve aksi takdirde işaretlenmemiş ve soğukkanlı içinde nöronların alt kümelerinin genlerin işlevini işlemek için Drosophila nörobiyolojik çalışmalarda uygulanan bir pozitif mozaik etiketleme sistemi osaic organizmalardır. MARCM sisteminde üretilen genetik mozaik mitoz sırasında her iki işaretlenmiş (MARCM klonları) ve işaretlenmemiş yavru hücrelere üretilmesi için ön-madde bölünen hücreler içindeki homolog kromozomlar arasındaki yere özgü rekombinasyon yoluyla aracılık edilir. MARCM yönteminin bir uzantısıdır, adı çift Noktası MARCM (tsMARCM), iki ayrı renk ile ortak bir progenitör türetilen yataklı hücrelerin hem de etiketler. Bu teknik, hem hemi-soydan gelen yararlı bilgi alınmasını sağlamak için geliştirilmiştir. kapsamlı tsMARCM klonlarının farklı çiftleri analiz ederek, tsMARCM sistemi, yüksek çözünürlüklü sinir soy Mappin izing ortak progenitör hücrelerden üretilen etiketli nöronların tam doğum sırasını ortaya çıkarmak için. Ayrıca, tsMARCM sistemi, farklı hayvan aynı nöronların fenotipik analizi izin gen fonksiyon çalışmalarını uzanır. Burada, Drosophila nöral gelişim çalışmalarını kolaylaştırmak için tsMARCM sisteminin nasıl uygulanacağını açıklar.

Introduction

Bir çok sayıda ve nöronların farklı türde oluşan beyin, algılama, süreç ve dış dünyadan sorunlara yanıt yeteneği ile hayvanları endows. Yetişkin Drosophila merkezi beynindeki nöronlar, nöral kök hücrelerin sınırlı sayıda türetilen gelişim ^{1, 2} sırasında çağrılan Nöroblastlar (Onaylanmış). Onaylanmış Drosophila beyin nöron katılan çoğu kendini yenileyen Onaylanmış Kuruluşlarının ve ganglion anne hücreleri (GOK değerleri) oluşturmak için asimetrik bölünme geçmesi ve GOK değerleri daha sonra (Şekil 1A nöronlar ³ içine ayırt iki kızı hücreleri üretmek için bölünme bir tur geçmesi ). Çünkü nöronal morfoloji karışıklık ve spesifik nöronlar, pozitif bir mozaik etiketleme teknolojisi, bir bastırılabilir hücre markeri (MARCM) ile mozaik analizlerinde ile ilişkili zorluklar, visualizat sağlamak için icat edildiTek bir nöron veya çevre, etiketsiz nöronların ⁴ nüfusun dışında nöronların küçük bir alt iyon.

MARCM Flippase (FLP) tanımı, normal olarak, bir raportör geninin ⁴ ekspresyonunu önleyen bir represör genin bir heterozigot aleli taşıyan bir bölme ön-hücre içinde homolog kromozomlar arasındaki site-spesifik rekombinasyon aracılık etme / FLP tanıma hedef (STT) sistemi kullanmaktadır. mitotik bölünmesinden sonra, rekombinant kromozom artık bir hücre homozigot represör genin alelleri ve diğer hücre Resim represör genini-o hücrenin (ve onun soyundan) Raportör ekspresyonu sahip içerecek şekilde, çift hücrelere ayrılmış olan ⁴ engellendi. FLP stokastik Onaylanmış ve GMC'ler indüklenir sonucunda üç klonal desenler genellikle MARCM deneyde bulunan: tek hücreli çözünürlük nöronal morfoloji tasvir tek hücreli ve iki hücre GMC klonlar,ortak bir NB (Şekil 1B) türetilen nöron bütün morfolojik desenler ortaya n ve çok hücreli-NB klon. MARCM tekniği yaygın beyin çapında kablo ağlarını yeniden nöronal tip tanımlama dahil olmak üzere, Drosophila nörobiyolojik çalışmalarda uygulanmıştır, nöral soy nöronlar, hücre kaderi şartnamede yer alan gen fonksiyonlarının fenotipik karakterizasyonu gelişim tarihini ifşa analizleri ve nöronal morfonogenezi ve farklılaşma ^{5, 6, 7, 8, 9, 10} inceler. Geleneksel MARCM sadece uyarılmış mitoz rekombinasyon olayından sonra iki yavru hücreye (ve soy) birini etiketler, çünkü işaretsiz taraftan potansiyel olarak yararlı bilgiler kaybolur. Bu sınırlama, temel M uygulanmasını engellerYüksek çözünürlüklü ARCM sistemi hızlı tempoda hücre kaderi değiştirmek çok sinir soy analizleri veya hassas farklı hayvanların ^{11, 12} özdeş nöronlarda gen fonksiyonlarının analiz eder.

