Immunoassays के लिए तीन आयामी कागज आधारित microfluidic उपकरणों का निर्माण
Summary
हम विस्तार एक विधि immunoassays के विकास में उपयोग के लिए तीन आयामी कागज आधारित microfluidic उपकरणों बनाना। डिवाइस विधानसभा के लिए हमारा दृष्टिकोण बहुपरत का एक प्रकार है, additive विनिर्माण है। हम एक सैंडविच प्रतिरक्षा कागज आधारित उपकरणों की इन प्रकार के लिए प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करने के लिए प्रदर्शित करता है।
Abstract
कागज केशिका क्रिया के कारण स्वायत्त तरल पदार्थ wicks। हाइड्रोफोबिक बाधाओं के साथ कागज patterning करके, तरल पदार्थ के परिवहन को नियंत्रित और कागज के एक परत के भीतर निर्देशित किया जा सकता है। इसके अलावा, नमूनों कागज की कई परतों स्टैकिंग परिष्कृत तीन आयामी microfluidic नेटवर्क है कि विश्लेषणात्मक और Bioanalytical assays के विकास का समर्थन कर सकते हैं बनाता है। कागज आधारित microfluidic उपकरणों का उपयोग करने के लिए सस्ती, पोर्टेबल, आसान कर रहे हैं, और संचालित करने के लिए कोई बाहरी उपकरण की आवश्यकता है। नतीजतन, वे बिंदु का ध्यान निदान के लिए एक मंच के रूप में महान वादा पकड़। क्रम में ठीक उपयोगिता और कागज आधारित उपकरणों के विश्लेषणात्मक प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए, उपयुक्त तरीकों सुनिश्चित करने के लिए उनके निर्माण प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और एक पैमाने पर है कि प्रयोगशाला सेटिंग के लिए उपयुक्त है पर है विकसित किया जाना चाहिए। इस पांडुलिपि में, एक तरीका है कि कागज पर आधारित immunoassays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक सामान्य डिवाइस वास्तुकला वर्णन किया गया है बनाना। हम एडिटिव manufacturin के एक फार्म का उपयोगजी (बहु परत फाड़ना) उपकरण है कि नमूनों कागज और नमूनों चिपकने की कई परतें शामिल तैयार करने के लिए। मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन (एचसीजी) के लिए एक प्रतिरक्षा के साथ इन तीन आयामी कागज आधारित microfluidic उपकरणों के समुचित उपयोग के प्रदर्शन के अलावा, विनिर्माण प्रक्रिया में त्रुटियों है कि इस उपकरण विफलताओं में परिणाम हो सकता है पर विचार-विमर्श कर रहे हैं। हम कागज पर आधारित उपकरणों के निर्माण सीमित संसाधन सेटिंग के लिए विशेष रूप से डिजाइन विश्लेषणात्मक अनुप्रयोगों के विकास में व्यापक उपयोगिता मिलेगा इस दृष्टिकोण की उम्मीद है।
Introduction
कागज योगों या ग्रेड की श्रेणी में, धुन करने के लिए अपनी संपत्तियों क्रियाशील किया जा सकता है, और केशिका क्रिया या बाती से स्वायत्त तरल पदार्थ परिवहन कर सकते हैं व्यापक रूप से उपलब्ध है। कागज एक हाइड्रोफोबिक पदार्थ के साथ नमूनों है तो (जैसे, photoresist 1 या मोम 2), तरल पदार्थ की बाती स्थानिक कागज की एक परत के भीतर नियंत्रित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक आवेदन जलीय नमूना विभिन्न क्षेत्रों की एक संख्या में निर्देशित किया जा सकता कागज के भीतर जमा रासायनिक और जैव रासायनिक अभिकर्मकों के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए। ये कागज आधारित microfluidic उपकरणों पोर्टेबल और सस्ती विश्लेषणात्मक assays 3, 4, 5, 6, 7 के विकास के लिए एक उपयोगी मंच का प्रदर्शन किया गया है। कागज आधारित microfluidic उपकरणों के आवेदन शामिल हैं बिंदु का ध्यान निदानएफई "> 8, पर्यावरण दूषित पदार्थों को 9 की निगरानी, नकली दवाइयों 10 का पता लगाने, और delocalized हेल्थकेयर (या" टेलीमेडिसिन ") सीमित संसाधन में 11 सेटिंग्स।
