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Genetics

में फ्लोरोसेंट प्रोटीन Fusions की पीढ़ी Published: March 4, 2017 doi: 10.3791/55333
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Pediatrics, University of Minnesota, 2Department of Molecular Microbiology and Biotechnology, Tel Aviv University

Summary

पीसीआर की मध्यस्थता जीन संशोधन कैंडिडा प्रजाति है, जो दृश्य और खमीर कोशिकाओं और प्रोटीन के quantitation की सुविधा में फ्लोरोसेंट प्रोटीन fusions उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस के साथ साथ, हम कैंडिडा parapsilosis में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन संलयन (Eno1-एफपी) के निर्माण के लिए एक रणनीति प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

कैंडिडा प्रजातियों, आंतों और genitourinary इलाकों की प्रचलित उपनिवेशवादियों, मनुष्यों में आक्रामक फंगल संक्रमण के बहुमत के कारण कर रहे हैं। इस प्रकार, आणविक और आनुवंशिक उपकरणों उनकी रोगजनन तंत्र के अध्ययन की सुविधा के लिए आवश्यक हैं। पीसीआर की मध्यस्थता जीन संशोधन के लिए एक सरल और त्वरित दृष्टिकोण उनका पता लगाने की सुविधा के लिए मिलान टैग प्रोटीन उत्पन्न करने के लिए है। विशेष रूप से, फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) fusions शक्तिशाली उपकरण है कि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और immunoblotting क्रमश दृश्य और दोनों खमीर कोशिकाओं और प्रोटीन के quantitation अनुमति देते हैं। एफपी एन्कोडिंग दृश्यों से युक्त, पोषण मार्कर जीन है कि Candida प्रजातियों के परिवर्तन की सुविधा के साथ-साथ plasmids, एफपी निर्माण और कैंडिडा में अभिव्यक्ति के प्रयोजन के लिए उत्पन्न किया गया है। इस के साथ साथ, हम एक Candida प्रजातियों में एक एफपी संलयन के निर्माण के लिए एक रणनीति प्रस्तुत करते हैं। nourseothricin resista युक्त plasmidsnce परिवर्तन मार्कर जीन (NAT1) या तो हरे, पीले, या चेरी एफपीएस (GFP, YFP, mCherry) प्राइमरों है कि एक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) में जीन विशिष्ट दृश्यों में शामिल हैं के साथ इस्तेमाल कर रहे हैं एक एफपी कैसेट उत्पन्न करने के लिए दृश्यों के साथ साथ । यह जीन विशिष्ट कैसेट मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से इसी जीन ठिकाना का 3'अंत में एकीकृत करने की क्षमता है। ब्याज की जीन ठिकाना में एफपी अनुक्रम के सफल में फ्रेम संलयन आनुवंशिक रूप से सत्यापित, माइक्रोस्कोपी और / या इम्युनो-तरीकों का पता लगाने से संलयन प्रोटीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के बाद है। इसके अलावा, अत्यधिक व्यक्त प्रोटीन के मामले के लिए, सफल fusions मुख्य रूप से के लिए प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीक के द्वारा जांच की जा सकती है।

Introduction

कैंडिडा प्रजातियों खानेवाला कवक है कि सभी मनुष्यों की आंतों और genitourinary इलाकों उपनिवेश स्थापित कर रहे हैं। ऐसी है कि समय से पहले जन्म या कैंसर के लिए उपचार से immunosuppressive प्रभाव के साथ होते हैं के रूप में इम्यूनो की शर्तों के तहत, कैंडिडा प्रजातियों अवसरवादी रोगजनकों बन सकता है। कैंडिडा प्रजातियों में से, कैंडिडा सफेद सबसे अधिक प्रचलित फंगल उपनिवेशवादी है और आक्रामक फंगल संक्रमण के बहुमत का कारण बनता है। ऐसे सी glabrata, सी parapsilosis, सी tropicalis, और सी के रूप में अन्य कैंडिडा प्रजातियां भी कुछ प्रदर्शन आंतरिक प्रतिरोध के साथ, immunocompromised रोगियों में गंभीर संक्रमण का कारण kruseii सामान्यतः इसलिए इस्तेमाल करने के लिए इस तरह के fluconazole और amphotericin बी के रूप में एंटी-फंगल एंटीबायोटिक दवाओं, इन प्रजातियों में से कुछ के साथ संक्रमण विशेष रूप से रोगियों prophylactically एंटी-फंगल एजेंटों के साथ इलाज किया जा रहा में अधिक बार मनाया जा रहा है। यहाँ तक कि उचित और समय पर एक साथएनटीआई कवक उपचार, आक्रामक कैंडिडा संक्रमण के महत्वपूर्ण रुग्णता और मृत्यु दर 1 के साथ जुड़े होने के लिए जारी है। मानव स्वास्थ्य में Candida प्रजातियों के महत्व की वजह से, आसानी से उपलब्ध आणविक उपकरण है कि अध्ययन और उनके रोगजनन तंत्र की व्याख्या की अनुमति देने के लिए एक की जरूरत है।

