Summary
PCRによる遺伝子改変は、酵母細胞およびタンパク質の可視化および定量化を容易にする、 カンジダ種で蛍光タンパク質融合体を生成するために使用することができます。ここで、我々は、 カンジダ・パラプシロシスに蛍光タンパク質融合（ENO1-FP）を構築するための方策を提示します。
Abstract
カンジダ種、腸管および尿生殖路の流行入植は、ヒトにおける侵襲性真菌感染症の大部分の原因となっています。このように、分子および遺伝子ツールは、それらの病因メカニズムの研究を促進するために必要とされています。 PCRによる遺伝子改変は、それらの検出を容易にするために、エピトープタグ融合タンパク質を生成する簡単かつ迅速なアプローチです。具体的には、蛍光タンパク質（FP）の融合体は、それぞれ、蛍光顕微鏡および免疫ブロッティングにより酵母細胞およびタンパク質の両方の可視化および定量化を可能にする強力なツールです。 FPをコードする配列を含むプラスミドは、 カンジダ種の形質転換を促進する栄養マーカー遺伝子と共に、 カンジダにおけるFPの構造および発現のために生成されています。ここで、我々は、 カンジダ種にFP融合を構築するための方策を提示します。ヌーセオスリシンresistaを含むプラスミドNCEの形質転換マーカー遺伝子（NAT1）、緑、黄、またはチェリーのFP（GFP、YFP、mCherryを）のいずれかのための配列は、FPカセットを生成するために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で、遺伝子特異的な配列を含むプライマーと一緒に使用されるとともに。この遺伝子特異的カセットは、相同組換えを介して、対応する遺伝子座の3 '末端に統合する能力を有しています。関心対象の遺伝子座にFPシーケンスが正常にインフレーム融合は、顕微鏡および/または免疫検出法により、融合タンパク質発現の分析に続いて、遺伝的に検証されます。また、高度に発現されたタンパク質の場合について、成功した融合体は、主に蛍光イメージング技術によってスクリーニングすることができます。
Introduction
カンジダ種は、すべての人間の腸や尿生殖路を植民地化共生菌で。その結果として免疫不全の条件、早産または癌の治療の免疫抑制作用で発生する下では、 カンジダ種は、日和見病原体になることができます。 カンジダ種のうち、 カンジダ・アルビカンスは、最も一般的な真菌の植民あり、侵襲性真菌感染症の大部分の原因となります。このようなC.グラブラタ 、C。パラプシローシス 、C。トロピカリス 、Cのような他のカンジダ種は、また、いくつかの展示固有抵抗で、免疫不全患者で重篤な感染症を引き起こすkruseii一般的にしたがって、このようなフルコナゾールやアムホテリシンBのような抗真菌性抗生物質を使用しますこれらの種のいくつかの感染は、特に抗真菌剤で予防的に治療を受けている患者では、より頻繁に観察されています。でも適切かつタイムリーなAとNTI-真菌治療は、侵襲性カンジダ感染症はかなりの罹患率と死亡率1と関連することを続けています。しかし、人の健康におけるカンジダ種の意義、その病因機構の研究と解明を可能にする、容易に入手可能な分子ツールの必要性があります。
研究者が視覚化し、微生物細胞とそれらが発現するタンパク質を定量化することを可能にする一つの重要なツールは、FP融合技術です。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）媒介遺伝子改変は、この論文に記載のように、FP配列、そのゲノム遺伝子座に目的の配列をコードカンジダタンパク質との間の融合物の構築を可能にします。構築物の安定な組込みは、タンパク質発現の解析だけでなく、タンパク質の局在のダイナミクスを容易にします。 FP配列を含むプラスミドは、 カンジダ・アルビカンスにおける発現のために最適化され、それは、PCR媒介Gで使用することができエン修飾戦略は、以前に2、3、4、5が構築されています。 C.アルビカンス及びC.パラプシローシス 2、3、4、5、6、7の変換を促進する栄養マーカー遺伝子に連結されたFPの配列：プラスミドはFP変換「カセット」を含みます。現在利用可能なプラスミドは選択可能な栄養栄養要求株の形質転換のためのマーカー遺伝子（URA3、HIS1、ARG4）だけでなく、栄養要求性を欠く臨床株の形質転換を容易に支配的な薬剤耐性マーカー（NAT1）、さまざまな含まれています。また、プラスミドは、最大4つの異なるFPシーケンス（緑[GFP]、YELLOのオプションが含まれています【YFP]ワット、シアン[CFP]、および桜[mCherryを]）およびカルボキシ末端タンパク質融合物の建設、またはアミノ末端タンパク質融合体の構築のためのプロモーター配列のためのADH1終結配列のいずれか。プライマーは、FPカセットを囲むプラスミドDNAの相同性を有するように設計されています。また、プライマーはまた、相同組換え（ 図1）を介してゲノム座にカセットの組込みを容易にタグ付けされるべき関心の酵母遺伝子に相同性をもつ5'-延長配列を含みます。遺伝子特異的FPカセットは、PCRによって生成され、酢酸リチウムで処理することによりDNAの取り込みのためにコンピテントカンジダ細胞に形質転換されます。