नमूनों कागज की कई परतों के एक एकीकृत डिवाइस जहां पड़ोसी परतों (यानी, ऊपर या नीचे) से हाइड्रोफिलिक क्षेत्रों निरंतर fluidic नेटवर्क जिसका inlets और दुकानों मिलकर या स्वतंत्र छोड़ा जा सकता है फार्म से कनेक्ट में इकट्ठा किया जा सकता है। 12 प्रत्येक परत एक अद्वितीय पैटर्न है, जो अभिकर्मकों और कई assays के स्थानिक जुदाई एक डिवाइस पर प्रदर्शन किया जा करने में सक्षम बनाता शामिल कर सकते हैं। जिसके परिणामस्वरूप तीन आयामी microfluidic युक्ति न केवल विश्लेषणात्मक assays सक्षम करने के लिए तरल पदार्थ बाती करने में सक्षम है (जैसे, जिगर समारोह में 13 और 14 छोटे अणुओं की विद्युत का पता लगाने का परीक्षण करती है), लेकिन यह भी समर्थन कर सकते हैंपोर्ट परिष्कृत कार्यों का एक नंबर पारंपरिक microfluidic दृष्टिकोण के लिए आम (जैसे, 15 और सरल मशीनों 16 वाल्व)। महत्वपूर्ण बात है, क्योंकि कागज केशिका क्रिया द्वारा तरल पदार्थ wicks, इन उपकरणों उपयोगकर्ता से न्यूनतम प्रयास के साथ संचालित किया जा सकता है।
चूंकि अभिकर्मकों एक कागज आधारित डिवाइस के तीन आयामी संरचना के भीतर संग्रहीत किया जा सकता है, जटिल प्रोटोकॉल एक डिवाइस के लिए जलीय नमूना का एक भी इसके लिए कम किया जा सकता है। हाल ही में, हम उस कागज पर आधारित मोम-मुद्रण तकनीक का उपयोग नमूनों परतों बनाने के लिए immunoassays के विकास के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक सामान्य तीन आयामी डिवाइस वास्तुकला की शुरुआत की। 17, 18 ये कैसे खड़ी परतों की युक्ति संख्या के डिजाइन से संबंधित पहलुओं का इस्तेमाल किया, परतों की संरचना, और तीन आयामी microfluidic नेटवर्क नियंत्रित समग्र प्रति की तर्ज पर ध्यान केंद्रित अध्ययनोंप्रतिरक्षा के कामकाज। अंत में, हम इन डिजाइन के नियमों का उपयोग करने के लिए एक मल्टिप्लेक्स प्रतिरक्षा 19 के तेजी से विकास की सुविधा के लिए सक्षम थे। इस पांडुलिपि में, मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन (एचसीजी, गर्भावस्था हार्मोन) के लिए एक पहले से विकसित प्रतिरक्षा 17 रणनीति है कि हम विधानसभा और तीन आयामी कागज आधारित immunoassays के निर्माण के लिए विकसित किया है वर्णन करने के लिए एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है। तदनुसार, हम विधानसभा और एक परख के विकास के एक उपकरण के बजाय के संचालन पर ध्यान केंद्रित।
एक सैंडविच प्रतिरक्षा, जो एचसीजी, एक पर कब्जा करने के लिए एंटीबॉडी हार्मोन में से एक सबयूनिट एक ठोस सब्सट्रेट, जो फिर एक नमूना या बाद में किसी भी अभिकर्मक की गैर विशिष्ट सोखना सीमित करने अवरुद्ध है पर लेपित है विशिष्ट पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया प्रारूप है। इस सब्सट्रेट सबसे अधिक बार एक polystyrene microwell प्लेट (जैसे, एक एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख या एलिसा के लिए) है। नमूना तो हैएक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ा गया है और समय की अवधि के लिए सेते की अनुमति दी। कठोर धोने के बाद, एक एंटीबॉडी एचसीजी के अन्य सबयूनिट के लिए विशिष्ट