एक महत्वपूर्ण उपकरण है कि शोधकर्ताओं ने कल्पना और माइक्रोबियल कोशिकाओं और प्रोटीन है कि वे व्यक्त यों की अनुमति देता है एफपी संलयन प्रौद्योगिकी है। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) मध्यस्थता जीन संशोधन, इस पत्र में वर्णित के रूप में, fusions के निर्माण, एफपी दृश्यों और एक Candida प्रोटीन अपने जीनोमिक ठिकाना पर ब्याज के अनुक्रम कोडिंग के बीच की अनुमति देता है। निर्माण के स्थिर एकीकरण प्रोटीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के साथ ही प्रोटीन स्थानीयकरण गतिशीलता की सुविधा। एफपी दृश्यों से युक्त plasmids, कैंडिडा सफेद में अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित और कहा कि पीसीआर की मध्यस्थता ग्राम में इस्तेमाल किया जा सकताएकदा संशोधन रणनीति, पहले 2, 3, 4, 5 निर्माण किया गया है। एक एफपी अनुक्रम एक पोषण मार्कर जीन है कि सी सफेद और सी parapsilosis 2, 3, 4, 5, 6, 7 के परिवर्तन की सुविधा से जोड़ा: प्लास्मिड एफपी परिवर्तन "कैसेट" होते हैं। वर्तमान में उपलब्ध plasmids चयन पोषण मार्कर जीन (URA3, HIS1, ARG4) auxotrophic उपभेदों के परिवर्तन के लिए और साथ ही एक प्रमुख दवा प्रतिरोध मार्कर (NAT1), जो auxotrophies कमी नैदानिक उपभेदों के परिवर्तन की सुविधा की एक किस्म के होते हैं। इसके अलावा, plasmids Yello अप करने के लिए चार अलग-अलग दृश्यों एफपी (हरी [GFP], के लिए विकल्पों में शामिलw [YFP], सियान [सीएफपी], और चेरी [mCherry]) और carboxy टर्मिनस प्रोटीन fusions के निर्माण, या अमीनो टर्मिनस प्रोटीन fusions के निर्माण के लिए एक प्रमोटर अनुक्रम के लिए एक ADH1 समाप्ति अनुक्रम हैं या तो। प्राइमर एफपी कैसेट आसपास के डीएनए को समरूपता के साथ डिजाइन किए हैं। इसके अलावा, प्राइमरों भी ब्याज की खमीर जीन चिह्नित किया है, जो मुताबिक़ पुनर्संयोजन (चित्रा 1) के माध्यम से जीनोमिक ठिकाना में कैसेट के एकीकरण की सुविधा के लिए असर अनुरूपता 5'-विस्तार दृश्यों होते हैं। जीन विशिष्ट एफपी कैसेट पीसीआर द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं और उसके बाद लिथियम एसीटेट के साथ इलाज के द्वारा डीएनए के तेज के लिए सक्षम बनाया कैंडिडा कोशिकाओं में तब्दील हो।

आकृति 1
चित्रा 1: कैसे एफपी अनुक्रम fusions कैंडिडा प्रजातियों में उत्पन्न कर रहे हैं का आरेख। (ए) प्लास्मिड डीएनए समेततों एक एफपी अनुक्रम और nourseothricin प्रतिरोध (NAT1) एक दृश्य एन्कोडिंग। फॉरवर्ड (अग्रेषित) और रिवर्स (REV) प्राइमरों के सापेक्ष स्थानों प्राइमरों प्लाज्मिड अनुक्रम करने के लिए अनुरूपता के क्षेत्र का संकेत है और बैंगनी रंग के कुछ भागों जीन विशिष्ट अनुरूपता क्षेत्र या प्राइमर विस्तार दर्शाने के काले भागों के साथ दिखाया जाता है। (बी) एफपी कैसेट कैंडिडा में तब्दील कर रहे हैं और मुताबिक़ पुनर्संयोजन (बिंदीदार रेखा) के माध्यम से ENO1 जीनोमिक ठिकाना भीतर एकीकृत। (सी) ENO1 की 3'end पर जिसके परिणामस्वरूप एफपी संलयन अनुक्रम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इस के साथ साथ, हम कैंडिडा प्रजातियों में प्रोटीन संलयन (Eno1-एफपी) निर्माण का एक उदाहरण प्रस्तुत करते हैं। हम एन्कोडिंग GFP, YFP दृश्यों के साथ साथ NAT1 परिवर्तन मार्कर जीन युक्त plasmids टैगिंग का उपयोग, याmCherry (चित्रा 2)। ये प्लास्मिड जीन विशिष्ट कैसेट कि ENO1 की 3'अंत एफपीएस के विलय की सुविधा उत्पन्न करने के लिए, Eno1 की अभिव्यक्ति अपनी carboxy टर्मिनस पर एफपीएस के लिए जुड़े हुए है, जिसके परिणामस्वरूप पीसीआर में प्राइमरों के साथ किया जाता है।

चित्र 2
चित्रा 2: एफपी कैसेट युक्त plasmids के मानचित्र। फॉरवर्ड (एफ) और रिवर्स (आर) plasmids से कैसेट उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों plasmids के लिए उनकी अनुरूपता के रिश्तेदार स्थान के साथ संकेत कर रहे हैं। प्राइमर दृश्यों 1 टेबल में सूचीबद्ध के रूप में कर रहे हैं। F1 और R1 भी pYFP- NAT1 कैसेट उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया। प्लाज्मिड YFP- NAT1 कैसेट (pMG2263) युक्त GFP अनुक्रम के स्थान पर YFP के अपवाद के साथ pMG2120 के समान है। कैसेट आकार: GFP-NAT1, 3.7 KBP; mCherry- NAT1, 3.2 KBP; YFP- NAT1, 3।7 KBP। यह आंकड़ा Gerami-नेजाद, एट अल से संशोधित किया गया है। 4 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

ई कोलाई से 1. अलग खाका प्लास्मिड

  1. टेम्पलेट प्लाज्मिड झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिलीलीटर Lysogeny शोरबा (पौंड) + 200 मिलीग्राम / एल एम्पीसिलीन (एएमपी) में रात भर युक्त ई कोलाई के लिए आगे बढ़ें।
  2. 2 मिनट के लिए 6000 XG पर centrifuging द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं।
  3. , तरल छानना अलग और डीएनए को शुद्ध रूप में Ausubel एट अल में पहले से वर्णित ई एक मानक विधि द्वारा कोशिकाओं कोलाई से। 8।
  4. 50-100 एनजी / एमएल के एक काम एकाग्रता में; Tris EDTA (10 मिमी Tris, पीएच 8.0, 1 मिमी EDTA, 8.0 पीएच ते) में Resuspend डीएनए।

2. डिजाइन प्राइमर

भजन की पुस्तक प्राइमर अनुक्रम
एफ 1 5 ' GGTGGTTCTAAAGGTGAAGAATTATT 3 '
R1 5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC
GTAAAACGACGGCCAGTGAATTC 3 '
F2 5 'GAGAATTGAAGAAGAGTTGGGAGACAATGCTATCTATGCTGGTAAGGACTTCCACAATGCTCAAACTTTG
GGTGGTGTTTCAAAAGGTGAAGAAGATAAT 3 '
R2 5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC
ACTGGATGGCGGCGTTAGTATC 3 '

