イムノアッセイのための3次元紙ベースのマイクロ流体デバイスの作製
Summary
我々詳細イムノアッセイの開発で使用するための三次元の紙ベースのマイクロ流体デバイスを製造する方法。装置アセンブリへの我々のアプローチは、多層の種類、添加剤の製造です。我々は、紙ベースのデバイスのこれらの種類の代表的な結果を提供するためのサンドイッチイムノアッセイを示します。
Abstract
紙は、毛細管現象による自律的に流体を発散します。疎水性の障壁で紙をパターニングすることによって、流体の輸送を制御することができ、紙の層内に向かいます。また、パターン化された紙の複数の層を積層することは、分析および生物分析アッセイの開発を支援することができる洗練された3次元マイクロ流体ネットワークを作成します。紙ベースのマイクロ流体デバイスは使いやすく、ポータブル、安価であり、かつ動作させるために外部機器を必要としません。その結果、彼らは、ポイントオブケア診断のためのプラットフォームとして非常に有望です。適切ユーティリティと紙ベースのデバイスの分析性能を評価するために、適切な方法は、その製造が再現可能な実験室の設定に適したスケールであることを確認するために開発されなければなりません。本稿では、紙ベースの免疫測定法に使用することができる一般的なデバイス構造を作製する方法が記載されています。私たちは、添加剤manufacturinの形式を使用しますG（多層積層体）は、パターン化された紙とパターン化接着剤の複数の層を含むデバイスを作製しました。ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）のための免疫測定法を用いてこれらの三次元の紙ベースのマイクロ流体デバイスの適切な使用を示すことに加えて、デバイスの故障をもたらすことができる製造工程における誤差が議論されています。私たちは、限られたリソースの設定のために特別に設計された分析アプリケーションの開発において広範な有用性を見出すであろう紙ベースのデバイスを製造するためのこのアプローチを期待しています。
Introduction
紙は、製剤または等級の範囲内で広く利用可能で調整するために、そのプロパティを官能化することができ、毛細管現象またはウィッキングによって自律的に流体を輸送することができます。紙は疎水性物質（ 例えば 、フォトレジスト1またはワックス2）でパターン化されている場合、流体のウィッキングは、紙の層内に空間的に制御することができます。例えば、印加された水性サンプルは、紙の中に格納された化学的および生化学的な試薬と反応させるために、異なるゾーンの数に向けることができます。これらの紙ベースのマイクロ流体デバイスは、ポータブルで安価な分析アッセイ3、4、5、6、7の開発に有用なプラットフォームであることが実証されています。紙ベースのマイクロ流体デバイスのアプリケーションでは、ポイントオブケア診断を含みますEF "> 8、環境汚染物質のモニタリング9、偽造医薬品10、および非局在化医療（またはの検出「限られたリソースの設定11における遠隔医療」）。
パターン化された紙の複数の層は、その入口及び出口連結された、または独立したままにすることができる連続的な流体ネットワークを形成するように接続する親水性ゾーンの隣接層から（ すなわち 、上または下）の集積装置に組み立てることができます。 12各層は単一のデバイス上で実行される試薬及び複数のアッセイの空間的分離を可能にするユニークなパターンを含むことができます。得られた3次元マイクロ流体デバイスだけでなく、分析的アッセイを可能にするために流体をウィッキングすることが可能である（ 例えば 、肝機能は、13および小分子14の電気化学的検出をテストし）、それがSUPこともできますポート洗練された機能の数は、従来のマイクロ流体のアプローチに共通する（ 例えば 、15および簡単な機械弁16）。紙は、毛管現象によって流体を発散するので重要なことには、これらのデバイスは、ユーザからの最小限の労力で操作することができます。
試薬は、紙ベースのデバイスの三次元構造内に格納することができるので、複雑なプロトコルは、デバイスへの水性サンプルの単一添加にすることができます。最近、我々は、パターン化層を作成するために、ワックス印刷技術を使用して紙ベースのイムノアッセイの開発に使用することができる一般的な3次元デバイスのアーキテクチャを導入しました。積層デバイス数の設計に関連する側面は、層の組成、及び3次元マイクロ流体ネットワーク制御全体のあたりのパターン使用方法に焦点を当てた17、18これらの研究イムノアッセイのフォーマンス。最終的に、我々は、多重化イムノアッセイ19の急速な発展を促進するために、これらの設計ルールを使用することができました。本稿では、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG;妊娠ホルモン）のために以前に開発されたイムノアッセイ17は、我々は、三次元の紙ベースのイムノアッセイの組立及び製造のために開発した戦略を説明するために例として使用されます。したがって、我々は、アセンブリと操作デバイスのではなく、アッセイの開発に焦点を当てます。
hCGを検出するために使用されるフォーマットであるサンドイッチイムノアッセイにおいて、ホルモンのサブユニットに特異的な捕捉抗体は、サンプルまたは後続の試薬の非特異的吸着を制限するためにブロックされている固体基板上にコーティングされます。この基板は、ほとんどの場合（酵素結合免疫吸着アッセイまたはELISAのために、例えば 、）ポリスチレンマイクロウェルプレートです。次いで、試料をありますウェルに添加し、一定期間インキュベートしました。厳密な洗浄の後、hCGの他のサブユニットに特異的な抗体を加え、インキュベートします。この検出抗体は、測定可能な信号を生成するために、コロイド粒子、酵素、または蛍光団に結合体化され得ます。ウェルを再び前（ 例えば 、プレートリーダーを用いて）アッセイの結果を解釈するために洗浄されます。市販のキットは、この時間のかかる多段階プロセスに依存しているが、これらのステップをすべてのユーザーに最小限の介入で紙ベースのマイクロ流体デバイス内で迅速に行うことができます。
hCGの免疫測定法に使用される装置は、試料添加、共役ストレージ、インキュベーション、捕獲、洗浄、及びブロット（ 図1）に使用される上から下に、6つの活性層を備えます。試料添加層を定性濾紙から作られます。これは、液体試料の導入を容易にし、共役レーに試薬を保護します環境やユーザによる偶然の接触による汚染からR。複合体層（定性濾紙）は、イムノアッセイ用の発色試薬（ 例えば 、金コロイド標識抗体）を保持します。インキュベーション層（定性濾紙）は、サンプルが次の層、捕捉層に到達する前に試薬と検体の結合を促進するために、紙の平面内で横方向に移動することを可能にします。捕獲層（ナイロン膜）が材料に吸着し、分析物に特異的なリガンドが含まれています。分析が完了した後、この層は、完成した免疫複合体の可視化を可能にするために明らかにされます。洗浄層（定性ろ紙）が離れブロット層（厚さのクロマトグラフィー紙）への捕獲層の面から自由に共役試薬を含む過剰の流体を描画します。 ASSEMの完全性を維持する永続的な接着剤4の層：6層装置は、パターン、両面接着の5層によって一緒に保持されています採血装置およびリムーバブル接着剤の1層は、捕捉層にイムノアッセイの結果を検査する装置の剥離を容易にします。