जोड़ा और सेते की अनुमति दी है। यह पता लगाने के एंटीबॉडी के क्रम में एक औसत दर्जे का संकेत उत्पादन के लिए एक कोलाइडयन कण, एंजाइम, या fluorophore संयुग्मित जा सकता है। अच्छी तरह से फिर एक परख के परिणामों की व्याख्या (जैसे, एक प्लेट रीडर का उपयोग) करने से पहले धोया जाता है। जबकि वाणिज्यिक किट इस समय लेने वाली प्रक्रिया multistep पर भरोसा करते हैं, इन सभी चरणों के उपयोगकर्ता के लिए कम से कम हस्तक्षेप के साथ कागज पर आधारित microfluidic उपकरणों में तेजी से किया जा सकता है।
एचसीजी प्रतिरक्षा के लिए इस्तेमाल उपकरण छह सक्रिय परतों, जो कर रहे हैं, ऊपर से नीचे तक, नमूना इसके अलावा, साधना भंडारण, ऊष्मायन, कब्जा, धोने, और धब्बा (चित्रा 1) के लिए इस्तेमाल शामिल है। नमूना अलावा परत गुणात्मक फिल्टर पेपर से बनाया गया है। यह एक तरल नमूना की शुरूआत की सुविधा और साधना लेय में अभिकर्मकों की रक्षापर्यावरण या उपयोगकर्ता द्वारा आकस्मिक संपर्क के संक्रमण से आर। साधना परत (गुणात्मक फिल्टर पेपर) प्रतिरक्षा के लिए रंग-उत्पादक अभिकर्मक (जैसे, कोलाइडयन सोने लेबल एंटीबॉडी) रखती है। ऊष्मायन परत (गुणात्मक फिल्टर पेपर) नमूना कागज के हवाई जहाज के भीतर laterally यात्रा करने के लिए अगले परत, कब्जा परत तक पहुँचने से पहले अभिकर्मकों के साथ analyte के बंधन को बढ़ावा देने के लिए अनुमति देता है। कब्जा परत (नायलॉन झिल्ली) analyte सामग्री के लिए adsorbed के लिए विशिष्ट ligands शामिल हैं। परख पूरा हो गया है के बाद, इस परत पूरा immunocomplex के दृश्य सक्षम करने के लिए खुल गया है। धोने परत (गुणात्मक फिल्टर पेपर) मुक्त साधना अभिकर्मकों धब्बा परत (मोटी क्रोमैटोग्राफी कागज) में कब्जा परत के चेहरे से दूर सहित अतिरिक्त तरल पदार्थ छोड़ता है। छह-परत डिवाइस नमूनों, दो तरफा चिपकने के पाँच परतों के साथ आयोजित किया जाता है: स्थायी चिपकने के चार परतों विधानसभा की अखंडता को बनाए रखने के लिएलहूलुहान डिवाइस और हटाने योग्य चिपकने की एक परत पर कब्जा परत पर प्रतिरक्षा के परिणामों का निरीक्षण करने के लिए डिवाइस के छीलने की सुविधा।
इस पांडुलिपि के प्रयोजन के लिए, हम एचसीजी के केवल नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण नमूने का उपयोग (0 Miu / एमएल और 81 Miu / एमएल, क्रमशः) एक कागज पर आधारित प्रतिरक्षा, जो बीच के रिश्ते की एक समर्पित चर्चा परमिट के प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करने के लिए निर्माण विधियों और एक डिवाइस के प्रदर्शन। प्रदर्शन कैसे सफलतापूर्वक उपकरणों के निर्माण के अलावा, हम कई विनिर्माण त्रुटि है कि एक डिवाइस या irreproducible परख परिणामों की विफलता के लिए ले जा सकता है पर प्रकाश डाला। प्रोटोकॉल और चर्चा इस पांडुलिपि में विस्तृत कैसे कागज आधारित immunoassays बनाया गया है और निर्मित कर रहे हैं में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करेगा। हम immunoassays पर हमारे प्रदर्शन ध्यान केंद्रित करते हुए, हम आशा करते हैं कि इस के साथ साथ प्रस्तुत दिशा निर्देशों तीन Dimen के निर्माण के लिए मोटे तौर पर उपयोगी हो जाएगाप्रखंड कागज आधारित microfluidic उपकरणों।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विनिर्माण रणनीति की पहचान परख विकास का एक अनिवार्य घटक है। 