तालिका 1: प्राइमर इस अध्ययन में इस्तेमाल दृश्यों। बोल्ड इटैलिक पाठ ENO1 जीनोमिक ठिकाना करने अनुरूपता इंगित करता है, सामान्य फ़ॉन्ट क्षेत्रों डीएनए प्लाज्मिड मुताबिक़ कर रहे हैं।

    <li> डिजाइन प्राइमरों प्लाज्मिड कैसेट की सीमा से लगे दृश्यों जीन के जीनोमिक ठिकाना में पुनर्संयोजन की सुविधा के लिए ब्याज का लक्ष्य जीन (जैसे ENO1) की 3'अंत करने के साथ ही परिलक्षित हो मुताबिक़ होना करने के लिए (चित्रा 2 और 1 टेबल) ।
    1. सुनिश्चित करें कि आगे प्राइमर दृश्यों, पिछले 70 आधार जोड़े हित के जीन की (बीपी), 5'- 3 ', शून्य से रोकने के कोडोन से मेल कोडिंग फ्रेम बनाए रखने के लिए, प्लस प्लाज्मिड अनुक्रम का पहला लगभग 30 बीपी होना करने के लिए प्रवर्धित। एक नोट के रूप में, प्रत्येक प्राइमर में GGTGGTGGTT कोई एफपी समरूपता के साथ एक पाली ग्लाइसिन लिंकर है। ध्यान से, एक लिंकर के अभाव में, वहाँ कार्यात्मक डोमेन, जो सैद्धांतिक रूप से प्रोटीन misfolding, प्रोटीन के उत्पादन में कम उपज, या बिगड़ा bioactivity करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के प्रत्यक्ष संलयन हो सकता है।
    2. सुनिश्चित करें कि रिवर्स प्राइमर दृश्यों 70 बीपी सिर्फ जीन के बहाव हैं 3'- 5 ', किसी भी जीन अनुक्रम, प्लस पिछले appro सहित नहींximately प्लाज्मिड में इस्तेमाल पोषण या दवा प्रतिरोध मार्कर के 30 बीपी।
    3. उपयोग F1 और R1 pMG2120 और pMG2263 क्रमश: और F2 और R2 के साथ GFP- NAT1 और YFP- NAT1 कैसेट उत्पन्न करने के लिए pMG2343 साथ mCherry- NAT1 उत्पन्न करते हैं।

3. पीसीआर द्वारा एफपी कैसेट्स उत्पन्न दिवस (1)

  1. पीसीआर के लिए अभिकर्मकों तैयार करें। एक मास्टर मिश्रण (500 μl अंतिम मात्रा) एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के लिए निम्न मात्रा और सांद्रता जोड़कर बनाओ: 50 μl पीसीआर बफर (500 मिमी पोटेशियम क्लोराइड, पानी में 100 मिमी Tris पीएच 8.0), 20 μl deoxynucleotides (dNTPs; शेयर मिश्रण 10 मिमी प्रत्येक), 40 μl 25 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड पर न्यूक्लियोटाइड के 20 μl शुद्ध ~ 50-100 एनजी / μl शेयर समाधान से प्लाज्मिड (), प्रत्येक आगे और 10 मिमी शेयर समाधान से प्राइमर (रिवर्स 10 μl), 30 μl Taq पोलीमर्स (सामान्य, 5000 इकाइयों / एमएल), और 320 μl पानी।
    1. अशेष 50 10 पीसीआर Compatib में से प्रत्येक में मास्टर मिश्रण के μlLe 0.5 मिलीलीटर ट्यूब।
  2. 94 डिग्री सेल्सियस पर 1 से 5 मिनट के चक्र dsDNA denature करने के लिए;: thermocycler में पीसीआर ट्यूबों प्लेस और चलाने के लिए निम्नलिखित कदम 94 डिग्री सेल्सियस पर 45 सेकंड के 40 चक्रों क्रमिक रूप से, 55 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के प्राइमरों प्लाज्मिड टेम्पलेट डीएनए के लिए पानी रखना करने की अनुमति है, और डीएनए उत्पादों के विस्तार के लिए 68 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट; और 72 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के 1 अंतिम विस्तार चक्र।
    नोट: पीसीआर मास्टर मिश्रण और साइकिल चालन के मापदंडों का इस्तेमाल किया विशेष Taq पोलीमर्स के आधार पर संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है।
  3. पूल एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 10 पीसीआर प्रतिक्रियाओं से सभी उत्पादों।
    1. विषय 5 agarose जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए जमा पीसीआर उत्पाद के μl amplicon आकार को सत्यापित करने और उत्पाद एकाग्रता के एक अनुमान प्राप्त करने के लिए, एक डीएनए सीढ़ी की तुलना पर आधारित है। आम तौर पर, प्रत्येक बाद परिवर्तन मिश्रण में ~ कैसेट डीएनए के 250 माइक्रोग्राम का उपयोग करें।
    2. 50 μl 3 एम सोडियम एसीटेट उत्पादों के लिए 750 μl 95% इथेनॉल के बाद जोड़कर डीएनए वेग और कम से कम 30 मिनट के लिए सेते-20 डिग्री सेल्सियस पर
    3. 10 मिनट के लिए 16,000 XG पर ट्यूब centrifuging द्वारा पीसीआर उत्पादों की फसल। ध्यान से निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें और रात में गोली सूखी। 40 μl ते पीएच 8.0 में सूखे डीएनए कैसेट गोली Resuspend और उपयोग करें जब तक कमरे के तापमान पर स्टोर।