図1：FPシーケンス融合がカンジダ種にどのように生成されるかの図。 （A）プラスミドDNAはこちらよりエスFP配列および抵抗ヌーセオスリシンをコードする配列（NAT1）。フォワード（FWD）およびリバース（REV）プライマーの相対的位置は、プラスミド配列と相同性の領域を示すプライマーおよび遺伝子特異的相同領域またはプライマー伸長を示す紫色の部分の黒い部分で示されています。 （B）FPカセットは、 カンジダに形質転換し、相同組換え（点線）を介してENO1ゲノム遺伝子座の中に統合されています。 ENO1の3 '末端にFP融合配列を得られた（C）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ここで、我々は、 カンジダ種におけるタンパク質融合（ENO1-FP）の構造の例を提示します。私たちは、GFP、YFPをコードする配列とともにNAT1の形質転換マーカー遺伝子を含むタグ付けするプラスミドを使用しますか、mCherryを（ 図2）。これらのプラスミドは、そのカルボキシ末端でのFPに融合ENO1の発現をもたらす、ENO1の3 '末端へのFPの融合を促進する遺伝子特異的カセットを生成するために、PCRにおけるプライマーと一緒に使用されています。
図2：FPカセットを含むプラスミドのマップ。フォワード（F）および逆方向（R）プラスミドからカセットを生成するために使用されるプライマーは、プラスミドに対する相同性の相対的な位置と共に示されています。 表1に記載されたプライマー配列です。 F1およびR1もpYFP- NAT1カセットを生成するために使用しました。 YFP- NAT1カセット （pMG2263）を含有するプラスミドは、GFP配列の代わりにYFPを除いてpMG2120と同じです。カセットサイズ：GFP-NAT1、3.7 kbpの。 mCherry- NAT1、3.2 kbpの。 YFP- NAT1、3。7 kbpの。この図は、Gerami-Nejad、 らから変更されています。 4 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Protocol
大腸菌から1アイソテンプレートプラスミド
- 振盪しながら37℃で10 mlのLB培地（LB）+ 200 mg / Lのアンピシリン（AMP）で一晩鋳型プラスミドを含む大腸菌を成長させます。
- 2分間6000×gで遠心分離によって細胞を回収します。
- 液体をデカントし、のAusubelに前述したようにらの標準的な方法により、 大腸菌細胞からDNAを単離および精製します。 8。
- トリスEDTA中で再懸濁したDNA（TE、10mMトリス、pH8.0の、1mMのEDTA、pH8.0）で50〜100 ng / mlでの作業濃度で。
2.デザインプライマー
| プライマー | プライマー配列 |
| F1 | 5 ' |
| R1 | 5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC GTAAAACGACGGCCAGTGAATTC 3 ' |
| F2 | 5 'GAGAATTGAAGAAGAGTTGGGAGACAATGCTATCTATGCTGGTAAGGACTTCCACAATGCTCAAACTTTG GGTGGTGTTTCAAAAGGTGAAGAAGATAAT 3 ' |
| R2 | 5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC ACTGGATGGCGGCGTTAGTATC 3 ' |
表1：本研究で用いたプライマー配列。太字イタリック体のテキストは、通常のフォント領域はプラスミドDNAに相同である、ENO1ゲノム遺伝子座と相同性を示しています。
- <李>デザインプライマーは、遺伝子のゲノム遺伝子座への組換えを容易にするために、目的の標的遺伝子の3 '末端（ 例えば ENO1）に同様に増幅されるカセットに隣接する配列をプラスミドに相同であることにする（ 図2、 表1） 。
- なるように符号化フレームに加え、プラスミド配列の最初の約30塩基対を維持するために、フォワードプライマーの配列は、最後の目的の遺伝子の70塩基対（bp）、5'-3 '、マイナス停止コドンと一致していることを確認増幅されました。注意点としては、各プライマーでGGTGGTGGTTなしFP相同性を有するポリグリシンリンカーです。注目すべきは、リンカーの非存在下では、理論的には、タンパク質ミスフォールディング、タンパク質産生の低い収率、又は障害の生物活性をもたらすことができ、機能的ドメインの直接的な融合が存在することができます。
- リバースプライマー配列は、遺伝子の70 bpのすぐ下流にあることを確認してください3 '、5'、任意の遺伝子配列に加え、最後のアプロを含みませんximatelyプラスミドで使用される栄養または薬剤耐性マーカーの30bpの。
- 利用F1およびR1はpMG2343でmCherry- NAT1を生成するpMG2120とpMG2263、それぞれとF2とR2とのGFP-NAT1とYFP- NAT1カセットを生成します。
3. PCRによりFPカセットを生成します（1日目）
- PCR用試薬を準備します。 1.5ミリリットルチューブに以下の体積および濃度を追加することによって、マスターミックス（500μlの最終容量）を行います。50μlのPCR緩衝液（500mMの塩化カリウム、水中の100 mMトリスpHは8.0）、20μlのデオキシヌクレオチド（dNTP類;原料混合物各10mMのヌクレオチド）、40μlの25 mMの〜50-100 ngの/μlのストック溶液から塩化マグネシウム、20μlの精製されたプラスミド（）、10μlの各フォワードのと、（）10mMストック溶液から30μlのTaqポリメラーゼを逆方向プライマーポリメラーゼ（ジェネリック、5000単位/ ml）、および320μlの水。
