Summary
La modification du gène à médiation par PCR peut être utilisée pour générer des fusions de protéines fluorescentes dans des espèces de Candida, ce qui facilite la visualisation et la quantification des cellules de levure et les protéines. Ici, nous présentons une stratégie pour la construction d' une protéine de fusion fluorescente (ENO1-FP) dans Candida parapsilosis.
Abstract
Les espèces de Candida, colonisateurs répandues des voies intestinales et génito, sont la cause de la majorité des infections fongiques invasives chez les humains. Ainsi, les outils moléculaires et génétiques sont nécessaires pour faciliter l'étude de leurs mécanismes de pathogénicité. modification génique par PCR est une approche simple et rapide pour générer des protéines de marquage épitopique pour faciliter leur détection. En particulier, la protéine fluorescente (PF), les fusions sont des outils puissants qui permettent la visualisation et la quantification des deux cellules de levure et des protéines par microscopie à fluorescence et immunotransfert, respectivement. Les plasmides contenant des séquences codant pour la PF, ainsi que des gènes marqueurs nutritionnels qui facilitent la transformation des espèces de Candida, ont été produites à des fins de construction et d' expression dans la PF Candida. Ici, nous présentons une stratégie pour la construction d' une fusion FP dans une espèce de Candida. Les plasmides contenant l'antitache nourseothricinence gène marqueur de transformation (en NAT1) , ainsi que des séquences soit pour le vert, le jaune, ou la cerise vps (GFP, YFP, mCherry) sont utilisées conjointement avec des amorces qui comprennent des séquences spécifiques d' un gène dans une réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour générer une cassette FP . Cette cassette spécifique du gène a la possibilité d'intégrer dans l'extrémité 3 'du locus du gène correspondant par l'intermédiaire d'une recombinaison homologue. Réussi fusion en cadre de la séquence PF dans le locus du gène d'intérêt est contrôlée génétiquement, suivie d'une analyse de l'expression de la protéine de fusion par microscopie et / ou des méthodes d'immuno-détection. En outre, pour le cas des protéines hautement exprimés, des fusions avec succès peuvent être criblés principalement par les techniques d'imagerie par fluorescence.
Introduction
Les espèces de Candida sont des champignons commensaux qui colonisent le tractus intestinal et génito de tous les humains. Dans des conditions d'immunodéficience, telles que celle se produisent avec une naissance prématurée ou d' effets immunosuppresseurs de traitements pour le cancer, les espèces de Candida peuvent devenir pathogènes opportunistes. Parmi les espèces de Candida, Candida albicans est le colonisateur fongique la plus répandue et provoque la majorité des infections fongiques invasives. D' autres espèces de Candida telles que C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis et C. kruseii aussi causer des infections graves chez les patients immunodéprimés, avec une certaine résistance intrinsèque présentant aux antibiotiques couramment utilisés anti-fongiques comme le fluconazole et l' amphotéricine B. Par conséquent, infections avec certaines de ces espèces sont observées plus fréquemment, en particulier chez les patients traités à titre prophylactique avec des agents anti-fongiques. Même avec un approprié et opportuntraitement nti-fongiques, les infections à Candida invasives continuent d'être associée à une morbidité et une mortalité significatives. En raison de l'importance des espèces de Candida dans la santé humaine, il y a un besoin d'outils moléculaires facilement disponibles qui permettent l'étude et l' élucidation de leurs mécanismes de pathogénicité.