22 हम एक अनुक्रमिक, परत दर परत दृष्टिकोण का उपयोग तीन आयामी कागज आधारित microfluidic उपकरणों के विनिर्माण। (I…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Tufts University and by a generous gift from Dr. James Kanagy. This material is based upon work supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant No. (DGE-1325256) that was awarded to S.C.F. D.J.W. was supported by a U.S. Department of Education GAANN fellowship. We thank Dr. Jeremy Schonhorn (JanaCare), Dr. Jason Rolland (Carbon3D), and Rachel Deraney (Brown University) for helping develop the design of the three-dimensional paper-based microfluidic device and immunoassay.
Materials
| Illustrator CC | Adobe | to design patterns for layers of paper and adhesive | |
| Xerox ColorQube 8580 printer | Amazon | B00R92C9DI | to print wax patterns onto layers of paper and Nylon |
| Isotemp General Purpose Heating and Drying Oven | Fisher Scientific | 15-103-0509 | to melt wax into paper |
| Artograph LightTracer | Amazon | B000KNHRH6 | to assist with alignment of layers |
| Apache AL13P laminator | Amazon | B00AXHSZU2 | to laminate layers together |
| Graphtec CE6000 Cutting Plotter | Graphtec America | CE6000-40 | to pattern adhesive films |
| Swingline paper cutter | Amazon | B0006VNY4C | to cut paper or devices |
| Epson Perfection V500 photo scanner | Amazon | B000VG4AY0 | to scan images of readout layer |
| economy plier-action hole punch | McMaster-Carr | 3488A9 | to remove alignment holes |
| Whatman chromatogrpahy paper, Grade 4 | Sigma Aldrich | WHA1004917 | |
| Fisherbrand chromatography paper (thick) | Fisher Scientific | 05-714-4 | to function as blot layer |
| Immunodyne ABC (0.45 µm pore size ) | Pall Corporation | NBCHI3R | to function as material for capture layer |
| removable/permanent adhesive-double faced liner | FLEXcon | DF021621 | to facilitate peeling |
| permanent adhesive-double faced liner | FLEXcon | DF051521 | |
| wax liner | FLEXcon | FLEXMARK 80 D/F PFW LINER | to assist with patterning adhesive |
| acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K266 | to fabricate frame |
| self-adhesive sheets | Fellowes | CRC52215 | to use as protective slip |
| absolute ethanol | VWR | 89125-172 | to sanitize work area |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 0332 | |
| Sekisui Diagnostics OSOM hCG Urine Controls | Fisher Scientific | 22-071-066 | to use as positive and negative samples |
| anti-β-hCG monoclonal antibody colloidal gold conjugate (clone 1) | Arista Biologicals | CGBCG-0701 | to treat conjugate layer |
| goat anti-α-hCG antibody | Arista Biologicals | ABACG-0500 | to treat capture layer |
| 10X phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| Oxoid skim milk powder | Thermo Scientific | OXLP0031B | |
| Tween 20 | AMRESCO | M147 |
References
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