İkiz-spot MARCM (tsMARCM) böylece orijinal MARCM sisteminin ¹¹ sınırlama (üstesinden ikiz hücrelerin her iki tarafın yararlı bilgi kurtarma sağlayan iki ayrı renk ile ortak bir progenitör türetilmiş nöronlar etiketleri gelişmiş bir sistemdir Şekil 2A - 2C). TsMARCM sisteminde, iki RNA interferans (RNAi) baskılayıcılar, bir ön-madde, hücre içindeki homolog kromozom trans-sitesi bulunmaktadır tabanlı ve bu baskılayıcılar ifadesi bağımsız olarak, ilgili muhabir (Şekil 2B) ekspresyonunu inhibe eder. FLP / FRT sisteminin aracılık site-spesifik rekombinasyon mitotik sonra, twhaline O RNAi tabanlı baskılayıcılar tat muhabir (Şekil 2B) ekspresyonuna izin vermek için tek kişilik hücrelere ayrılmış. İki klon desenler çok hücreli-NB klonları ile bağlantılı tek hücre klonları ve iki hücre GMC ile bağlantılı tek hücre tipik olarak bir tsMARCM deneyi (Şekil 2C) görülür. Gibi bilgiler doğum kalma etiketli nöronlar gibi nöral nesilli analiz yüksek çözünürlükte, etkinleştirme diğer taraf için referans olarak kullanılabilir çift yataklı hücrelerin bir taraftan elde edilen ve fenotipik hassas araştırma için farklı hayvan özdeş nöronların analizleri sinir gen fonksiyonu ^{11, 12} arasında. Burada, (varsa, yanı sıra diğer dokuların gelişimini) Drosophila nöral gelişim çalışmalarını genişletmek için diğer laboratuvarlar tarafından kullanılan bir tsMARCM deney, yapmak için nasıl açıklayan bir adım-adım protokol mevcut.

Protocol

1. Gerekli Transgenlerin ^{11, 13} kullanılarak tsMARCM hazır Sinekler oluşturun

1. Bireysel sinekler ¹¹ tarafından yapılmaktadır transgenlerin gelen tsMARCM hazır sinekler özgün sürümünü oluşturun (bakınız Tablo 1). Aynı sinek stoklarının ¹³ çoklu transgenler koyarak, daha önce tarif edilmiştir standart sinek genetik geçiş şemaları, Davranış.
   1. Bir ebeveyn doğrultusunda, FRT ^40A, UAS-mCD8 :: GFP (ilk muhabir, mCD8 :: GFP transgenlerin araya; transgen ifadesi bir zar-gergin muhabiri üreten yukarı aktivasyon dizisi promoter kontrolü altındadır sıçan küme o ifadesi karşı RNAi, yeşil flüoresan protein ile kaynaşmış farklılaşma 8 proteininin fare küme) ve UAS-rCD2RNAi (ikinci muhabiri ifadesini inhibe baskılayıcıf farklılaşma 2, rcd2) ^2. kromozomun sol kolunda. yer dokuya özgü eğer mümkünse, X veya ^3. kromozom üzerinde -GAL4 sürücüsü.
   2. Diğer ebeveyn doğrultusunda, FRT ^40A, UAS-rCD2 :: RFP transgenlerin araya (ikinci muhabiri, rCD2 :: RFP, diğer zar-gergin muhabir kırmızı floresan proteini ile kaynaşmış rCD2 proteini oluşan) ve UAS-GFPRNAi (mCD8 :: GFP ekspresyonunu inhibe baskılayıcı, GFP ifadesi karşı RNAi) ^2. kromozomun sol kolunda. X veya ^3. kromozomun, mümkünse ısı-şok (hs) -FLP veya doku-Seçicilik FLP yerleştirin.
2. Bireysel sinekler ¹⁴ tarafından yapılmaktadır transgenlerin gelen tsMARCM hazır sineklerin yeni sürümü oluşturun (bakınız Tablo 1). s tarif edilmiştir standart sinek genetik geçiş şemaları, Davranışreviously, aynı sinek stoklarının ¹³ çoklu transgenlerin koyarak.
   1. Bir ebeveyn doğrultusunda, aynı kolunda birlikte bir FRT site ve UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (mCD8 :: GFP ve rCD2 ifadesini :: RFP inhibe bastırıcı bir kombine transgen) arasında transgenlerin araya ^2. veya ^3. kromozomu (STT ve UAS mCD8.GFP.UAS-rCD2i bölgesinin transgenlerin uygun çift Tablo 1 'de belirtilmiştir). Mümkünse, seçilen FRT sitenin kromozomu dışındaki kromozomlar üzerinde doku-spesifik-GAL4 sürücüsü yerleştirin.
   2. Diğer ebeveyn doğrultusunda, bir FRT site ve UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (diğer kombine rCD2 bir transgen :: RFP ve mCD8 :: GFP ekspresyonunu inhibe baskılayıcı) aynı kolun içinde transgenlerin araya STT transgenlerin ^2. veya ^3. kromozom (uygun çiftlerinin UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi) Tablo 1'de gösterilmiştir. Yeri hs-FLP veya mümkünse, seçilen FRT sitenin kromozomu dışındaki kromozomlar üzerinde doku-spesifik-FLP.