- 10 PCR-の互換性がのそれぞれにマスターミックスのアリコート50μlのル0.5ミリリットルチューブ。
- 次の手順をサーモサイクラーにPCRチューブを配置し、実行：1サイクル分5を94℃で二本鎖DNAを変性させ; 94℃で45秒の40サイクルを順次、55℃で30秒のプライマーは、プラスミド鋳型DNAにアニールすることを可能にし、DNA産物の伸長のために68℃で4分間します。 72℃で15分の1の最終伸長サイクル。
注：PCRマスターミックス、サイクリングパラメータは、使用される特定のTaqポリメラーゼに基づいて変更する必要があります。 - プール1.5mlチューブ内の10のPCR反応からのすべての製品。
- アガロースゲル電気泳動にプールされたPCR産物の主題5μlのDNAラダーとの比較に基づいて、アンプリコンのサイズを確認し、生成物濃度の推定値を得ます。一般的に、後続の各形質転換混合物にカセットDNAの〜250μgのを使用します。
- 生成物を750μlの95％エタノール、続いて50μlの3M酢酸ナトリウムを添加することによってDNAを沈殿させ、少なくとも30分間インキュベート-20℃で
- 10分間16,000×gでチューブを遠心分離することにより、PCR産物を収穫。慎重に除去し、上清を捨て、一晩ペレットを乾燥させます。 40μlのTE pH8.0の中で乾燥させたDNAカセットペレットを再懸濁し、使用するまで室温で保管してください。
4. FP DNAカセットでカンジダ細胞を形質転換
- 1日目に、いくつかのストリーキングによって凍結15％グリセロール（-80°C）在庫から変換される回復する酵母株はアデニン（YPAD）寒天で酵母ペプトンデキストロース上に結晶を掻き取り、30℃でインキュベートします。コロニー増殖の回復後、通気キャップを有するガラス培養管2mlの液体YPAD培地に単一コロニーを接種し、攪拌しながら30℃で一晩インキュベートします。
- 2日目、通気性キャップと125ミリリットルの三角フラスコに（0.2〜の最終OD 600）新鮮なYPAD 50ミリリットルに一晩の酵母培養物の300μlの希釈します。 30℃で振ります（最終OD 600〜0.6から0.8へ）〜3時間。
- 50ミリリットルコニカルチューブに一晩培養物を注ぎ、テーブルトップ遠心機で1 500×gで5分間回転させることによって細胞をペレット化。
- 捨て、適切に上清を捨てます。 5ミリリットルの水で細胞ペレットを再懸濁します。テーブルトップ遠心機で1,500×gで5分間再度遠心分離して細胞を再ことペレット。
- 捨て、適切に上清を捨てます。 1.5mlチューブに転送中：500μlのTELiAc（10 mMトリス、pH8.0,1mMのEDTA、pHが8.0、0.1 M酢酸リチウムTEの酢酸リチウム）で細胞を再懸濁します。微量で3000×gで2分間遠心操作を。
- 250μlのTELiAcで細胞を再懸濁し。ペレットを含む総体積は〜300μlのでなければなりません。
- クリーン（4.2.4とは異なるマイクロチューブ）に、5μlのキャリアDNA（10mg / ml）および（4.2.4）から調製したカンジダ細胞の150μlのを追加します。これは、トンの陰性対照でありますransformation。
- 第二の清浄なマイクロチューブに、変性キャリアDNA5μlの（すなわち、10分間90℃で煮沸し、4℃に冷却されている）、（3.3.1）から調製されたPCR産物の全てを40μlおよび150を追加（4.2.4）から調製したカンジダ細胞 μlの。
- 室温で30分のための2つの形質転換混合物をインキュベートします。
- 各形質転換混合管に、700μlのプレートミックス（10mMのトリス、pH8.0の、1mMのEDTA、pH8.0の、50％のポリエチレングリコール3350 0.1 M酢酸リチウム）を加えます。 RTで一晩、それらを混合し、インキュベートするチューブを反転。
- 3日目に、変換は1時間42°C（ヒートショック）でミックスインキュベートします。
- 遠心分離機変換は微量で16,000×gで30秒間混合します。削除し、適切に上清を捨てます。細胞に損傷を与えないようにダウンして静かにピペッティングにより150μlの水で細胞ペレットのそれぞれを再懸濁します。
- 変換utのための栄養要求性マーカー遺伝子（ 例えば 、URA3）を ilizing、適切な選択培地寒天（ 例えばウリジンを欠く）の上にソリューションをピペッティングすることにより、各混合物全体をメッキし、滅菌ガラスビーズを用いて均一に混合物を広げました。
- ここに記載されるようにヌーセオスリシン耐性マーカー遺伝子（NAT1）を利用して変換するために、プレートの変換は、非選択YPAD寒天上に最初に混合し、6-12時間30℃でインキュベートします。ストレスをヌーセオスリシン前の細胞の回復、ポストヒートショックでこのステップ助剤は、適用されます。
- 部分的な成長の回復後、YPAD上にレプリカプレートカンジダ細胞が400μgの/ mlのヌーセオスリシン含みます。栄養マーカー遺伝子（ 例えば、URA3） を利用して変換するために、この中間のめっき工程が不要であり、4.4.2に記載のように細胞を直接選択酵母媒体（ 例えば YPAD欠くウリジン）上にプレーティングすることができます。