Un outil important qui permet aux chercheurs de visualiser et de quantifier les cellules microbiennes et les protéines qu'ils expriment est la technologie de fusion FP. Réaction en chaîne par polymérase (PCR) de modification de gène médiée, tel que décrit dans le présent document, permet la construction de fusions, entre les séquences de PF et une séquence codante d'intérêt à son locus génomique protéine Candida. Une intégration stable de la construction facilite l'analyse de l'expression des protéines ainsi que la dynamique des protéines de localisation. Les plasmides contenant des séquences de PF, optimisés pour l' expression dans Candida albicans et que peuvent être utilisés dans la g médiée par PCRstratégie de modification ène ont été préalablement construits 2, 3, 4, 5. Plasmides contiennent PF transformation «cassettes»: une séquence de FP lié à un gène marqueur nutritionnel qui favorise la transformation de C. albicans et C. parapsilosis 2, 3, 4, 5, 6, 7. À l' heure actuelle plasmides disponibles contiennent une variété de gènes sélectionnables marqueurs nutritionnels (URA3 His1, ARG4) pour la transformation des souches auxotrophes, ainsi qu'un marqueur de résistance aux médicaments dominante (NAT1), ce qui facilite la transformation des souches cliniques dépourvues auxotrophies. En outre, des plasmides contiennent des options pour jusqu'à quatre séquences différentes de PF (vert [GFP], yellow [YFP], cyan [PCP] et de cerise [mCherry]) et soit une séquence de terminaison ADH1 pour la construction d' un carboxy-terminale des protéines de fusion, ou une séquence de promoteur pour la construction d'amino-terminale des protéines de fusion. Les amorces sont conçues avec une homologie avec l'ADN du plasmide entourant la cassette FP. En outre, les amorces contiennent également des séquences 5 ' d' extension portant une homologie avec le gène de levure d'intérêt à marquer, ce qui facilite l' intégration de la cassette dans le locus génomique par recombinaison homologue (figure 1). Spécifique du gène FP cassettes sont générés par PCR et ensuite transformés en cellules de Candida rendues compétentes pour l' absorption de l' ADN par un traitement avec de l' acétate de lithium.
Figure 1: Schéma de la façon dont les fusions de séquences PF sont générées dans les espèces de Candida. (A) L' ADN de plasmide includes une séquence de PF et une séquence codant pour la résistance nourseothricine (NAT1). emplacements relatifs de l'avant (FWD) et inverse (REV) les amorces sont représentées, avec des parties noires des amorces indiquant la région d'homologie à la séquence plasmidique et les portions violet dénotant la région d'homologie spécifique d'un gène ou d'une extension d'amorce. Cassettes (B) PF sont transformées en Candida et à intégrer au sein du locus génomique de ENO1 par recombinaison homologue (lignes en pointillés). (C) résultant séquence de fusion FP à l'extrémité 3 du ENO1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Ici, nous présentons un exemple de la protéine de fusion (ENO1-FP) constructions dans les espèces de Candida. Nous utilisons le marquage des plasmides contenant le gène marqueur de transformation NAT1 avec des séquences codant pour la GFP, YFP, oumCherry (figure 2). Ces plasmides sont utilisés conjointement avec des amorces de PCR pour générer des cassettes spécifiques de gènes qui facilitent la fusion de PCR à l'extrémité 3 'de ENO1, ayant pour résultat l' expression de ENO1 fusionnée à son extrémité carboxy à MF-terminale.
Figure 2: Carte de PF plasmides contenant la cassette. Vers l'avant (F) et arrière (R) des amorces utilisées pour générer les cassettes à partir des plasmides sont indiqués ainsi que la position relative de leur homologie avec les plasmides. Les séquences des amorces sont énumérées dans le tableau 1. F1 et R1 ont également été utilisés pour générer la cassette pYFP- NAT1. Le plasmide contenant la cassette YFP- NAT1 (pMG2263) est identique à pMG2120 à l'exception de la YFP à la place de la séquence de la GFP. Tailles de cassettes: GFP-Nat1, 3,7 kbp; mCherry- NAT1, 3,2 kbp; YFP- NAT1, 3.7 kpb. Ce chiffre a été modifié depuis Gerami-Nejad, et al. 4 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Protocol
1. Isoler Template Plasmides de E. coli
- Cultiver E. coli contenant le plasmide de matrice pendant une nuit dans 10 ml de bouillon lysogénie (LB) + 200 mg / L d'ampicilline (AMP) à 37 ° C sous agitation.
- Récolte des cellules par centrifugation à 6000 g pendant 2 min.
- Décanter le liquide, isoler et purifier l' ADN de cellules de E. coli par un procédé standard tel que décrit précédemment dans Ausubel et al. 8.