2. Çapraz tsMARCM hazır Onların Döl içinde tsMARCM klonlarının oluşturmak için Sinekler

1. Birlikte Çapraz tsMARCM hazır sinekler taze bir sinek gıda şişede (örneğin, birlikte adım 1.1.2 veya 1.2.2 uçar adım 1.1.1 ya da 1.2.1 ve 20-30 bakire kadın 10-15 erkek sinekler koymak) şişenin duvarda -yapılan maya yapıştırın.
2. döllenmiş yumurta toplama önce çiftleşme şansı artırmak için 2 gün boyunca 25 ° C'de geçti tsMARCM hazır sinekler koruyun.
3. Sık transferini kolaylaştırmak için (boğmakta önlemek sinekler aşağı dokunun veya sinekler uyutmak için karbondioksit kullanmak için taze mayalı şişeleri içine geçti tsMARCM hazır sinekler aktarmak; aracılığı ile 10 ml sinek gıda 80-100 döllenmiş yumurta daha fazla tutmakl) çok fazla yumurtadan larva önlemek için.
4. Kültür tsMARCM hayvanlar (örneğin, döllenmiş yumurtalar, tsMARCM hayvan genotipinin bir örneği, Şekil 3'te kullanılan şekliyle, HS-FLP ^[22], a / a; UAS mCD8 :: GFP, UAS rCD2RNAi, FRT ^40A GAL4-GH146 / UAS rCD2 :: RFP UAS GFPRNAi, FRT ^40A +; arzu edilen aşamada (embriyo, larvalarına karşı geliştirmek kadar 25 ° C 'de seri olarak transfer şişelerde atılmıştır +), veya pupa).
5. oluşturmak için FLP ekspresyonunu indükleyen ısı şok uygun zamanı belirlemek aktarılır 10 için 37 ° C su banyosu, 20, 30, 40, aynı gelişim aşamasında tsMARCM hayvan içerir şişe ve 50 dakika yerleştirin Çevrede tsMARCM klonları. Doku Seçicilik FLP tsMARCM deneyde kullanılan ediliyor bu adımı atlayın (hs-FLP sinir soy tercih edilir analizleri bu tercihin nedenleri daha önce ¹⁵ tarif edilmiştir).
   NOT: ilgi daha fazla tsMARCM klonları istedi eğer gelecekte tsMARCM deneylerinde ısı şoku optimal zamanı kullanarak adımı yineleyin 2.5; Genellikle, daha FLP ifade ile kıyaslandığında, hs-FLP ^[22] indüklenir hs-FLP ^[1] Aynı ısı-şok süresi.
6. Kültür onlar 25 ° C'de ısı şok tsMARCM hayvanlar uygun gelişim aşamasına ulaştı ve ardından 3. adıma geçin kadar.

3. Leke hazırlayın ve Dağı Fly Brain tsMARCM klonlarının İçeren

1. forseps koruma yemekleri hazırlayın. A bileşenini (30 g) ve aktive edilmiş mangal kömürü (0.25 g) ile Silikon Elastomer Kit B bölümünde (3 g) karıştırın. Uygun yemekleri içine karışımı dökün.
2. Diseksiyon mikroskobu ile görüntülenen bir forseps koruma çanak forseps kullanarak 1x fosfat tamponlu tuzlu su içinde tsMARCM hayvanlar (PBS) üzerinden larva, pupa veya ergin beyinleri teşrih. NOT: sinek beyin diseksiyon için bir protokol azalan olmuşturDaha önce ¹⁶ belirlemiş.
3. 1X PBS, 20 dakika boyunca oda sıcaklığında% 4 formaldehit içeren bir cam Noktası plaka uçucu beyinleri düzeltildi. adımların geri kalanı için bu cam nokta plakasında sinek beyinleri işleyin.
4. Kaldırmak PBT:; yıkama PBT çıkarın ve hızlı bir şekilde yeni PBT ekleyin: sinek beyinleri% 1 PBT (1 x PBS,% 1 Triton X-100 ihtiva eden) ve% 1 PBT (durulamada 30 dakika boyunca her biri üç kez yıkama ile üç kez yıkayın yeni PBT eklemek ve bir orbital karıştırıcı kullanılarak yeni PBT sinek beyinleri) kuluçkaya yatmaktadır.
5. gece boyunca 4 ° C'de ya da oda sıcaklığında 4 saat için birincil antikor karışımı ile uçucu beyinleri inkübe edin. ihtiva eden ve fare anti-Bruchpilot (BRP) antikoru (1:50),% 1 PBT: tavşan anti-DsRed antikoru (800 1): Primer antikor karışımının bir örneği, sıçan anti-CD8 antikoru (1: 100) olan % 5 normal keçi serumu (NGS).
6. Uçucu beyinleri% 1 PBT ile üç kez durulanır ve daha sonra,% 1 PBT 30 dakika her biri için uygun üç kez yıkayın.
7. Uçucu beyinleri% 1 PBT ile üç kez durulanır ve daha sonra,% 1 PBT 30 dakika her biri için uygun üç kez yıkayın. Bir anti-söndürme maddesi ile mikro lam üzerine monte edin. sinek beyinleri kapsayacak ve korumak için mikro slaytta bir mikro cam kapak koyun. net oje kullanarak mikro kapak camı ve mikro slayt kenarları mühür. Bu monte edilir ve 4 ° C'de beyin numuneleri sinek kapalı saklayın.