注：変換が成功した場合、列oniesは（ヌーセオスリシン含む寒天上での選択のための成長の潜在的に5日まで）1〜3日以内に表示されます。いいえコロニーは、単独でキャリアDNA（ネガティブコントロール）を含有する形質転換ミックスで拡散板に表示されないはずです。
- 栄養要求性とヌーセオスリシンマーカー選択のために、新鮮な選択培地寒天プレートに単一コロニーとしてスジ推定される形質転換体とFP融合の成功の建設のためにスクリーニングすることができる酵母細胞を増殖させるために30℃でインキュベートします。
- タギングカセットの正しい統合のための画面の形質転換体（詳しい例えば代表的な結果を参照してください）。目的の遺伝子は、十分な量で発現される場合、全体のコロニーの蛍光は、蛍光検出能力のプレートイメージングシステムを使用して、潜在的な候補の組込みを検出することができるように、発生する可能性があります。
- outsid配列とプライマーの相同性を用いたPCRによる推定の組込みを確認します積分領域の電子は、標的遺伝子への融合を確認しました。
- 既知の場合に加えて、タンパク質の局在を視覚的に確認のための単一細胞の蛍光顕微鏡検査によって、ならびに、融合タンパク質の発現およびサイズを決定するために、ウェスタンブロット分析を考えます。
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Representative Results
一例として、我々は、プロトコルを使用するC.パラプシローシスの実験室株でENO1するGFPとmCherryを融合物を構築するために、上述。各推定形質転換体は、最初は成長のために再ストリークしました。得られた融合タンパク質が高度に発現されるので、この例では（エノラーゼ）とFPを明るく、我々は前の診断PCR（ 図 3）6を実行する蛍光顕微鏡によって、形質転換体をスクリーニングすることができました。
図3： カンジダ形質転換体が示すコロニー蛍光。酵母プレートの成長の代表的な画像は、画像にmCherryを発現菌株およびCy2とフィルタYFP-及びGFP発現株画像のCy3フィルターを備えたレーザスキャニングシステムを使用して得られました。各ペアの左側のパネル、FP-expressingの株;対応するFP-発現株と同じフィルタを用いて画像化され、各ペアの右パネル、非形質転換親株（4175）。可視化に続いて、画像が反転し、明るさとコントラストは、FPが発現し、対照株のために同じように調整しました。この図は、 ら gonionの複数形、から許可を得て転載されています。 6 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ゲノムDNAは、これらの推定上の形質転換体の各々から9を単離し、（F及びRは、意図されたゲノム遺伝子座内でアニールをタグ付けするためのプライマー場所の外に、すなわち配列）カセット統合部位に隣接する配列に相補的なプライマーと一緒に、DNA鋳型として使用しました。 、診断のPCRでFPカセットの正しい組込みを確認するためだけの広報目的の遺伝子の終止コドンのIOR。ノートの、Cと酢酸リチウム形質転換のために。 パラプシロシス 、我々は、 カンジダ・アルビカンス変換の経験と比較して（〜スクリーニングコロニーの1から2パーセントが正しい統合が含まれている）低い効率を観察しました。
エノラーゼの局在を分析するために、我々は、ENO1-FPは、GFP、YFP及びテキサスレッドフィルターセットで100 Wの水銀ランプと落射蛍光照明を装備した光学顕微鏡を用いて、蛍光顕微鏡により構築発現する酵母細胞を観察しました。電荷結合素子（CCD）カメラは、画像解析ソフト（ 図4A）6で処理された画像を収集するために使用されました。また、我々は、異なるFPの色は視覚的に（ 図4B）6混合物内の異なる酵母株を区別するために有用であることがわかりました。エノラーゼは、高度に発現し、に位置しているので酵母細胞の大部分は、それへのFP融合を容易カンジダ -host相互作用の分析において、例えば、可視化することができる蛍光性酵母株を生成するために使用することができます。
図4：蛍光顕微鏡によりENO1-FP融合体の発現と局在。 （A）蛍光（上）および微分干渉コントラスト（DICは、ボトム） カンジダ株について画像はENO1-のFPを発現します。 C.アルビカンス およびC.パラプシローシスでENO1-のFPはなく、はるかに低い程度に、核ならびに細胞質に集中する傾向があります。 （B）ENO1-mCherryをとENO1-GFPを発現するカンジダ株の混合培養の顕微鏡画像。右側のパネル、テキサスレッドフィルター;センターパネル、GFPフィルター;右側のパネルには、DIC画像との両方の蛍光のパネルでマージします。スケールバー= 10ミクロン。この図は、 ら gonionの複数形、から許可を得て転載されています。 6 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
