Fremstilling af Tre-dimensionel papir-baserede mikrofluidenheder for Immunoassays

Summary

Vi detalje en metode til at fremstille tredimensionale papirbaserede mikrofluidenheder til anvendelse i udviklingen af ​​immunoassays. Vores tilgang til enhed forsamling er en type af flerlagede, additiv produktion. Vi demonstrerer en sandwich-immunassay til at give repræsentative resultater for disse typer af papir-baserede enheder.

Abstract

Papir væger væsker autonomt skyldes kapillarvirkning. Ved mønstring papir med hydrofobe barrierer, kan transporten af ​​fluider blive kontrolleret og styret inden for et lag af papir. Desuden stabling af flere lag af mønstret papir skaber sofistikerede tredimensionelle mikrofluide netværk, der kan støtte udviklingen af ​​analytiske og bioanalytiske analyser. Papirbaserede mikrofluidenheder er billig, bærbar, let at bruge, og kræver ingen ekstern udstyr kan fungere. Som et resultat, de holder meget lovende som en platform for point-of-care diagnostik. For at kunne vurdere anvendeligheden og analytisk ydeevne papir-baserede enheder, skal der udvikles egnede metoder for at sikre deres fremstilling er reproducerbar og på en skala, der er passende for laboratoriet indstillinger. I dette manuskript, en fremgangsmåde fabrikere en generel enhed arkitektur, der kan anvendes til papirbaserede immunoassays er beskrevet. Vi bruger en form for additiv manufacturing (flerlags laminering) at forberede enheder, der omfatter flere lag mønstret papir og mønstret klæbemiddel. Ud over at demonstrere den korrekte anvendelse af disse tredimensionelle papirbaserede mikrofluidenheder med en immunoassay for humant choriongonadotropin (hCG), er fejl i fremstillingsprocessen, der kan resultere i enhedens fiaskoer diskuteret. Vi forventer, at denne tilgang til fremstilling af papir-baserede enheder vil finde bred anvendelighed i udviklingen af ​​analytiske applikationer designet specielt til indstillinger begrænset ressource.

Introduction

Papir er bredt tilgængelige i en række formuleringer eller kvaliteter, der kan funktionaliseres til at tune sine egenskaber, og kan transportere væsker autonomt ved kapillarvirkning eller fugtspredende. Hvis papiret er mønstret med en hydrofob substans (f.eks fotoresist ¹ eller voks ^2), det sugende af fluider kan styres rumligt inden et lag af papir. For eksempel kan en anvendt vandig prøve ledes ind i et antal forskellige zoner for at reagere med kemiske og biokemiske reagenser lagret i papiret. Disse papirbaserede mikrofluidenheder har vist sig at være en nyttig platform for udvikling af bærbare og billige analytiske assays ^{3, 4, 5, 6, 7.} Anvendelser af papirbaserede mikrofluidenheder omfatter point-of-care diagnostikef "> 8, overvågning af miljøbelastende stoffer ^9, afsløring af forfalskede lægemidler ^10, og delokaliseret sundhedspleje (eller" telemedicin ") i begrænset ressource indstillinger ^11.

Flere lag af mønstret papir kan samles til en integreret enhed, hvor hydrofile zoner fra tilstødende lag (dvs. over eller under) tilsluttes til at danne kontinuerte fluide netværk, hvis ind- og udgange kan kobles eller venstre uafhængig. ¹² Hvert lag kan omfatte et unikt mønster, som muliggør den rumlige adskillelse af reagenser og multiple assays, der skal udføres på en enkelt enhed. Den resulterende tredimensionelle mikrofluidanordning er ikke kun i stand til fugtspredende væsker til at muliggøre analytiske analyser (f.eks leverfunktionstest ¹³ og elektrokemisk detektion af små molekyler ^14), men det kan også suphavn en række avancerede funktioner (f.eks, ventiler ¹⁵ og enkle maskiner ¹⁶⁾ er fælles for de traditionelle mikrofluide tilgange. Vigtigt er det, fordi papiret væger væsker ved kapillarvirkning, disse enheder kan betjenes med en minimal indsats fra brugeren.