4. Süreç alın ve tsMARCM Klonların Floresan Görüntüler analiz

1. tsMARCM klonları fr floresan görüntüler yakalayınom numuneler tercih konfokal mikroskopi sistemini kullanarak adım 3.8 oluşturulan.
2. Iki boyutlu içine tsMARCM konfokal floresan görüntülerin proje yığınlar, seçim konfokal mikroskopi sistemi ile birlikte verilen görüntü işleme yazılımı kullanarak görüntüleri düzleştirilmiş (Şekil 3B bakınız - basık örnekleri için 3T - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O ve 3Ç konfokal floresan görüntüler).
3. Uygun bir görüntü işleme yazılımı (ImageJ ^17, örneğin, "Hücre Sayaç" fonksiyonunu kullanarak tsMARCM klonlarının çoklu hücresel NB iki hücre sayısını, hücre örnekleri için Şekil 3E, 3j, 3O ve 3T bakınız nöronların organları).

Representative Results

tsMARCM sistemi ortak Onaylanmış türetilen nöronlar üzerinde önemli bilgiler alarak sinir soy analizleri ve gen fonksiyon çalışmaları kolaylaştırmak için kullanılır olmuştur. Sistem, nöronal türleri (hepsi değilse de) çoğu belirlemek her nöronal tip hücre sayısını belirlemek, ve tsMARCM kullanarak bu nöronların doğum sırası ^{11, 12, 18} (detaylar için Tartışma Bölüm bakın tespit etmek için kullanılır olmuştur nöral soyunu yürütmek) analizleri veya gen fonksiyon çalışmaları. Burada, bir tsMARCM deney ^{1, 2} yapmak için nasıl göstermek için örnek olarak GAL4 GH146 ile etiketlenmiş anterodorsal koku projeksiyon nöronları (Drosophila koku sistemi ALad1 nöral soy adPNs) dört tsMARCM klonları kullanılmıştır. FLP ifade embriyonik aşamada, bir si indüklenen sonra45 kırmızı adPNs ilişkili ngle yeşil VL2p adPN bir tsMARCM klon (- 3E Şekil 3A) 'de tespit edilmiştir. FLP diğer üç gözlendi farklı larva aşamasında, tek, yeşil adPNs (DL1 adPN veya DC3 adPN) ya da eflatun adPNs farklı sayıda (31, 21 ya da 15) ile ilişkili-GH146 + adPNs de, sonradan oluşturuldu aksine, tsMARCM klonlar (Şekil 3F - 3T). DL1-, DC3- ve hiçbir GH146 + -adPNs doğum öncesinde VL2p adPNs doğum, tsMARCM klonlar (45, 31, 21, ilişkili çoklu hücresel NB kenarlarında adPNs hücre sayıları sayılarak belirlendi ve 15 sırasıyla Şekil 3E, 3J, 3O ve 3T, içinde). tsMARCM klonlarının çok hücreli-NB iki hücre sayıları, akson karmaşıklığı ve dendritik kalıpları sayımı ek olarak kendi ilgili iki hücre GMC iki göreli doğum sırasını belirlemek için kullanılabilirtsMARCM klonlar. Erken gelişim aşamalarında oluşturulan mozaik klonlar normalde daha nöronlar içerirler ve geç gelişim aşamalarında oluşturulan mozaik klonlar daha az nöron içeren ve bu nedenle daha az karmaşık akson ve dendritik desenleri (Şekil 3C sahipken, böylece daha karmaşık aksonal ve dendritik desenleri - 3D, 3H - 3I 3M - 3N ve 3R - 3 S).