FP融合体はまた、ウェスタンブロッティングによりタンパク質発現レベルの分析を容易にします。上記プロトコルによって生成された酵母細胞を使用するタンパク質は、細胞溶解物から単離されたドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって分離し、ポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜10に転写しました。 ENO1-FP融合物は、以前6に記載されているように 、市販の抗体を用いてブロット上で検出しました。簡潔には、マウス抗GFP（1：2,000希釈）、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG、続いて（1：10,000希釈）抗体は、GFP-及びYFP-TAを探索するために使用されましたggedエノラーゼ。ウサギ抗mCherryを（1：2,000希釈）西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG、続いて（1：10,000希釈）抗体は、mCherryをタグエノラーゼ探索するために使用されました。すべての融合タンパク質を容易に成功した形質転換体（ 図5、レーン2,5、および7）6の溶解物から検出されたタンパク質ラダー標準およびC.アルビカンスエノラーゼ-FP標準（と比較して、予想されるサイズ（〜75 kDaの）でした図5、レーン1および6）6。全く信号がタグなしの親酵母株（ 図5、レーン3および4）6について観察されませんでした。
図5： カンジダ株からの細胞溶解物の免疫ブロット。 ENO1 -mCherryの融合を含むレーン1、 カンジダ・アルビカンス （J.バーマン、ミネソタ大学）（ポジティブコントロール）。レーン2、ENO1 -mCherryの融合を含むC.パラプシローシス 。レーン3および4、非形質転換C.パラプシローシス親株 4175 11（陰性対照）。レーン5、ENO1 -YFP融合を含むC.パラプシローシス 。レーン6、ENO1 -GFP融合（J.バーマン、ミネソタ大学）（ポジティブコントロール）を含むC.アルビカンス 。レーン7、ENO1 -GFP融合体を含むC.パラプシローシス 。レーンL、98および64 kDaのタンパク質標準とタンパク質ラダーが示されました。レーン1-3は、抗mCherryを抗体レーン4-7と共にインキュベートし、抗GFP抗体とインキュベートしました。この図は、 ら gonionの複数形、から許可を得て転載されています。 6 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| プロトコルステップ/商品 | 変形 | 潜在的な改善（注意） |
| プライマー設計 | 関心のゲノム遺伝子座に相同性の長い領域を含むことにより、プライマーを延長 | 結合効率との相同組換えを向上させる（プライマーの長さを修正することは、最適なアニーリング温度を変更することがあります） |
| PCR（アンプリコン品質） | 高い忠実度のTaqを使用します ゲルは、PCR産物を精製します | 配列および形質転換効率をゲノムへのプライマーの標的改善するために、カセットの配列にエラーを導入することを低減する（ゲル精製は、従って、アンプリコンの量と、形質転換効率を低下させることができます） |
| PCR（アンプリコン量） | PCR反応およびプールの製品の数を増やします | Increas形質転換された細胞の電子の数が（あまりアンプリコンも低減形質転換効率をもたらすことができます） |
| カセット沈殿 | 、4℃で遠心分離を行い、氷上ですべての試薬およびチューブを保ちます | DNAの収量を増加させると、それゆえ、形質転換効率 |
| 熱ショック | 時間を短縮 | ストレス酵母細胞の生存率を改善する（より短い熱ショック時間は、細胞によるDNAカセットの減少取り込みをもたらし得ます） |
| 回復の成長1 | ヌーセオスリシンを含む寒天にプレーティングする前に、YPAD寒天上の長い回復を可能に | ヌーセオスリシンにさらされたときにストレスを受けた酵母細胞は、長い回復時間を必要とするかもしれない（より長いインキュベーション時間は、また、汚染物質や偽陽性形質転換体の成長を増加させることができます） |
| コロニー伸長1,2 | 長い時間のためにプレートをインキュベート（〜5日） | セントressed酵母細胞がコロニー成長のためのより長いインキュベーション時間が必要になる場合があります（より長いインキュベーション時間は、また、汚染物質や偽陽性形質転換体の成長を増加させることができます） |
| 成長に影響する遺伝子変異を含有する酵母菌株のNAT1の選択マーカーを使用して変換する具体的な1または2の変換 | ||
表2：トラブルシューティングと最適化のためのガイド。
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Discussion
エピトープの構造は、上述したPCRによる遺伝子改変戦略を使用してカンジダ種における配列は3段階のプロセスとして要約することができるタグを付けました。まず、カセットは、両方の酵母ゲノムへの挿入の遺伝子座に相同な統合および領域に対して所望の配列をコードするPCRによって行われます。次に、形質転換される酵母細胞は、酢酸リチウムと化学的にコンピテントにされ、カセットと共培養しました。第三に、細胞は、形質転換体を回収するために選択培地上にプレーティングし、得られたコロニーを、所望のゲノム遺伝子座へのカセットの正しい組込みについて試験します。