Da reagenser kan opbevares inden den tredimensionale arkitektur af en papir-baseret enhed, kan komplekse protokoller reduceres til en enkelt tilsætning af vandig prøve til en enhed. Vi har for nylig indført et generelt tredimensionalt enhed arkitektur, der kan anvendes til udvikling af papirbaserede immunoassays under anvendelse af voks-trykketeknik til at skabe mønstrede lag. ^{17, 18} Disse undersøgelser fokuserede på, hvordan aspekter i forbindelse med udformningen af indretningen-antal stablede lag anvendes, sammensætning af lagene, og mønsteret af den tredimensionale mikrofluid net-kontrollerede samlede prformance af immunoassay. I sidste ende, var vi i stand til at bruge disse design regler for at fremme en hurtig udvikling af en multiplex immunoassay ^19. I dette manuskript, en tidligere udviklet immunassay til human choriongonadotropin (hCG; graviditet hormon) er ¹⁷ anvendes som et eksempel for at illustrere de strategier, vi har udviklet til montering og fremstilling af tredimensionelle papirbaserede immunoassays. Følgelig vi fokuserer på montering og drift af en indretning snarere end udviklingen af ​​et assay.

I et sandwich-immunassay, som er det format, der bruges til at påvise hCG, et indfangende antistof specifikt for en underenhed af hormonet overtrækkes på et fast substrat, som derefter blokeres at begrænse den ikke-specifikke adsorption af en prøve eller enhver efterfølgende reagens. Dette substrat er oftest en polystyren mikrobrønd-plade (fx til et enzymbundet immunosorbentassay eller ELISA). Prøven er dereftertilsat til en brønd og fik lov at inkubere i en tidsperiode. Efter grundig vaskning et antistof specifikt for den anden underenhed af hCG tilsat og fik lov til at inkubere. Denne påvisning antistof kan konjugeres til en kolloid partikel, enzym eller fluorofor for at frembringe et måleligt signal. Brønden vaskes igen før fortolkning af resultaterne af et assay (fx under anvendelse af en pladelæser). Mens kommercielle kit stole på denne tidskrævende flertrinsproces, kan alle disse trin udføres hurtigt i papirbaserede mikrofluidenheder med minimal indgriben til brugeren.

Den enhed, der bruges til hCG immunoassay omfatter seks aktive lag, som, fra top til bund, der anvendes til prøven kommer, konjugat opbevaring, inkubation, opsamling, vask, og blot (figur 1). Prøven tilsætning lag er lavet af groft filtrerpapir. Det letter indføring af en væskeprøve og beskytter reagenserne i konjugatet Layer fra forurening fra miljøet eller utilsigtet kontakt af brugeren. Konjugatet lag (groft filtrerpapir) holder farveproducerende reagens (f.eks kolloidt guld-mærket antistof) for immunoassay. Inkubationen lag (groft filtrerpapir) tillader prøven at rejse sideværts i planet af arket til fremme binding af analytten med reagenser, før de når det næste lag, indfangning lag. Indfangning lag (nylonmembran) indeholder ligander specifikke for analytten adsorberes på materialet. Efter assayet er udført, dette lag afsløret at muliggøre visualisering af den færdige immunkompleks. Vask lag (groft filtrerpapir) trækker overskydende væske, herunder gratis konjugerede reagenser væk fra ansigtet af capture lag ind blottet lag (tykt kromatografi papir). De seks-lag enhed holdes sammen af ​​fem lag af mønstret, dobbeltsidet klæbende: fire lag permanent klæbemiddel bevare integriteten af ​​monteblødte enhed og et lag af aftageligt klæbemiddel letter skrælning af indretningen til at inspicere resultatet af immunoassay om indfangning lag.

Med henblik på dette manuskript, vi bruger negative og positive kontrolprøver af hCG (0 mIU / ml og 81 mIU / mL) for at tilvejebringe repræsentative resultater af en papirbaseret immunassay, som tillader en dedikeret diskussion af forholdet mellem fabrikation metoder og udførelsen af ​​en enhed. Ud over at demonstrere hvordan man fremstiller enheder med succes, fremhæver vi flere fabrikationsfejl, der kan føre til svigt af en enhed eller reproducerbare analyseresultater. Protokollen og diskussion beskrevet i dette manuskript vil give forskerne med værdifuld indsigt i, hvordan papirbaserede immunoassays er designet og fabrikeret. Mens vi fokuserer vores demonstration på immunoassays, forventer vi, at de retningslinjer, der præsenteres heri, vil være bredt anvendelig til fremstilling af tredimensionellsionelle papirbaserede mikrofluidenheder.