Şekil 1: Şematik Drosophila nöron çizimler ve MARCM deneyde bulunan klonal desen üç tip. (A), Drosophila merkezi beyin en nöral soy şematik bir diyagramdır nöron: Nöro-blastlar (NBS) kendini yenileyen onaylanmış kuruluşu ve gangliyon ana hücrelerinin (üretmek için bir asimetrik bölünmesi geçmesiGOK değerleri) ve GOK değerleri iki kızı nöronlar (Ns) üretmek için bir kez daha bölmek. (B) üç klonal desen MARCM deneyde gözlenen: tek hücre klonları, (a), flippase (FLP) GMC'ler olarak indüklenen ve genellikle, iki hücre GMC klon (b) ve çok hücreli-NB klon (Cı ), FLP Onaylanmış indüklenir olduğunda. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2: tsMARCM sisteminin şematik diyagramlar. (A) tsMARCM hazır sinek: Bir ebeveyn uçucu bir FRT bölgesini ve UAS mCD8 :: GFP (birinci haberci), UAS rCD2RNAi (ikinci haberci ekspresyonunu inhibe ilk baskılayıcı) ve bir dokunun transgenleri ihtiva -GAL4 -özel; diğer ebeveyn sinek bir FRT içeriyor UAS-rCD2 :: RFP (ikinci haberci), UAS-GFPRNAi (ilk muhabiri ekspresyonunu inhibe ikinci baskılayıcı) ve hs-FLP. (B) çapraz tsMARCM hazır sineklerin döl iki RNAi tabanlı bastırıcı varlığı gazetecilere (yani, mCD8 :: GFP ve rCD2 :: paneli B G1 ve G2 fazlarında RFP) salınımını inhibe eder. FLP ekspresyonu ısı şoku ile indüklenir ve FLP ardından FLP tanıma hedef (FRTS) bağlandıktan sonra bir ayırma ön-hücre içinde homolog kromozomların belirgin rekombinasyon aracılık eder. Bu tat muhabir ekspresyonuna izin vermek için mitotik bölünmesinden sonra, tek kişilik hücrelerde RNAi tabanlı baskılayıcılar ayrılması ile sonuçlanır. (C), iki klon desen tsMARCM deneyinde gözlemlenen: tek hücre klonlarının ile ilişkili tek bir hücre: (a) FLP GMC'ler indüklenen ve zaman çok hücreli-NB klonları ile bağlantılı iki hücre GMC(B) FLP Onaylanmış indüklenen zaman. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: bir sinir soy analizinde bir tsMARCM deney yapmak için nasıl örnekleri olarak adPNs dört tsMARCM klonlar kullanma. AdPNs dört tsMARCM klon nöron kalıpları (A, F, K, ve P) diyagramları ile, gösterilmiştir; genel beyin konfokal görüntüleri (B, G, L ve Q) lateral boynuz gösteren (LH, C, H, E ve K), anten lob (AL, D, I, K, ve G) ve soma(E, J, O ve T); ve nöronal morfolojileri desenleri. Tek adPNs (VL2p, DL1, DC3 ve no-GH146 + adPNs; yeşil) tsMARCM klonlarının çoklu-hücresel-NB adPNs (Eflatun) ile ilişkili embriyonik de adPN NB mitotik rekombinasyon aracılık etmek FLP indüksiyonla elde edilmiştir (A - E) ve larva (F - T) aşamaları. AdPNs ALad1 nöral diğer yarı-soydan kırmızı bilinmeyen nedenlerle Şekil 3'te adPNs (nöronlar ile ilişkili tek bir yeşil adPN arasında tsMARCM klonları ile sonuçlanır ALad1 nöral soyu içinde yarı-soylarından biri olduğuna dikkat soy die). VL2p, DL1, DC3 ve no-GH146 + adPNs doğum dereceden kesik olan tsMARCM klonlar (45, 31, 21 kırmızı çok hücreli-NB kenarlarında adPNs hücre sayıları sayılması ile tespit ve 15 oldu panel E, J çizgileri, O ve T). Nörit desenleri genellikle tsMARCM klonlar erken gelişim aşamalarında uyarılan zaman eflatun çok hücreli-NB tarafı daha karmaşıktır (örn dendritik desen panelleri I, N, S ile karşılaştırıldığında paneli E daha karmaşıktır). tsMARCM bazen diğer nöral soy nöronlar da aynı GAL4 sürücüsü tarafından etiketli zaman kafa karıştırıcı analizleri (örneğin, çift oklarla gösterilen yeşil LH nöronlar, paneller B ve C VL2p adPNs aksonal özen desen görselleştirme engel) . (Mavi ile gösterilir) Beyin neuropiles Bruchpilot (BRP) karşı antikor ile boyandı. Isı şoku süresi: 12 dakika (panel A - D), 15 dakika (panel F - J) ve 35 dakika (panel K - Ti). Paneller B ölçekli bar - G - J, L - O ve Q - S = 10 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Protokol çerçevesinde kritik adımlar