- ADN remettre en suspension dans du Tris-EDTA (TE, Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, pH 8,0) à une concentration de travail de 50-100 ng / ml.
2. Conception Amorces
| Apprêt | séquence d' amorce |
| F1 | 5 ' |
| R1 | 5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC GTAAAACGACGGCCAGTGAATTC 3 ' |
| F2 | 5 'GAGAATTGAAGAAGAGTTGGGAGACAATGCTATCTATGCTGGTAAGGACTTCCACAATGCTCAAACTTTG GGTGGTGTTTCAAAAGGTGAAGAAGATAAT 3 ' |
| R2 | 5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC ACTGGATGGCGGCGTTAGTATC 3 ' |
Tableau 1: séquences des amorces utilisées dans cette étude. Le texte en italique gras indique une homologie avec le locus génomique de ENO1, les régions de police normales sont homologues à l' ADN plasmidique.
- <li> Conception des amorces pour être homologue au plasmide les séquences bordant la cassette à amplifier ainsi qu'à l'extrémité 3 'du gène cible d'intérêt (par exemple ENO1) pour faciliter la recombinaison dans locus génomique du gène (figure 2 et tableau 1) .
- Faire en sorte que les séquences d'amorce avant correspondent aux 70 dernières paires de bases (pb) du gène d'intérêt, 5'- 3 ', moins le codon d'arrêt, afin de maintenir la trame de codage, ainsi que la première approximativement 30 pb de la séquence du plasmide à être amplifié. Comme une note, l'GGTGGTGGTT dans chaque amorce est un lieur de poly-glycine avec aucune homologie FP. Il convient de noter qu'en l'absence d'une liaison, il peut y avoir fusion directe des domaines fonctionnels, qui peuvent théoriquement conduire à un mauvais repliement des protéines, avec un faible rendement dans la production de protéines ou de troubles de la bioactivité.
- Veiller à ce que les séquences d'amorces inverses sont 70 pb juste en aval du gène, 3'- 5 ', ne comprenant pas la séquence du gène, ainsi que le dernier approximately 30 pb du marqueur nutritionnel ou la résistance aux médicaments utilisés dans le plasmide.
- Utilisez F1 et R1 pour générer GFP Nat1 et YFP- Nat1 cassettes avec pMG2120 et pMG2263, respectivement , et F2 et R2 pour générer mCherry- NAT1 avec pMG2343.
3. Générer FP Cassettes par PCR (Jour 1)
- Préparer des réactifs pour la PCR. Faites un mélange maître (500 volume final ul) en ajoutant les volumes et les concentrations suivantes à un tube de 1,5 ml: tampon de 50 ul PCR (500 mM de chlorure de potassium, 100 mM Tris pH 8,0 dans l'eau), désoxynucléotides 20 pi (dNTP; mélange des stocks de nucléotides à 10 mM chacun), le chlorure de magnésium 40 ul de 25 mM, 20 pl purifiées plasmidique (de ~ 50-100 ng / pl solution mère), 10 ul chacun avant et primaire (à partir de solutions mères 10 mM inverse), 30 Taq ul polymérase (générique, 5000 unités / ml) et 320 ul d'eau.
- Aliquoter 50 pi de mélange maître dans chacune des 10 PCR-CompatibLe tubes de 0,5 ml.
- Placer les tubes PCR en thermocycleur et exécuter les étapes suivantes: 1 cycle de 5 min à 94 ° C pour dénaturer dsDNA; 40 cycles de 45 secondes de manière séquentielle à 94 ° C, 30 s à 55 ° C pour permettre aux amorces hybrident avec l'ADN matrice du plasmide, et 4 min à 68 ° C pour l'extension des produits d'ADN; et 1 cycle d'extension finale de 15 min à 72 ° C.
peuvent avoir besoin d'être modifié en fonction de la polymérase Taq particulier utilisé Master Mix PCR et cyclistes paramètres: NOTE. - Piscine tous les produits des réactions 10 PCR dans un tube de 1,5 ml.
- Sous réserve 5 pi de produit de PCR mis en commun à une électrophorèse sur gel d'agarose pour vérifier la taille de l'amplicon et obtenir une estimation de la concentration du produit, sur la base de la comparaison à une échelle de l'ADN. En règle générale, utiliser ~ 250 pg d'ADN de cassette dans chaque mélange de transformation ultérieure.