Protocol

1. Fremstilling af Papirbaserede mikrofluidapparat Lag Forbered mønstre for lag af papir, nylon, og klæbemidlet ved anvendelse af en grafisk design program. 6 Hvert lag kan have et andet mønster. BEMÆRK: Mønsteret kan omfatte tilpasning huller, der ikke er nødvendige for en funktionel papirbaseret immunassay, men bistå med reproducerbar fremstilling af tredimensionelle enheder. Placering af disse huller vil variere, hvis enheder samles individuelt, strimler eller som fuld…

Representative Results

Indhentning reproducerbare assay forestillinger i tre-dimensionelle papirbaserede mikrofluidenheder er afhængig af en fremstillingsmetode, der sikrer sammenhæng mellem enheder. Mod dette mål, har vi identificeret en række fremstillingsprocesser og materielle overvejelser, og diskutere dem her i forbindelse med at demonstrere en papirbaseret immunoassay. Vi bruger en voks trykmetode at danne hydrofobe barrierer på papirbaserede mikrofluidenheder (figur 2A). <sup clas…

Discussion

Identifikation af en reproducerbar produktionsstrategi er et væsentligt element i analysen udvikling. ²² Vi bruger en sekventiel, lag-på-lag tilgang til at fremstille tredimensionale papirbaserede mikrofluidenheder. I modsætning til de fremgangsmåder, der anvender foldning eller origami til frembringelse flerlagede enheder fra et enkelt ark papir ^{23, 24} additiv fremstilling giver en række fordele: (i) flere materialer kan inkorporere…

Materials

Illustrator CC	Adobe		to design patterns for layers of paper and adhesive
Xerox ColorQube 8580 printer	Amazon	B00R92C9DI	to print wax patterns onto layers of paper and Nylon
Isotemp General Purpose Heating and Drying Oven	Fisher Scientific	15-103-0509	to melt wax into paper
Artograph LightTracer	Amazon	B000KNHRH6	to assist with alignment of layers
Apache AL13P laminator	Amazon	B00AXHSZU2	to laminate layers together
Graphtec CE6000 Cutting Plotter	Graphtec America	CE6000-40	to pattern adhesive films
Swingline paper cutter	Amazon	B0006VNY4C	to cut paper or devices
Epson Perfection V500 photo scanner	Amazon	B000VG4AY0	to scan images of readout layer
economy plier-action hole punch	McMaster-Carr	3488A9	to remove alignment holes
Whatman chromatogrpahy paper, Grade 4	Sigma Aldrich	WHA1004917
Fisherbrand chromatography paper (thick)	Fisher Scientific	05-714-4	to function as blot layer
Immunodyne ABC (0.45 µm pore size )	Pall Corporation	NBCHI3R	to function as material for capture layer
removable/permanent adhesive-double faced liner	FLEXcon	DF021621	to facilitate peeling
permanent adhesive-double faced liner	FLEXcon	DF051521
wax liner	FLEXcon	FLEXMARK 80 D/F PFW LINER	to assist with patterning adhesive
acrylic sheet	McMaster-Carr	8560K266	to fabricate frame
self-adhesive sheets	Fellowes	CRC52215	to use as protective slip
absolute ethanol	VWR	89125-172	to sanitize work area
bovine serum albumin	AMRESCO	0332
Sekisui Diagnostics OSOM hCG Urine Controls	Fisher Scientific	22-071-066	to use as positive and negative samples
anti-β-hCG monoclonal antibody colloidal gold conjugate (clone 1)	Arista Biologicals	CGBCG-0701	to treat conjugate layer
goat anti-α-hCG antibody	Arista Biologicals	ABACG-0500	to treat capture layer
10X phosphate buffered saline	Fisher Scientific	BP3991
Oxoid skim milk powder	Thermo Scientific	OXLP0031B
Tween 20	AMRESCO	M147