4. एफपी डीएनए कैसेट के साथ कैंडिडा कोशिकाओं को बदलने

  1. दिन 1 पर, ठीक खमीर तनाव एक 15% ग्लिसरॉल जमे हुए (-80 डिग्री सेल्सियस) स्टॉक के साथ एडिनाइन (YPAD) अगर खमीर peptone डेक्सट्रोज पर कुछ scraped क्रिस्टल streaking और 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते द्वारा से तब्दील किया जा सके। कॉलोनी विकास की वसूली के बाद, एक सांस टोपी के साथ एक गिलास संस्कृति ट्यूब में 2 मिलीलीटर तरल YPAD मध्यम में एक ही कॉलोनी टीका लगाना और आंदोलन के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
  2. दिन 2 पर, रात भर खमीर संस्कृति के 300 μl 50 मिलीलीटर में एक सांस टोपी के साथ एक 125 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क में ताजा YPAD (एक अंतिम आयुध डिपो के 600 ~ 0.2) पतला। 30 डिग्री सेल्सियस पर हिला~ 3 घंटा (एक अंतिम 600 आयुध डिपो ~ 0.6-0.8 करने के लिए) के लिए।
    1. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में रातोंरात संस्कृति डालो और एक तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र में 1 500 XG पर 5 मिनट के लिए कताई द्वारा गोली कोशिकाओं।
    2. डालो और ठीक तरह से सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 5 मिलीलीटर पानी में सेल गोली Resuspend। एक तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र में 1,500 XG पर 5 मिनट के लिए फिर से centrifuging द्वारा कोशिकाओं को फिर से गोली।
    3. डालो और ठीक तरह से सतह पर तैरनेवाला त्यागें। जबकि एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को स्थानांतरित: 500 μl TELiAc (10 मिमी Tris, पीएच 8.0, 1 मिमी EDTA, पीएच 8.0, 0.1 एम लिथियम एसीटेट ते लिथियम एसीटेट) में कोशिकाओं Resuspend। एक microcentrifuge में 3,000 XG पर 2 मिनट के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र।
    4. 250 μl TELiAc में Resuspend कोशिकाओं। गोली सहित कुल मात्रा ~ 300 μl होना चाहिए।
  3. एक साफ (4.2.4 की तुलना में अलग microfuge ट्यूब) के लिए, 5 μl वाहक डीएनए (10 मिलीग्राम / एमएल) और (4.2.4) से तैयार कैंडिडा कोशिकाओं के 150 μl जोड़ें। यह टी के लिए नकारात्मक नियंत्रण हैransformation।
    1. एक दूसरे को साफ microfuge ट्यूब, 150 विकृत वाहक डीएनए के 5 μl (है कि 10 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर उबले कर दिया गया है और 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा), (3.3.1) से तैयार पीसीआर उत्पाद के सभी 40 μl और जोड़ने तैयार कैंडिडा कोशिकाओं के μl (4.2.4) से।
    2. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए दो परिवर्तन घोला जा सकता है सेते हैं।
    3. प्रत्येक परिवर्तन मिश्रण ट्यूब करने के लिए, 700 μl थाली मिश्रण (10 मिमी Tris, पीएच 8.0, 1 मिमी EDTA, पीएच 8.0, 0.1 एम 50% पॉलीथीन ग्लाइकोल 3350 में लिथियम एसीटेट) जोड़ें। ट्यूबों पलटना मिश्रण है और उन्हें आरटी पर रातोंरात सेते हैं करने के लिए।
  4. दिन 3 पर, सेते परिवर्तन 1 घंटे के लिए 42 डिग्री सेल्सियस (गर्मी सदमे) में घोला जा सकता है।
    1. अपकेंद्रित्र परिवर्तन एक microcentrifuge में 16,000 XG पर 30 सेकंड के लिए घोला जा सकता है। निकालें और ठीक तरह से सतह पर तैरनेवाला त्यागें। धीरे से ऊपर pipetting द्वारा 150 μl पानी में सेल छर्रों से प्रत्येक Resuspend और नीचे इतनी के रूप में कोशिकाओं को नुकसान नहीं है।
    2. परिवर्तनों केन्द्र शासित प्रदेशों के लिएauxotrophic मार्कर जीन (जैसे URA3) ilizing, उचित चयनात्मक मीडिया अगर पर समाधान pipetting (जैसे कमी uridine) द्वारा प्रत्येक पूरे मिश्रण थाली और मिश्रण समान रूप से बाँझ ग्लास मनकों का उपयोग फैल गया।
    3. Nourseothricin प्रतिरोध मार्कर जीन (NAT1) का उपयोग परिवर्तनों के लिए, के रूप में यहाँ वर्णित है, प्लेट परिवर्तन पहले गैर चयनात्मक YPAD अगर पर घोला जा सकता है और 6-12 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। सेल वसूली, पोस्ट गर्मी सदमे में यह कदम एड्स, तनाव nourseothricin से पहले लागू किया जाता है।
    4. आंशिक विकास वसूली के बाद, YPAD पर प्रतिकृति प्लेट कैंडिडा कोशिकाओं 400 माइक्रोग्राम / एमएल nourseothricin हैं। पोषण मार्कर जीन (जैसे URA3) का उपयोग परिवर्तनों के लिए, इस मध्यवर्ती चढ़ाना कदम की जरूरत नहीं है और कोशिकाओं को सीधे चयनात्मक खमीर मीडिया (जैसे YPAD कमी uridine) 4.4.2 में वर्णित के रूप पर चढ़ाया जा सकता है।
      नोट: परिवर्तन सफल होता है, कर्नलonies (संभावित nourseothricin युक्त अगर पर चयन के लिए परिणाम के पांच दिनों के लिए) एक से तीन दिन के भीतर दिखाई देनी चाहिए। कोई कालोनियों परिवर्तन वाहक डीएनए लड़का (नकारात्मक नियंत्रण) युक्त घोला जा सकता है के साथ फैल प्लेटों पर दिखाई देनी चाहिए।
  5. auxotrophic और nourseothricin मार्कर चयन, ताजा चयनात्मक मीडिया अगर प्लेट को एकल कालोनियों के रूप में ख्यात लकीर transformants और 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते खमीर कोशिकाओं है कि एफपी fusions के सफल निर्माण के लिए जांच की जा सकती है, प्रचार करने के लिए।
  6. स्क्रीन transformants टैगिंग कैसेट का सही एकीकरण के लिए (एक विस्तृत उदाहरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम देखें)। ब्याज की जीन पर्याप्त मात्रा में व्यक्त किया जाता है, तो पूरी कॉलोनी प्रतिदीप्ति इस तरह हो सकता है कि यह प्रतिदीप्ति का पता लगाने की क्षमता के साथ एक थाली इमेजिंग प्रणाली का उपयोग संभावित उम्मीदवार integrants का पता लगाने के लिए संभव है।
    1. पीसीआर outsid दृश्यों के लिए प्राइमरों मुताबिक़ का उपयोग करके ख्यात integrants की जाँच करेंएकीकरण के क्षेत्र की ई लक्ष्य जीन संलयन पुष्टि करने के लिए।
    2. इसके अलावा, अभिव्यक्ति और संलयन प्रोटीन के आकार का निर्धारण करने के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण, साथ ही द्वारा प्रोटीन स्थानीयकरण के दृश्य पुष्टि, अगर जाना जाता है के लिए एकल कक्षों के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी पर विचार करें।