- Précipiter l'ADN par addition d'acétate 50 ul de sodium 3 M, suivi par 750 ul d'éthanol à 95% pour les produits et incuber pendant au moins 30 minà -20 ° C
- Récolter les produits de la PCR par centrifugation du tube à 16 000 xg pendant 10 min. Retirez délicatement et jeter le surnageant et sécher le culot du jour au lendemain. Resuspendre la cassette culot d'ADN séché dans 40 pi de TE pH 8,0 et stocker à température ambiante jusqu'à utilisation.
4. Transformer des cellules de Candida avec FP DNA Cassettes
- Le jour 1, récupérer la souche de levure à transformer à partir d'un glycérol de 15% congelé (-80 ° C) disponible en striant quelques cristaux grattées SUR DES levure peptone dextrose avec adénine (YPAD) agar et incuber à 30 ° C. Après rétablissement de la croissance des colonies, inoculer une colonie unique dans 2 ml de milieu YPAD liquide dans un tube de culture en verre avec un bouchon perméable à l'air et laisser incuber pendant une nuit à 30 ° C sous agitation.
- Le jour 2, diluer 300 pi de culture de levure pendant la nuit dans 50 ml YPAD frais (à une DO finale 600 de ~ 0,2) dans un Erlenmeyer de 125 ml avec un bouchon perméable à l' air. Agiter à 30 ° Cpour ~ 3 h (à une DO finale 600 ~ 0,6-0,8).
- Verser la culture de la nuit dans un tube conique de 50 ml et sédimenter les cellules par centrifugation pendant 5 minutes à 1 500 xg dans une centrifugeuse de table.
- Décanter et correctement jeter le surnageant. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 de l'eau. Re-sédimenter les cellules par centrifugation à nouveau pendant 5 min à 1500 x g dans une centrifugeuse de dessus de table.
- Décanter et correctement jeter le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 500 ul TELiAc (TE acétate de lithium: Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, pH 8,0, 0,1 M d'acétate de lithium) pendant le transfert dans un tube de 1,5 ml. Centrifuger le tube pendant 2 min à 3000 xg dans une microcentrifugeuse.
- Resuspendre les cellules dans 250 TELiAc ul. Le volume total y compris le culot devrait être ~ 300 pi.
- À un (microtube différent que dans 4.2.4) propre, ajouter 5 ul d' ADN de support (10 mg / ml) et 150 ul de cellules de Candida préparées ( à partir 4.2.4). Ceci est le contrôle négatif pour transformation.
- Un second tube microfuge propre, ajouter 5 pl d'ADN porteur dénaturé (qui a été bouilli à 90 ° C pendant 10 minutes et refroidi à 4 ° C), les 40 ul du produit de PCR préparé (de 3.3.1) et 150 ul de cellules de Candida préparés (de 4.2.4).
- Incuber les deux mélanges de transformation pendant 30 min à température ambiante.
- A chaque tube de mélange de transformation, ajouter 700 pi de mélange de plaque (Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, pH 8,0, 0,1 M d'acétate de lithium dans 50% de polyéthylèneglycol 3350). Inversez les tubes à mélanger et à les incuber pendant une nuit à température ambiante.
- Le Jour 3, incuber la transformation se mélange à 42 ° C pendant 1 heure (de choc thermique).
- Centrifugeuse la transformation se mélange pendant 30 secondes à 16.000 xg dans une microcentrifugeuse. Retirez et jetez-le surnageant. La remise en suspension de chacune des pastilles de cellules dans 150 ul d'eau en pipettant doucement vers le haut et vers le bas de manière à ne pas endommager les cellules.
- Pour les transformations utilizing gènes marqueurs auxotrophes (par exemple URA3), plaque chaque mélange ensemble par pipetage des solutions sur la gélose de milieu sélectif approprié (par exemple manquant d' uridine) et étaler le mélange uniformément à l' aide de billes de verre stériles.