C.アルビカンス及びC.パラプシローシス蛍光融合タンパク質を得るための成功率を向上させるために、このプロトコル内のいくつかの重要なステップがあります。まず、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製されたプライマーの使用（PAGE;メーカーによっては）非常にRECあります奨。精製せずに、カセットは、相同組換えが意図したゲノム遺伝子座に組み込まれる効率を低下させることができ、最終製品に間違った長さのプライマーを得る可能性の増加があります。第二に、我々は、PCR産物の正確な大きさを確保するために、アガロースゲル電気泳動によって〜カセットDNAを5μlを分析することによって、PCRで生成タギングカセットは高品質であることを確認することをお勧めします。第三に、形質転換のために最適化された酵母細胞を得るために、細胞は、それらの使用の前に顕微鏡によって明らか酵母芽で、対数増殖期にあるべきです。第四に、熱ショック後に選択培地上にプレーティングする前に、形質転換された酵母細胞の再懸濁の際に穏やかなピペッティング技術を使用することが不可欠です。第五に、benefであってもよいヌーセオスリシン含有培地上に複製する前に、YPAD寒天培地上での成長のためのより多くの時間を可能にする、酵母細胞に対して毒性であるヌーセオスリシン上の形質転換体の選択のための形質転換体の回復を促進するためにicial。意図されたゲノム位置の外側の最後の、無傷のプラスミドおよびPCRカセットの統合は、 カンジダで低周波数で発生し、またコロニー成長になります。したがって、統合のために使用される配列の外側のプライマーを用いたPCRにより、すべての形質転換されたコロニーを分析する必要があります。 PCRによって検証されていますが、顕微鏡により蛍光を示さない形質転換体は、細胞溶解物およびシーケンシングのウエスタンブロット分析は、さらに建設または可視化の失敗の理由を調査するために考慮されるべきです。これらの重要なステップに加えて、形質転換効率を改善し、正しいカセット統合の頻度を増加させるために必要に応じて、変更することができるプロトコルでいくつかのステップがあります。トラブルシューティングガイドは、 表2に示されています。
将来のアプリケーションのために最適化することができ、この技術の潜在的な限界があります。 lithiuCのためのより低い効率でDNAの変換結果に使用メートル酢酸法（〜スクリーニングコロニー1-2％が正しい統合が含まれています）。 C.アルビカンスと比較して、12を パラプシローシス 。エレクトロポレーションは、変換効率13を向上させることができる酢酸の変換をリチウムするための代替的なアプローチです。 ADH1ターミネーターを使用し、ユニバーサルタグ付け方法のために必要な一方で、ネイティブのターミネーター配列で発生したであろうものから、安定性および/または生成されたmRNAの規制を変更することができます。タンパク質のネイティブ関数は、特定の研究課題に重要である場合、この潜在的な問題を考慮する必要があります。低レベルで発現されている蛍光融合タンパク質の場合は、成功した形質転換のために全体のコロニー識別するために、顕微鏡または画面は選択肢ではないかもしれません。この場合、PCRおよびウェスタンブロット分析は成功した融合タンパク質sequの証拠を提供しますレンス/タンパク質構造。すべての融合タンパク質の構成に共通する限界は、エピトープタグは、融合タンパク質の異常な局在含む意図しない変異体の表現型、その結果、タンパク質の天然の機能を妨害することができることです。これらの問題を考慮することは重要であると示されているように、適切なコントロールが含まれるべきです。
このPCR媒介アプローチによりカンジダにおけるエピトープタグを生成するのに有用なプラスミドは、ここに述べたものに加えて、以前に私たちの研究グループによって生成されたと糸状菌遺伝ストックセンター（HTTP経由で研究者に利用できます。//www.fgsc。ネット）。これらのプラスミドのいくつかの詳細については、また、（http://www6.tau.ac.il/berman/）で見つけることができます。使用可能なプラスミドは、FP配列はアーカンソータンパク質を生成するために、異なる色の酵母、他のエピトープタグオプション（HA、MYC、V5、HIS9）を生成するために、栄養および薬剤耐性マーカーの組み合わせの無数を含みますeは、タンパク質の構成的および調節可能な発現のためにカルボキシまたはアミノ末端、およびプロモーター配列のいずれかでタグ付けされました。このツールが使用できなく、従来の栄養マーカーをレンダリング、原栄養ある臨床酵母株の形質転換および研究を可能にするように薬剤耐性マーカーを含むプラスミドは、真菌の病原性の分野に特に有益です。異なる波長で蛍光を発する臨床カンジダ株の構築は、共培養において複数の酵母株を視覚化し、分化する能力を必要とする細胞生物学の種々のアッセイのために有用であろう。
原因カンジダ種への侵襲性真菌性疾患は、14特に免疫不全患者では、治療が困難であり、高い罹患率と死亡率に関連付けられている重要なヒトの健康への挑戦であり続けて15。研究を可能にするこのように、分子ツールより迅速かつ簡単にカンジダ種宿主相互作用を研究する者は、 カンジダ生物学および病因メカニズムの理解を進めるために極めて重要です。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