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Representative Results

एक उदाहरण के रूप में, हम एक सी parapsilosis प्रयोगशाला तनाव में Eno1 को GFP और mCherry fusions के निर्माण के लिए प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित किया करते थे। प्रत्येक ख्यात transformant शुरू में विकास के लिए restreaked था। इस उदाहरण में, के बाद से उसके एवज में संलयन प्रोटीन अत्यधिक व्यक्त किया जाता है (enolase) और एफपीएस उज्ज्वल है, हम नैदानिक पीसीआर प्रदर्शन करने से पहले प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा transformants स्क्रीन करने में सक्षम थे (चित्रा 3) 6।

चित्र तीन
चित्रा 3: कालोनी प्रतिदीप्ति कैंडिडा transformants द्वारा प्रदर्शन किया। खमीर प्लेट विकास की छवियों प्रतिनिधि एक लेजर स्कैनिंग छवि के लिए एक फिल्टर Cy3 mCherry व्यक्त तनाव और छवि YFP- और GFP व्यक्त उपभेदों के लिए एक Cy2 फिल्टर से लैस प्रणाली का उपयोग कर प्राप्त की। प्रत्येक जोड़ी में वाम पैनल, एफपी-expressiएनजी उपभेदों; प्रत्येक जोड़ी में सही पैनल, गैर तब्दील हो माता पिता के तनाव (4175) इसी एफपी व्यक्त तनाव के रूप में एक ही फिल्टर के साथ imaged। दृश्य के बाद, छवियों उल्टे थे और चमक और विपरीत एफपी व्यक्त और नियंत्रण उपभेदों के लिए हूबहू समायोजित किया गया। यह आंकड़ा Gonia, एट अल से अनुमति के साथ reprinted है। 6 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

जीनोमिक डीएनए इन ख्यात transformants में से प्रत्येक से 9 अलग-थलग और, कैसेट एकीकरण की साइटों flanking दृश्यों के लिए पूरक प्राइमरों के साथ (यानी दृश्यों जहां एफ और आर प्राइमरों इरादा जीनोमिक ठिकाना भीतर पानी रखना चिह्नित किया के बाहर) डीएनए टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था साथ , नैदानिक ​​PCRs में एफपी कैसेट का सही एकीकरण को सत्यापित करने के लिए सिर्फ जनसंपर्कब्याज की जीन की रोक कोडोन करने के लिए आईओआर। ध्यान दें, सी के साथ लिथियम एसीटेट परिवर्तनों के लिए। parapsilosis, हम कम दक्षता मनाया (~ जांच की कालोनियों का 1-2% एक सही एकीकरण निहित) सी सफेद परिवर्तनों के साथ हमारे अनुभव की तुलना में।

enolase स्थानीयकरण का विश्लेषण करने के लिए, हम खमीर कोशिकाओं को व्यक्त Eno1-एफपी एक 100 डब्ल्यू पारा दीपक और GFP, YFP और टेक्सास लाल फिल्टर सेट के साथ epifluorescence रोशनी से लैस एक photomicroscope का उपयोग कर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा constructs मनाया। एक आरोप युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा छवियों कि छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (चित्रा 4 ए) 6 के साथ प्रोसेस किया गया इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इसके अलावा, हमने पाया है कि अलग अलग एफपी रंग नेत्रहीन एक मिश्रण (चित्रा 4 बी) 6 के भीतर विभिन्न खमीर उपभेदों भेद करने के लिए उपयोगी थे। क्योंकि enolase अत्यधिक व्यक्त की और में स्थित हैखमीर सेल के एक बड़े हिस्से में, यह करने के लिए एफपी fusions फ्लोरोसेंट खमीर उपभेदों है कि आसानी से देखे जा सकते हैं, उदाहरण के लिए, कैंडिडा मेजबान बातचीत के विश्लेषण में उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