- Pour les transformations utilisant le gène marqueur de résistance à nourseothricine (de NAT1), comme décrit ici, la transformation de la plaque premier mélange sur de la gélose YPAD non sélectif et incuber à 30 ° C pendant 6 à 12 heures. Cette étape facilite la récupération des cellules, le choc thermique post, avant nourseothricine le stress est appliqué.
- Après reprise de la croissance partielle, plaque réplique les cellules de Candida YPAD SUR DES contenant 400 ug / ml nourseothricine. Pour des transformations utilisant des gènes marqueurs nutritionnels (par exemple , URA3), cette étape de métallisation intermédiaire est pas nécessaire et les cellules peuvent être directement plaquées sur des milieux sélectifs de levure (par exemple , de YPAD manquant d' uridine) comme décrit dans 4.4.2.
NOTE: Si la transformation est réussie, colOnies devrait apparaître dans un à trois jours (potentiellement jusqu'à cinq jours de l'excroissance pour la sélection sur gélose nourseothricine contenant). Aucune colonie doivent apparaître sur des plaques réparties avec des mélanges de transformation contenant de l'ADN de support seul (témoin négatif).
- Pour la sélection du marqueur d'auxotrophie et nourseothricine, streak plantes transformées putatives comme des colonies isolées sur des plaques d'agar de milieu sélectif frais et on incube à 30 ° C pour propager des cellules de levure qui peuvent être criblés pour la construction réussie de fusion PF.
- Transformants d'écran pour l' intégration correcte de la cassette de marquage (voir résultats représentatifs pour un exemple détaillé). Si le gène d'intérêt est exprimé en des quantités suffisantes, la fluorescence de colonie entière peut se produire de telle sorte qu'il est possible de détecter des intégrants candidats potentiels en utilisant un système d'imagerie de la plaque avec la capacité de détection de fluorescence.
- Vérifiez intégrants putatifs par PCR en utilisant des amorces homologues aux séquences outside de la région d'intégration pour confirmer la fusion du gène cible.
- En outre, envisager une analyse par transfert de Western pour déterminer l'expression et la taille de la protéine de fusion, ainsi que par microscopie à fluorescence de cellules uniques pour la confirmation visuelle de la localisation de la protéine, si elle est connue.
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Representative Results
A titre d'exemple, nous avons utilisé le protocole décrit ci - dessus pour construire GFP et mCherry fusions à ENO1 dans une souche de laboratoire de parapsilosis C.. Chaque transformant putatif a été initialement réensemencer en stries pour la croissance. Dans cet exemple, étant donné que la protéine de fusion résultante est fortement exprimée (énolase) et les médecins de famille sont lumineuses, nous avons été en mesure de dépister les transformants par microscopie à fluorescence avant d'effectuer la PCR de diagnostic (Figure 3) 6.
Graphique 3: Colony fluorescence transformants présentée par Candida. des images représentatives de l'évolution de la plaque de levure obtenues à l'aide d'un système de balayage à laser équipé d'un filtre à Cy3 à l'image de la souche exprimant mCherry et un filtre Cy2 pour imager la YFP- et les souches exprimant la GFP. Gauche panneau dans chaque paire, FP-Expressing souches; panneau de droite dans chaque paire, souche parentale non transformée (4175) imagé avec le même filtre que la souche FP exprimant correspondante. Après la visualisation, les images ont été inversées et la luminosité et le contraste ont été ajustés de manière identique pour FP-expression et de souches de contrôle. Ce chiffre est réimprimé avec la permission de Gonia, et al. 6 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
L' ADN génomique a été isolé à 9 de chacun de ces transformants putatifs et utilisé comme matrice d'ADN, avec des amorces complémentaires des séquences flanquant les sites d'intégration de la cassette ( à savoir des séquences à l'extérieur de l' endroit où F et R des amorces hybrident dans le locus génomique destiné à être marqué) , dans les RAP de diagnostic pour vérifier l'intégration correcte de la cassette FP juste prIOR au codon d'arrêt du gène d'intérêt. Il convient de noter, pour les transformations d'acétate de lithium avec C. parapsilosis, nous avons observé une efficacité moindre (~ 1-2% des colonies criblées contenait une bonne intégration) par rapport à notre expérience avec C. albicans transformations.