私たちは、元のmCherryをFPシーケンスを提供するためのN.ディーンに感謝、M. Gerami-Nejadプラスミドの構築のために、このプロジェクトの開発中に有益な助言のための技術支援のためのB.ラーソン、およびT. Heisel。 JBは、欧州研究評議会上級賞340087（RAPLODAPT）によってサポートされていました。顕微鏡およびイメージングシステムは、ミネソタ小児科財団の大学とミネソタイメージングセンターの大学によって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 W mercury lamp | CHIU Technical Corporation | M-100T | |
| 95% Ethanol | Any | NA | |
| Adenine | Any | NA | |
| Ampicillin | Any | NA | |
| Carrier DNA | Ambion | AM9680 | Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml |
| CCD Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ | |
| Conical Tube | Corning | 430828 | 50 ml |
| Culture Tube Rotator | New Brunswick | 2013923 | TC-8, or Any Culture Tube Rotator |
| Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade | Any | NA | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 022363719, 022363212 | 0.5 ml, 1.5 ml |
| Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | 7250089 | 125 ml |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any | NA | |
| Freezer (-80 °C) | Thermo Electron Corporation | ULT-1386-9-V | Revco Ultima II |
| GFP, YFP and Texas Red Filter Sets | Chroma Technology Corporation | 49002, 86004v2, 49008 | |
| Glass culture tubes | Fisher Scientific | 1496126 | 75 mm |
| HRP goat anti-mouse antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2005 | |
| HRP goat anti-rabbit antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2301 | |
| Incubator (30 °C) | Any | NA | |
| Lithium Acetate | Any | NA | |
| Lysogeny Broth (LB) Media | Any | NA | |
| Magnesium Chloride | Any | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Microscope | Nikon | E600 | Nikon Eclipse E600 |
| Microscope Image Analysis Software | Universal Imaging Corporation | 6.3r7 | MetaMorph Software Series 6.3r7 |
| Mouse anti-GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| Nourseothricin | Fisher Scientific | 50997939 | |
| PCR Thermocycler | Applied Biosystems | 9700 | GeneAmp PCR System |
| PCR tubes | BioExpress, GeneMate | T-3035-1 | 0.2 ml |
| Polyethylene Glycol 3350 | Any | NA | |
| Potassium Chloride | Any | NA | |
| Rabbit anti-mCherry antibody | BioVision | 5993-100 | |
| Refrigerator (4 °C) | Any | NA | |
| Sodium Acetate | Any | NA | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Table Top Centrifuge | Labnet | Z 400 | Hermle Z 400 |
| Taq DNA Polymerase | Any | NA | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media | Any | NA |
References