2.5, 2.3, 1.2.1, 1.1.1 Adımlar ve 3.2 iyi tsMARCM sonuçları elde etmek için kritik öneme sahiptir. Sinir atalarda GAL4 ifade etmez, dokuya-özgü -GAL4 sürücüler adımları 1.1.1 ve 1.2.1 için tercih edilir. Adım 2.3 sinek gıda şişeleri yetiştirilen hayvanların aşırı kalabalık kaçının. Indüksiyon gecikme, ısı şoku üzerine FLP ifade seviyesi, ve sinir atalarıdır (yani, Onaylanmış ve GOK değerleri) ortalama bölen süresi bilinmemektedir, çünkü ısı-şok süresini değiştirmek için en iyisidir (10, 20, 30 aşama 2.5 aynı genotip ve gelişim aşamasında farklı örnekleri üzerinde, 40 ve 50 dakika). Bu ilgi tsMARCM klonlarının en iyi oranı elde etmek için en uygun ısı-şok süresi belirlenmesi için izin verir. Buna ek olarak, bozulmamış beyin örnekleri elde etmek için adım 3.2 sinek beyin diseksiyonu sırasında dikkatli olun; Bu doğru nöronal hücre sayıları sayma için çok önemlidir. rese için(örneğin, 2R, 3L ve 3R), tsMARCM hazır sinekler STT, UAS- ve transgenlerin uygun çiftleri seçerek adım 1.2 olarak monte edilmelidir, diğer kromozom kollarında genlerin işlevini incelemek için tsMARCM kullanarak ilgilenen okçu mCD8.GFP.UAS-rCD2i ve Tablo 1 'de gösterilmiştir UAS rCD2.RFP.UAS-GFPi. Biz de dişi tsMARCM hazır sinekler X kromozomu (; UAS-rCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT ^40A +, örneğin, hs-FLP ^[22], w +) üzerindeki hs-FLP taşımak öneririz hangi tekrar tsMARCM deneyleri kolaylaştırır.

Tekniğin Değişiklikler, sorun giderme ve Sınırlamalar

RNAi bastırıcı ve gazetecilere verimliliği ve perdurance sinir soy analizleri ve gen fonksiyon çalışmaları başarıyla tsMARCM deneylerde yapılabilir olup olmadığını ana belirleyiciler. Genel olarak, RNAi baskılayıcılar düşük perdurance kombinasyonuBirlikte post-mitotik nöronlar RNAi bastırıcı ve gazetecilere yüksek ifadesi ile, sinir atalarıdır türetilen gazetecilere, daha iyi tsMARCM sonuçları verir. RNAi bastırıcı ve gazetecilere ifadesi GAL4 sürücüleri tarafından denetlendiği için, araştırmacılar sinir atalarıdır farklılaştırılmış nöronlarda GAL4 ifade değil güçlü GAL4 sürücüleri seçmelisiniz. Örneğin, GAL4 OK107 mantar gövdenin (MB) progenitörler ve bunların türevleri, MB y, α '/ p' ve α / β nöronlar ^{11, 19} GAL4 ifade güçlü GAL4 sürücüdür. MB y olan nöronların unfaithful markalama iki klon desen gözlemlenmiştir (örneğin, çok hücreli-NB klonları ile bağlantılı tek hücre klonları ve iki hücre GMC ile bağlantılı tek hücreli) GAL4 OK107 tsMARCM deneylerde ¹¹ kullanılmıştır . Şaşırtıcı, yukarıdaki konu MB247-GAL4, farklı bir MB GAL4 sürücüsü kullanılarak çözülebilirBu farklılaşmış MB nöronların ¹¹ GAL4 ifade eder.

Tüm GAL4 sürücüler tsMARCM sistemi ya da başka bir mozaik etiketleme sistemleri kullanılabilir değildir (ör MARCM Q-MARCM ve çift Noktası jeneratörü) sürücüsü ilgi nöronların ifade değilse ^{4, 20, 21.} Bu nedenle, nöral soy için tsMARCM kullanmadan önce, GAL4 sürücüleri bir pan-hücre sürücüsü ile çift ifadesi kontrol MARCM ilgi nöronların kendi kapsama alanı için test edilmelidir analizleri (örneğin, tubulin promotör-LexA :: GAD) ²² . Biz tsMARCM klonlar bazen karmaşık bir sinir ifade deseni ile bir GAL4 sürücüsü kullanıldığında, özellikle açıkça analiz edilemez unutmayın (örneğin, yeşil yanal boynuz (LH) nöronlar Şekil 3B VL2p adPN aksonal özen desen açıkça görüntülenmesini önlemek ve (örneğin, MARCM, Q-MARCM ve ikiz nokta jeneratör) ^{4, 20, 21} sınırlama GAL4 sürücüsü ile kaynaklanır çünkü. Ayrıca, gen fonksiyonlarının kimlik doğrulaması için bir kurtarma deneyler, dikkat, kurtarma transgenler, hedef RNAi bastırıcı dizileri 5'te 'veya 3' transgen kurtarma yapıları tercüme edilmemiş bölgeleri, ya da alternatif bir çift nokta ile tasarlanmış olmalıdır etiketleme sistemi (örneğin, birleştiğinde MARCM, Q-MARCM ve konvansiyonel MARCM bir kombinasyonu) ²¹ kabul edilmelidir.

Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi

tsMARCM, ikiz nokta jeneratör ve birleştirilmiş MARCM yanısıra, teoride en azından görselleştirilmesi için izin verecekiki ayrı renkte ortak sinir atalarıdır türetilen nöronlar (bu üç mozaik etiketleme teknolojileri bir karşılaştırma daha önce ¹⁵ sunulmuştur). ikiz nokta jeneratör, tsMARCM özgün sürümü (ya da tsMARCM yeni sürümü) montaj için gerekli transgenlerin minimum sayıda ve birleştirilmiş MARCM sırasıyla 4, 8 (veya 6), ve 9 olduğunu. Bununla birlikte, tsMARCM kapsamlı bir nöral nesilli ^{12, 15, 18, 23} analizleri yapmak için kullanılan tek bir sistemdir. Site-spesifik rekombinasyon çift nokta jeneratör sisteminde olmayan mitotik hücrelerde meydana gelir, ve bu zorlu merkezi gelişimini incelemek için bu sistemi kullanmak için yapım, aynı hücrede iki gazetecilere birlikte ifadesi yol açar sinir sistemi ^15. Bunun aksine, tsMARCM elde edilen mozaik klonlar ve bağlanmış MARCM sistemlerimitotik hücrelerden köken yeniden. birleştiğinde MARCM sistemi Q-MARCM ve konvansiyonel MARCM sistemlerinde farklı gazetecilere ifadesini kontrol etmek için iki bağımsız sürücüler gerektirdiğinden iki bağımsız sürücüler sadakatle yoksa Ancak, bu ortak sinir atalarıdır türetilen nöron etiketleme hakkında kaygı uyandırmaktadır ilgi ¹⁵ nöral soy aynı nöronlar etiket.

Tekniği Mastering sonra gelecek Uygulamalar veya Tarifi

Yüksek çözünürlüklü sinir soy analizleri yapmak için tsMARCM kullanma
82 nöronların toplam sistemli tsMARCM adPNs klonlar, adPNs 40 tür analiz için Şekil 3'te kullanılan yaklaşım uygulayarak, önceki bir çalışmada ¹² tespit edilmiştir. AdPNs Bu 40 türleri arasında, 35 tek-glomerüler adPNs rel, (yani, antennal lob (AL) tek bir glomerul innerve) idiay Drosophila beynin ¹² diğer bölgelerine koku bilgi (bkz Yu ve ark Şekil 2-4., 2010). AdPNs diğer beş tip AL gelen koku bilgiyi entegre ve Şekiller 3E-3H (bkz koku alma sistemi ¹² fonksiyonel karmaşıklık ek bir düzeyde sağlamak olabilir ve poli-glomerüler adPNs (yani, AL birden glomerül innerve) idi Yu 4Z ve ark., 2010). Larva doğumlu adPNs tipine göre birden fazla nöronlar tarafından temsil edilmektedir, oysa embriyonik doğumlu adPNs (Şekiller Yu 2-4 koku alma sistemi ¹² özgünlük ve fazlalık arasındaki karşılıklı etkileşim olduğunu düşündüren, türü başına yalnızca bir nöron var ve diğ., 2010). İlginçtir, bazı gelişimsel pencere içinde üretilen nöronlar ölmeye mahkûmdur ve adPNs birçok türü numbe düşündüren, ALad1 sinir soy nöronların sabit bir sayı ile bulunurkoku sistemi monte edilmesi için R ve adPNs türleri sıkı bir şekilde düzenlenmiş ¹² (Yu ve arkadaşları, 2010 Şekiller 2H, 4V, ve 5 bkz., ayrıca Şekil 3P bakınız - 3T).