चित्रा 4
चित्रा 4: अभिव्यक्ति और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा Eno1-एफपी fusions के स्थानीयकरण। (ए) प्रतिदीप्ति (ऊपर) और अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी, नीचे) कैंडिडा उपभेदों के लिए छवियों को व्यक्त Eno1-एफपीएस। सी सफेद और सी parapsilosis में Eno1-एफपीएस नाभिक में के रूप में अच्छी तरह से कोशिका द्रव्य में ध्यान केंद्रित करते हैं, लेकिन एक बहुत कम डिग्री करने के लिए। (बी) कैंडिडा उपभेदों Eno1-mCherry और Eno1-GFP व्यक्त करने का एक मिश्रित संस्कृति का सूक्ष्म छवियों। राइट पैनल, टेक्सास लाल फिल्टर; केंद्र पैनल, GFP फिल्टर; सही पैनल, डीआईसी छवि के साथ दोनों फ्लोरोसेंट पैनल के विलय। स्केल सलाखों = 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा Gonia, एट अल से अनुमति के साथ reprinted है। 6 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एफपी fusions भी पश्चिमी सोख्ता द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के विश्लेषण की सुविधा। प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित द्वारा उत्पन्न खमीर कोशिकाओं का प्रयोग, प्रोटीन सेल lysates, सोडियम सल्फेट dodecyl-जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) द्वारा अलग से अलग है, और एक polyvinylidene difluoride (PVDF) झिल्ली 10 को हस्तांतरित कर दिया गया। Eno1-एफपी fusions व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी का उपयोग कर के रूप में पहले 6 वर्णित blots पर पता चला रहे थे। संक्षेप में, माउस विरोधी GFP (1: 2,000 कमजोर पड़ने), हॉर्सरैडिश peroxidase संयुग्मित बकरी विरोधी माउस आईजीजी द्वारा पीछा (1: 10,000 कमजोर पड़ने) एंटीबॉडी GFP- और YFP-टा के लिए जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गयाgged enolase। खरगोश विरोधी mCherry (1: 2,000 कमजोर पड़ने) हॉर्सरैडिश peroxidase संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी द्वारा पीछा (1: 10,000 कमजोर पड़ने) एंटीबॉडी mCherry टैग enolase के लिए जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया। सभी संलयन प्रोटीन आसानी से सफल transformants (चित्रा 5, गलियों 2, 5, और 7) 6 की lysates से पता चला रहे थे और और एक प्रोटीन सीढ़ी मानक की तुलना में सी सफेद enolase-एफपी मानकों के रूप में (उम्मीद आकार (~ 75 केडीए) के थे चित्रा 5, गलियों 1 और 6) 6। कोई संकेत untagged माता पिता खमीर तनाव के लिए मनाया गया (चित्रा 5, गलियों 3 और 4) 6।

चित्रा 5
चित्रा 5: कैंडिडा तनाव से सेल lysates के immunoblot। लेन 1, सी ENO1 -mCherry संलयन युक्त सफेद (जे बर्मन, मिनेसोटा विश्वविद्यालय)(सकारात्मक नियंत्रण); 2 लेन, सी ENO1 -mCherry संलयन युक्त parapsilosis; गलियों 3 और 4, untransformed सी parapsilosis माता पिता के तनाव 4175 11 (नकारात्मक नियंत्रण); 5 लेन, सी ENO1 युक्त -YFP संलयन parapsilosis; 6 लेन, सी ENO1 -GFP संलयन (जे बर्मन, मिनेसोटा विश्वविद्यालय) (सकारात्मक नियंत्रण) युक्त सफेद; लेन 7, सी ENO1 युक्त -GFP संलयन parapsilosis; लेन एल, 98 और 64 केडीए प्रोटीन संकेत दिया मानकों के साथ प्रोटीन की सीढ़ी। लेन 1-3 विरोधी mCherry एंटीबॉडी के साथ incubated और गलियों 4-7 विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ incubated रहे थे रहे थे। यह आंकड़ा Gonia, एट अल से अनुमति के साथ reprinted है। 6 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रोटोकॉल चरण / आइटम परिवर्तन संभावित सुधार (चेतावनी)
प्राइमर डिजाइन ब्याज की जीनोमिक ठिकाना करने के लिए अनुरूपता की लंबी क्षेत्र शामिल करके प्राइमरों लंबा बाध्यकारी क्षमता और मुताबिक़ पुनर्संयोजन में सुधार (प्राइमर लंबाई को संशोधित करने के इष्टतम तापमान annealing बदल सकते हैं)
पीसीआर (amplicon गुणवत्ता) उच्च निष्ठा Taq का प्रयोग करें
जेल पीसीआर उत्पाद शुद्ध 		कैसेट दृश्यों में त्रुटियों की शुरूआत में कमी प्राइमर का निशाना बना अनुक्रम और परिवर्तन दक्षता जीनोम को सुधार करने के लिए (जेल शुद्धि amplicon मात्रा और इसलिए, परिवर्तन दक्षता में कमी कर सकते हैं)
पीसीआर (amplicon मात्रा) पीसीआर प्रतिक्रियाओं और पूल उत्पादों की संख्या में वृद्धि बढ़तीबदल कोशिकाओं के ई संख्या (बहुत ज्यादा amplicon भी कम परिवर्तन दक्षता में परिणाम कर सकते हैं)
कैसेट वर्षा 4 डिग्री सेल्सियस पर centrifugation प्रदर्शन करना, बर्फ पर सभी अभिकर्मकों और ट्यूबों रखें डीएनए उपज और, इसलिए, परिवर्तन दक्षता बढ़ाएँ
ऊष्ण आघात समय कम जोर दिया खमीर कोशिकाओं की व्यवहार्यता में सुधार (कम गर्मी झटका बार भी कोशिकाओं से डीएनए कैसेट की कमी आई है तेज में परिणाम सकता है)
वसूली वृद्धि 1 अगर युक्त nourseothricin को चढ़ाना पहले YPAD अगर पर अब वसूली के लिए अनुमति तनावग्रस्त खमीर कोशिकाओं अब वसूली बार जब nourseothricin से अवगत कराया आवश्यकता हो सकती है (अब ऊष्मायन बार भी दूषित पदार्थों को और झूठी सकारात्मक transformant विकास में वृद्धि कर सकते हैं)
कालोनी परिणाम 1,2 अब समय के लिए प्लेटें सेते (~ 5 घ) सेंटressed खमीर कोशिकाओं कॉलोनी के विकास के लिए लंबे समय तक ऊष्मायन बार आवश्यकता हो सकती है (अब ऊष्मायन बार भी दूषित पदार्थों को और झूठी सकारात्मक transformant विकास में वृद्धि कर सकते हैं)
खमीर आनुवंशिक परिवर्तन युक्त स्ट्रेन के 1 विशिष्ट NAT1 चयन मार्कर का उपयोग परिवर्तनों को या 2 परिवर्तनों है कि विकास को प्रभावित