- Bendel, C. M. Colonization and epithelial adhesion in the pathogenesis of neonatal candidiasis. Semin. Perinatol. 27 (5), 357-364 (2003).
- Gerami-Nejad, M., Berman, J., Gale, C. A. Cassettes for PCR-mediated construction of green, yellow, and cyan fluorescent protein fusions in Candida albicans. Yeast. 18 (9), 859-864 (2001).
- Gerami-Nejad, M., Dulmage, K., Berman, J. Additional cassettes for epitope and fluorescent fusion proteins in Candida albicans. Yeast. 26 (7), 399-406 (2009).
- Gerami-Nejad, M., Forche, A., McClellan, M., Berman, J. Analysis of protein function in clinical C. albicans isolates. Yeast. 29 (8), 303-309 (2012).
- Gerami-Nejad, M., Hausauer, D., McClellan, M., Berman, J., Gale, C. Cassettes for the PCR-mediated construction of regulatable alleles in Candida albicans. Yeast. 21 (5), 429-436 (2004).
- Gonia, S., Larson, B., Gale, C. A. PCR-mediated gene modification strategy for construction of fluorescent protein fusions in Candida parapsilosis. Yeast. 33 (2), 63-69 (2016).
- Milne, S. W., Cheetham, J., Lloyd, D., Aves, S., Bates, S. Cassettes for PCR- mediated gene tagging in Candida albicans utilizing nourseothricin resistance. Yeast. 28 (12), 833-841 (2011).
- Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. , Wiley. New York. (1995).
- Wilson, R. B., Davis, D., Mitchell, A. P. Rapid hypothesis testing with Candida albicans through gene disruption with short homology regions. J. Bacteriol. 181 (6), 1868-1874 (1999).
- Pulver, R., et al. Rsr1 focuses Cdc42 activity at hyphal tips and promotes maintenance of hyphal development in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (4), 482-495 (2013).
- Falgier, C., et al. Candida species differ in their interactions with immature human gastrointestinal epithelial cells. Pediatr. Res. 69 (5), 384-389 (2011).
- Nosek, J., et al. Genetic manipulation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis. Curr. Genet. 42 (1), 27-35 (2002).
- Zemanova, J., Nosek, J., Tomaska, L. High-efficiency transformation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis. Curr. Genet. 45 (3), 183-186 (2004).
- Benjamin, D. K., et al. Neonatal candidiasis among extremely low birth weight infants: risk factors, mortality rates, and neurodevelopmental outcomes at 18 to 22 months. Pediatrics. 117 (1), 84-92 (2006).
- Kullberg, B. J., Arendrup, M. C. Invasive Candidiasis. N Engl J Med. 373 (15), 1445-1456 (2015).