Doğru gen fonksiyonlarını incelemek için tsMARCM kullanma
doğum tanışma adPNs yanı sıra, tsMARCM da GAL4-OK107 etiketli altı merkezi kompleks nöronların doğum sırasını belirlemek için uygulanmıştır. Bu altı nöronlar ^{2, 11} karmaşık motorlu modellerini kontrol etmek için Drosophila merkezi kompleksinin devresi katkıda LALv1 sinir soy nöronların küçük bir alt kümesini oluşturan (Yu Şekil 4a ve 4b bakın ve ark., 2009). İlginç bir şekilde, bu altı merkez, karmaşık nöronların her biri (Yu 4d-4H ve 4o Şekil et al., 2009) ayrı bir nöronal morfoloji ¹¹ sahiptir. Hepsi geç belirgin aksonal desenleri taşımakral aksesuar lob (LAL). Geri kalan iki nöron elipsoid gövdesinin merkezinden kompleksin diğer bir alt yapıya da dendrit çıkıntı ise ilk dört nöronlar, noduli, merkezi karmaşık bir alt yapının alt bölmelere da dendrit dağıtın. ^4. doğumlu orta karmaşık nöron dorsal noduli onun dendrit dağıtır oysa Özellikle, 3 ^rd doğumlu orta karmaşık nöron geniş bir akson desen ile, LAL kompakt aksonal desenli, ventral noduli onun dendrit projeler LAL ¹¹ (Yu Şekil 4f ve 4g bakın ve ark., 2009).

tsMARCM sistemi farklı hayvanlarda aynı nöronların incelenmesini sağlayarak analizleri daha iyi fenotipik izin beri kapsamlı tanımlayan nöronlar ötesinde, tsMARCM gücü, ilgi nöronlarda gen fonksiyonlarını inceleyerek daha iyi örneklenen olurdu. Örneğin, tsMARCM tek zamansal yağ tespit3 ^rd doğumlu orta karmaşık nöronlar ¹¹ kronolojik uygunsuz morfolojilerinden gerektiren e değişikliği (chinmo, bir BTB-çinko parmak nükleer protein) (Yu Şekil 4i, 4p ve 4W bkz ark., 2009). Chinmo mutasyonu, orijinal MARCM sisteminde, özelliği edilmiştir (yani, tek bir yeşil-etiketli nöronlar, referans olarak yataklı hücre ilişkili iki türetilen nöron etiketsiz) chinmo -açıklı nöron Şekil 4i gösterilen Yu ve diğ. 2009 ^4. doğumlu, yerine ^3. doğumlu, merkezi karmaşık nöron olarak tanımlanıyordu olurdu. Bu aksonal rehberlik kontrol ziyade geçici kaderi ¹¹ belirterek olarak chinmo fonksiyonunun yanlış yorumlanmasına neden olurdu (Yu'dan Şekil 4i çift ok ve ark., 2009). Ancak, inci gibi tsMARCM klonlarının kırmızı çok hücreli-NB tarafı kullanılarakhücre sayıları sayma üzerinden e referans ( Şekil 4m, 4N, ve Yu ve ark 4p. , 2009), Yu ve ark Şekil 4i gösterilen chinmo -açıklı nöron. , 2009), bu nedenle merkezi kompleks nöronlar ¹¹ zamansal kaderi şartname işlevleri chinmo doğru sonuca yol açan 3 ^rd doğumlu merkezi karmaşık nöron, olduğu kanıtlanmıştır. Birlikte ele alındığında, yukarıdaki sonuçlar, gelecekteki nöral gelişim çalışmaları için yüksek çözünürlüklü (varsa, ya da diğer hücre tipleri) fenotipik ve böylece doğru nöronlarda gen fonksiyonlarını ifşa analizleri için tsMARCM sisteminin önemli avantajlar (ya da diğer gelişimsel çalışmaları vurgulamak doku).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon dioxide (CO2)	Local vendor	n.a.	Anesthetize flies
CO2 pad	Local vendor	n.a.	Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (or other vendors)	PBS001	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fix fly brains
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody	Invitrogen	MCD0800	Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody	Clonetech	632496	Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent	Molecular Probes	S36936	Mount fly brains and protect quenching of fluorescence
PYREX 9 depression glass spot plate	Corning	7220-85	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments	SYLG184	Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	242276-250G	Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30	Dissect and mount fly brains
Micro slide	Corning	2948-75x25	Mount fly brains
Micro cover glass No. 1.5	VWR International	48366-205	Mount fly brains
Nail polish	Local vendor	not available	Seal micro cover glass on micro slides
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	culture flies at 25 °C
(or other vendors)
Water bath	Kansin Instruments	WB212-B2	Induce heat-shock in flies at 37 °C
(or other vendors)
Orbital shaker	Kansin Instruments	OS701	Wash and immunostain fly brains
(or other vendors)
Dissection microscope	Leica	EZ4	Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope	Zeiss (or other vendors)	LSM 700 (or other models)	Image tsMARCM clones
image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	not available	Project stacks of confocal images
image-processing software 2 (e.g., ImageJ)	not available	not available	Count cell number of tsMARCM clones