तालिका 2: समस्या निवारण और अनुकूलन के लिए गाइड।

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Discussion

मिलान के निर्माण में टैग पीसीआर की मध्यस्थता जीन संशोधन रणनीति ऊपर वर्णित का उपयोग कर कैंडिडा प्रजातियों में दृश्यों एक तीन कदम प्रक्रिया के रूप में संक्षेप किया जा सकता है। सबसे पहले, एक कैसेट पीसीआर कि दोनों को कूटबद्ध अनुक्रम खमीर जीनोम में एकीकरण और क्षेत्रों के सम्मिलन का ठिकाना करने के मुताबिक़ के लिए वांछित द्वारा किया जाता है। दूसरा, खमीर कोशिकाओं तब्दील होने के लिए लिथियम एसीटेट और कैसेट के साथ सह-incubated के साथ रासायनिक सक्षम बना रहे हैं। तीसरा, कोशिकाओं transformants ठीक करने के लिए चयनात्मक मीडिया पर चढ़ाया जाता है और जिसके परिणामस्वरूप कालोनियों वांछित जीनोमिक ठिकाना में कैसेट का सही एकीकरण के लिए परीक्षण कर रहे हैं।

इस प्रोटोकॉल के भीतर कई महत्वपूर्ण कदम सी सफेद और सी parapsilosis में एक फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन प्राप्त करने की सफलता की दर में सुधार करने के लिए कर रहे हैं। सबसे पहले, कि जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा शुद्ध कर दिया है प्राइमरों के उपयोग (पेज; निर्माता द्वारा) है अत्यधिक आरईसीommended। शुद्धि के बिना, वहाँ अंतिम उत्पाद में गलत लंबाई, जो दक्षता के साथ जो कैसेट मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा इरादा जीनोमिक ठिकाना में एकीकृत कम हो सकता है की प्राइमरों प्राप्त करने की एक वृद्धि की संभावना है। दूसरा, हम की पुष्टि करने की सिफारिश है कि पीसीआर उत्पन्न टैगिंग कैसेट उच्च गुणवत्ता की है, agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण करने ~ कैसेट डीएनए के 5 μl पीसीआर उत्पाद के सही आकार सुनिश्चित करने के द्वारा। तीसरा, खमीर कोशिकाओं है कि परिवर्तन के लिए अनुकूलित कर रहे हैं प्राप्त करने के लिए, कोशिकाओं के विकास का लॉग चरण में माइक्रोस्कोपी उनके उपयोग के लिए पहले से स्पष्ट खमीर कलियों के साथ होना चाहिए। चौथा, यह गर्मी के झटके के बाद बदल खमीर कोशिकाओं के मेजबान के दौरान और चयनात्मक मीडिया पर चढ़ाना पहले कोमल pipetting तकनीक का उपयोग करने के लिए आवश्यक है। पांचवां, nourseothricin पर transformant चयन, जो खमीर कोशिकाओं को विषाक्त है, nourseothricin युक्त मध्यम पर नकल benef हो सकता है इससे पहले YPAD अगर पर विकास के लिए और अधिक समय के लिए अनुमति देने के लिएtransformants की वसूली को बढ़ावा देने के लिए icial। अंतिम बरकरार प्लाज्मिड और इरादा जीनोमिक स्थान के बाहर पीसीआर कैसेट एकीकरण कैंडिडा में कम आवृत्तियों पर होती है और यह भी कॉलोनी के विकास में परिणाम होगा। इस प्रकार, यह पीसीआर द्वारा सभी तब्दील कालोनियों एकीकरण के लिए इस्तेमाल किया अनुक्रम के बाहर प्राइमरों का उपयोग का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक है। transformants कि पीसीआर द्वारा सत्यापित कर रहे हैं लेकिन माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रतिदीप्ति प्रदर्शन नहीं करते के लिए, सेल lysates और अनुक्रमण के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण आगे निर्माण या दृश्य विफलता के कारण की जाँच करने के लिए विचार किया जाना चाहिए। इन महत्वपूर्ण कदम के अलावा, वहाँ प्रोटोकॉल में कई कदम है कि, संशोधित किया जा सकता है अगर जरूरत है, परिवर्तन दक्षता में सुधार लाने और सही कैसेट एकीकरण की आवृत्ति में वृद्धि करने के लिए कर रहे हैं। एक समस्या निवारण गाइड तालिका 2 में प्रस्तुत किया है।

इस तकनीक है कि भविष्य अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है की क्षमता सीमाएं हैं। lithiuएम एसीटेट विधि एक कम क्षमता में डीएनए परिवर्तन परिणाम (~ जांच की कालोनियों का 1-2% एक सही एकीकरण निहित) सी के लिए के लिए इस्तेमाल किया। parapsilosis 12, सी albicans की तुलना में। Electroporation एक वैकल्पिक दृष्टिकोण एसीटेट परिवर्तन है कि परिवर्तन दक्षता 13 में सुधार हो सकता लिथियम है। ADH1 टर्मिनेटर का प्रयोग करें, एक सार्वभौमिक टैगिंग विधि के लिए आवश्यक है, जबकि, जो देशी टर्मिनेटर अनुक्रम के साथ हुआ होगा कि से स्थिरता और / या उत्पन्न mRNA के विनियमन बदल सकता है। इस संभावित मुद्दे पर विचार किया जाएगा जब एक प्रोटीन की देशी समारोह विशिष्ट अनुसंधान प्रश्न के लिए महत्वपूर्ण है की जरूरत है। फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन है कि निम्न स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं, पूरी कॉलोनी माइक्रोस्कोपी की पहचान या करने के लिए सफल transformants के लिए स्क्रीन एक विकल्प नहीं हो सकता है। इस मामले में, पीसीआर और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण सफल संलयन प्रोटीन sequ के सबूत प्रदान करेगाखिलाडि़यों / प्रोटीन निर्माण। एक सीमा है, सभी संलयन प्रोटीन निर्माण के लिए आम है, कि मिलान टैग संलयन प्रोटीन की असामान्य स्थानीयकरण सहित अनायास ही उत्परिवर्ती phenotypes, जिसके परिणामस्वरूप, प्रोटीन के देशी समारोह के साथ हस्तक्षेप कर सकता है। इन मुद्दों पर विचार महत्वपूर्ण है और संकेत के रूप में उचित नियंत्रण शामिल किया जाना चाहिए।