Pour analyser la localisation énolase, on a observé des cellules de levure exprimant ENO1-FP construit par microscopie de fluorescence à l'aide d'un photomicroscope équipé d'une lampe à mercure de 100 W et un éclairage à épifluorescence avec la GFP, YFP et le Texas Red jeux de filtres. Un dispositif à couplage de charge (CCD) a été utilisé pour recueillir des images qui ont été traitées avec le logiciel d'analyse d'image (figure 4A) 6. En outre, nous avons constaté que les différentes couleurs de PF sont utiles pour distinguer visuellement les différentes souches de levure dans un mélange (figure 4B) 6. Étant donné que l'énolase est fortement exprimé et situé dans laune grande partie de la cellule de levure, FP fusions à elle peut être utilisée pour générer des souches de levure fluorescentes qui peuvent être facilement visualisés, par exemple, dans l' analyse des interactions de Candida.
Figure 4: Expression et localisation de fusions ENO1-FP par microscopie à fluorescence. (A) Fluorescence ( en haut) et le contraste d'interférence différentiel (DIC, en bas) images pour les souches de Candida exprimant ENO1-MF. ENO1-PCR en C. albicans et C. parapsilosis ont tendance à se concentrer dans le noyau, ainsi que dans le cytoplasme, mais à un degré beaucoup plus faible. (B) images microscopiques d'une culture mixte de souches de Candida exprimant ENO1-mCherry et ENO1-GFP. Panneau de droite, Texas filtre rouge; panneau central, filtre GFP; panneau de droite, fusion des deux panneaux fluorescents avec l'image DIC. Barres d'échelle = 10 um. Ce chiffre est réimprimé avec la permission de Gonia, et al. 6 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
PF fusion facilitent également l'analyse des niveaux d'expression protéique par Western Blot. En utilisant des cellules de levure produites selon le protocole décrit ci - dessus, les protéines ont été isolées à partir de lysats de cellules séparées par dodécylsulfate de sodium électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et transférées dans un difluorure de polyvinylidène (PVDF) 10. Fusions ENO1-FP ont été détectées sur les blots en utilisant des anticorps disponibles dans le commerce comme décrit précédemment 6. En bref, souris anti-GFP (1: 2000 dilution), suivie par la peroxydase de raifort de chèvre conjugué IgG anti-souris (1: 10000 dilution) d'anticorps ont été utilisés pour sonder GFP et YFP-taénolase gged. De lapin anti-mCherry (1: 2000 dilution), suivie par la peroxydase de raifort de chèvre conjugué IgG anti-lapin (1: 10000) dilution d'anticorps ont été utilisés pour sonder l'énolase mCherry étiquetée. Toutes les protéines de fusion ont été facilement détectées à partir de lysats des transformants obtenus avec succès (Figure 5, lignes 2, 5 et 7) 6 et étaient de la taille attendue (~ 75 kDa) par rapport à un étalon de protéine d'échelle et le niveau de C. albicans énolase-FP ( la figure 5, les pistes 1 et 6) 6. Aucun signal n'a été observé pour la souche de levure mère non marqué (figure 5, pistes 3 et 4) 6.