本稿の目的のために、我々は関係の専用の議論を可能にする紙ベースの免疫測定法の代表的な結果を提供するためのhCG（それぞれ0 MIU / mLおよび81 MIU / mLで）のみ陰性および陽性対照サンプルを使用します製造方法及び装置の性能。成功したデバイスを製造する方法を示すことに加えて、我々は、デバイスまたは再生不可能なアッセイ結果の故障につながる可能性がいくつかの製造誤差を強調表示します。この原稿で詳述したプロトコルとの議論は、紙ベースのイムノアッセイを設計・製造されているどのように貴重な洞察を持つ研究者を提供します。私たちは、イムノアッセイに私たちのデモを集中しながら、我々は、本明細書に提示ガイドラインは3-DIMENの製造に広く有用であろうと予想していますsional紙ベースのマイクロ流体デバイス。
Protocol
Representative Results
Discussion
再現可能な製造戦略を識別することはアッセイ開発の必須成分です。 22は、我々は3次元の紙ベースのマイクロ流体デバイスを製造するために、順次、層ごとのアプローチを使用します。 （ⅰ）複数の材料がする方法に変更することなく、単一のデバイス・アーキテクチャに組み込むことができます：紙23の単一のシートから多層デバイスを製造するための…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Tufts University and by a generous gift from Dr. James Kanagy. This material is based upon work supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant No. (DGE-1325256) that was awarded to S.C.F. D.J.W. was supported by a U.S. Department of Education GAANN fellowship. We thank Dr. Jeremy Schonhorn (JanaCare), Dr. Jason Rolland (Carbon3D), and Rachel Deraney (Brown University) for helping develop the design of the three-dimensional paper-based microfluidic device and immunoassay.
Materials
| Illustrator CC | Adobe | to design patterns for layers of paper and adhesive | |
| Xerox ColorQube 8580 printer | Amazon | B00R92C9DI | to print wax patterns onto layers of paper and Nylon |
| Isotemp General Purpose Heating and Drying Oven | Fisher Scientific | 15-103-0509 | to melt wax into paper |
| Artograph LightTracer | Amazon | B000KNHRH6 | to assist with alignment of layers |
| Apache AL13P laminator | Amazon | B00AXHSZU2 | to laminate layers together |
| Graphtec CE6000 Cutting Plotter | Graphtec America | CE6000-40 | to pattern adhesive films |
| Swingline paper cutter | Amazon | B0006VNY4C | to cut paper or devices |
| Epson Perfection V500 photo scanner | Amazon | B000VG4AY0 | to scan images of readout layer |
| economy plier-action hole punch | McMaster-Carr | 3488A9 | to remove alignment holes |
| Whatman chromatogrpahy paper, Grade 4 | Sigma Aldrich | WHA1004917 | |
| Fisherbrand chromatography paper (thick) | Fisher Scientific | 05-714-4 | to function as blot layer |
| Immunodyne ABC (0.45 µm pore size ) | Pall Corporation | NBCHI3R | to function as material for capture layer |
| removable/permanent adhesive-double faced liner | FLEXcon | DF021621 | to facilitate peeling |
| permanent adhesive-double faced liner | FLEXcon | DF051521 | |
| wax liner | FLEXcon | FLEXMARK 80 D/F PFW LINER | to assist with patterning adhesive |
| acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K266 | to fabricate frame |
| self-adhesive sheets | Fellowes | CRC52215 | to use as protective slip |
| absolute ethanol | VWR | 89125-172 | to sanitize work area |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 0332 | |
| Sekisui Diagnostics OSOM hCG Urine Controls | Fisher Scientific | 22-071-066 | to use as positive and negative samples |
| anti-β-hCG monoclonal antibody colloidal gold conjugate (clone 1) | Arista Biologicals | CGBCG-0701 | to treat conjugate layer |
| goat anti-α-hCG antibody | Arista Biologicals | ABACG-0500 | to treat capture layer |
| 10X phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| Oxoid skim milk powder | Thermo Scientific | OXLP0031B | |
| Tween 20 | AMRESCO | M147 |
References
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