इस पीसीआर की मध्यस्थता दृष्टिकोण से कैंडिडा में मिलान टैग पैदा करने के लिए उपयोगी plasmids, यहां उल्लेख किया उन लोगों के अलावा, पहले हमारे अनुसंधान समूहों द्वारा उत्पन्न और फफूंद जेनेटिक्स स्टॉक केंद्र (http के माध्यम से शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध हैं की गई है: //www.fgsc। नेट)। के बारे में इन plasmids के कई और अधिक जानकारी भी (http://www6.tau.ac.il/berman/) पर पाया जा सकता है। उपलब्ध plasmids, एफपी दृश्यों अलग रंग खमीर, अन्य मिलान टैग विकल्प उत्पन्न करने के लिए पोषण और दवा प्रतिरोध मार्कर के संयोजन की एक बहुत बड़ी संख्या में होते हैं (हा, MYC, V5, HIS9) प्रोटीन की गिरफ्तारी को उत्पन्न करने के लिएई प्रोटीन के विधान और regulatable अभिव्यक्ति के लिए या तो carboxy- या एमिनो Termini, और प्रमोटर दृश्यों में चिह्नित। इस उपकरण के रूप परिवर्तन और नैदानिक ​​खमीर उपभेदों कि prototrophic हैं, पारंपरिक पोषण मार्कर को अनुपयोगी बताते हुए के अध्ययन के लिए अनुमति देता है दवा प्रतिरोध मार्कर युक्त plasmids विशेष रूप से कवक रोगजनन के क्षेत्र के लिए फायदेमंद होते हैं। नैदानिक कैंडिडा उपभेदों कि अलग अलग तरंग दैर्ध्य में प्रतिदीप्ति का निर्माण सेल जैविक assays कि कल्पना और सह संस्कृति में कई खमीर उपभेदों अंतर करने की क्षमता की आवश्यकता होती है की एक किस्म के लिए उपयोगी हो जाएगा।

कैंडिडा प्रजातियों के कारण इनवेसिव कवक रोग एक महत्वपूर्ण मानव स्वास्थ्य चुनौती है कि इलाज के लिए मुश्किल है और उच्च रुग्णता और मृत्यु दर के साथ जुड़ा हुआ है, विशेष रूप से immunocompromised रोगियों में 14, 15 होना जारी है। इस प्रकार, आणविक उपकरण है कि अनुसंधान की अनुमति देते हैंनेताओं और अधिक जल्दी और आसानी से अध्ययन करने के लिए कैंडिडा प्रजातियों मेजबान बातचीत कैंडिडा जीव विज्ञान और रोगजनन तंत्र के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम मूल mCherry एफपी अनुक्रम प्रदान करने के लिए एन डीन धन्यवाद, एम Gerami-नेजाद plasmids के निर्माण के लिए, इस परियोजना के विकास के दौरान उपयोगी सलाह के लिए तकनीकी सहायता के लिए बी लार्सन, और टी Heisel। जेबी यूरोपीय अनुसंधान परिषद उन्नत पुरस्कार 340087 (RAPLODAPT) द्वारा समर्थित किया गया। माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग सिस्टम मिनेसोटा बाल रोग फाउंडेशन के विश्वविद्यालय और मिनेसोटा इमेजिंग सेंटर के विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 W mercury lamp CHIU Technical Corporation M-100T
95% Ethanol Any NA
Adenine Any NA
Ampicillin Any NA
Carrier DNA Ambion AM9680 Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml
CCD Camera Photometrics CoolSNAP HQ
Conical Tube Corning 430828 50 ml
Culture Tube Rotator New Brunswick 2013923 TC-8, or Any Culture Tube Rotator
Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade Any NA
Eppendorf Tubes Eppendorf 022363719, 022363212 0.5 ml, 1.5 ml
Erlenmeyer Flask Fisher Scientific 7250089 125 ml
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) Any NA
Freezer (-80 °C) Thermo Electron Corporation ULT-1386-9-V Revco Ultima II
GFP, YFP and Texas Red Filter Sets Chroma Technology Corporation 49002, 86004v2, 49008
Glass culture tubes Fisher Scientific 1496126 75 mm
HRP goat anti-mouse antibody Santa Cruz Biotechnology SC-2005
HRP goat anti-rabbit antibody Santa Cruz Biotechnology SC-2301
Incubator (30 °C) Any NA
Lithium Acetate Any NA
Lysogeny Broth (LB) Media Any NA
Magnesium Chloride Any NA
Microcentrifuge Eppendorf 5415 D
Microscope Nikon E600 Nikon Eclipse E600
Microscope Image Analysis Software Universal Imaging Corporation 6.3r7 MetaMorph Software Series 6.3r7
Mouse anti-GFP antibody Roche 11814460001
Nourseothricin Fisher Scientific 50997939
PCR Thermocycler Applied Biosystems 9700 GeneAmp PCR System
PCR tubes BioExpress, GeneMate T-3035-1 0.2 ml
Polyethylene Glycol 3350 Any NA
Potassium Chloride Any NA
Rabbit anti-mCherry antibody BioVision 5993-100
Refrigerator (4 °C) Any NA
Sodium Acetate Any NA
Stereomicroscope Nikon SMZ1500
Table Top Centrifuge Labnet Z 400 Hermle Z 400
Taq DNA Polymerase Any NA
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Any NA
Vortex Mixer Scientific Industries SI-0236 Vortex Genie 2
Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media Any NA

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References

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आनुवंशिकी अंक 121, पीसीआर की मध्यस्थता जीन संशोधन फ्लोरोसेंट प्रोटीन, लिथियम एसीटेट परिवर्तन,
में फ्लोरोसेंट प्रोटीन Fusions की पीढ़ी<em&gt; कैंडिडा</em&gt; प्रजाति
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Gonia, S., Berman, J., Gale, C. A.… More

Gonia, S., Berman, J., Gale, C. A. Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species. J. Vis. Exp. (121), e55333, doi:10.3791/55333 (2017).

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