Figure 5: immunoblot des lysats cellulaires provenant de souches de Candida. Lane 1, C. albicans contenant ENO1 -mCherry fusion (J. Berman, Université du Minnesota)(contrôle positif); piste 2, C. parapsilosis contenant ENO1 -mCherry fusion; pistes 3 et 4, la souche mère non transformée C. parapsilosis 4175 11 (contrôle négatif); piste 5, C. parapsilosis contenant ENO1 YFP fusion; piste 6, C. albicans contenant ENO1 GFP fusion (J. Berman, Université du Minnesota) (contrôle positif); piste 7, C. parapsilosis contenant ENO1 fusion GFP; voie L, échelle de protéines avec 98 et 64 kDa normes de protéines indiquées. Lanes 1-3 ont été incubées avec un anticorps anti-mCherry et les voies 4-7 ont été incubées avec un anticorps anti-GFP. Ce chiffre est réimprimé avec la permission de Gonia, et al. 6 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Protocole Step / Point | Modification | Amélioration potentielle (précautions) |
| conception Primer | Allonger amorces en incluant plus la région d'homologie avec locus génomique d'intérêt | Améliorer l'efficacité de liaison et la recombinaison homologue (modification longueur de l'amorce peut changer des températures de recuit optimales) |
| PCR (qualité de l'amplicon) | Utilisez plus Taq de fidélité Gel purifient produit PCR | Réduire introduction d'erreurs dans des séquences de cassette pour améliorer le ciblage de l'amorce de séquence du génome et de l'efficacité de transformation (purification de gel peut diminuer la quantité d'amplicon et donc, l'efficacité de transformation) |
| PCR (quantité d'amplicon) | Augmenter le nombre de réactions PCR et produits de piscine | de plus ennombre e de cellules transformées (trop amplicon peut également entraîner une diminution de l' efficacité de transformation) |
| la précipitation de la cassette | Effectuer une centrifugation à 4 ° C, conserver tous les réactifs et les tubes sur la glace | Augmenter le rendement de l'ADN et, par conséquent, l'efficacité de transformation |
| Choc thermique | Raccourcir le temps | Améliorer la viabilité des cellules de levure stressés (réduction des temps de choc thermique pourraient également entraîner une diminution de l'absorption de la cassette d'ADN par les cellules) |
| Croissance Recovery 1 | Prévoir plus de récupération sur gélose YPAD avant l'étalement de gélose contenant nourseothricine | les cellules de levure stressées peuvent avoir besoin de plus longs temps de récupération lorsqu'il est exposé à nourseothricine (plus des temps d'incubation peuvent également augmenter la croissance des contaminants et transformante de faux positifs) |
| Colony Excroissance 1,2 | Incuber les plaques pour des durées plus longues (~ 5 d) | Stles cellules de levure ressed peuvent avoir besoin de plus longues durées d'incubation pour la croissance des colonies (plus longues durées d'incubation peuvent également augmenter la croissance des contaminants et transformante de faux positifs) |
| 1 spécifique à des transformations utilisant des marqueurs de sélection de NAT1 ou 2 transformations de souches de levure contenant des mutations génétiques qui affectent la croissance | ||
Tableau 2: Guide pour le dépannage et l' optimisation.
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Discussion
Construction d'épitope tagged séquences dans les espèces de Candida en utilisant la stratégie de modification génique par PCR décrit ci - dessus peuvent être résumées comme un processus en trois étapes. Tout d'abord, la cassette est réalisée par PCR qui code à la fois la séquence souhaitée pour l'intégration et des régions homologues au locus d'insertion dans le génome de la levure. D'autre part, les cellules de levure à transformer chimiquement compétentes sont effectuées avec de l'acétate de lithium et de co-incubées avec de la cassette. En troisième lieu, les cellules sont étalées sur un milieu sélectif pour récupérer les transformants et les colonies résultantes sont testées pour l'intégration correcte de la cassette dans le locus génomique désiré.
Il y a plusieurs étapes critiques dans ce protocole pour améliorer le taux d'obtention d' une protéine de fusion fluorescente dans C. albicans et C. parapsilosis succès. Tout d'abord, l'utilisation d'amorces qui ont été purifiés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE, par le fabricant) est hautement recmandé. Sans purification, il existe une plus grande probabilité d'obtenir des amorces de longueurs incorrectes dans le produit final, ce qui pourrait diminuer l'efficacité avec laquelle la cassette intègre dans le locus génomique prévu par recombinaison homologue. Deuxièmement, nous vous recommandons de vérifier que la cassette de marquage généré par PCR est de haute qualité, en analysant ~ 5 pi d'ADN de la cassette par électrophorèse sur gel d'agarose pour assurer la bonne taille du produit de PCR. En troisième lieu, pour obtenir des cellules de levure qui sont optimisées pour la transformation, les cellules doivent être en phase logarithmique de croissance, avec des bourgeons de la levure en évidence par microscopie avant leur utilisation. Quatrièmement, il est impératif d'utiliser la technique de pipetage doux pendant remise en suspension des cellules de levure transformées après choc thermique et avant étalement sur des milieux sélectifs. En cinquième lieu, pour la sélection des transformants sur nourseothricine, qui est toxique pour les cellules de levure, ce qui permet plus de temps pour la croissance sur gélose YPAD avant de reproduire sur un milieu contenant nourseothricine-peut être bénéficiel pour favoriser la récupération des transformants. Enfin, le plasmide intact et l' intégration de la cassette par PCR en dehors de l'emplacement génomique prévu ne se produit aux basses fréquences de Candida et entraînera également la croissance des colonies. Par conséquent, il est nécessaire d'analyser toutes les colonies transformées par PCR en utilisant des amorces en dehors de la séquence utilisée pour l'intégration. Les transformants qui sont vérifiés par PCR, mais ne présentent pas de fluorescence par microscopie, analyse par transfert Western de lysats de cellules et le séquençage doit être envisagé d'étudier plus avant la raison de la construction ou de l'échec de visualisation. En plus de ces étapes critiques, il y a plusieurs étapes dans le protocole qui peuvent être modifiés, si nécessaire, pour améliorer l'efficacité de transformation et d'augmenter la fréquence de l'intégration de la cassette correcte. Un guide de dépannage est présenté dans le tableau 2.
Il existe des limitations potentielles de cette technique, qui peut être optimisée pour des applications futures. Le Lithiuméthode m d'acétate utilisé pour les résultats de la transformation de l' ADN dans un rendement plus faible (~ 1-2% des colonies criblées contenait une intégration correcte) pour C. 12 parapsilosis, par rapport à C. albicans. L' électroporation est une approche alternative au lithium transformation acétate qui peut améliorer l' efficacité de transformation 13. Utilisation du terminateur ADH1, bien que nécessaire pour une méthode de marquage universelle, peut modifier la stabilité et / ou la régulation de l'ARNm généré à partir de celui qui aurait eu lieu avec la séquence de terminaison native. Ce problème potentiel doit être pris en considération lorsque la fonction native d'une protéine est importante à la question de recherche spécifique. Pour les protéines de fusion fluorescentes qui sont exprimés à des niveaux faibles, la microscopie de toute la colonie d'identifier ou de tamis pour transformants ne peut pas être une option. Dans ce cas, la PCR et analyses Western blot fourniront des preuves de la fusion réussie protéine Sequrence / construction de protéines. Une limitation, commune à toutes les constructions de protéines de fusion, est que les marqueurs d'epitope peuvent interférer avec la fonction native de la protéine, ce qui entraîne phénotypes mutants non souhaitées, y compris la localisation anormale de la protéine de fusion. L'examen de ces questions est importante et les contrôles appropriés doivent être inclus comme indiqué.
Plasmides utiles pour générer des marqueurs d'épitopes dans Candida par cette approche de médiée par PCR, en plus de ceux mentionnés ici, ont déjà été générés par nos groupes de recherche et sont disponibles pour les chercheurs par le biais du Fungal Genetics Stock Center (http: //www.fgsc. net). Plus d'informations sur plusieurs de ces plasmides peut également être trouvé à (http://www6.tau.ac.il/berman/). Les plasmides disponibles contiennent une myriade de combinaisons de marqueurs nutritionnels et des médicaments de résistance, des séquences de PF pour générer différentes levures de couleur, d'autres options épitope tag (HA, myc, V5, HIS9) pour générer des protéines qui are marquées à soit les séquences carboxy- ou amino-terminales, et de promoteur pour l'expression constitutive et régulable de protéines. Les plasmides contenant des marqueurs de résistance aux médicaments sont particulièrement bénéfiques dans le domaine de la pathogénie des champignons que cet outil permet la transformation et l'étude des souches cliniques de levure qui sont prototrophes, rendu marqueurs nutritionnels conventionnels inutilisables. La construction de souches cliniques de Candida qui émettent une fluorescence à différentes longueurs d' onde seront utiles pour une variété de dosages biologiques cellulaires qui nécessitent la capacité de visualiser et de se différencier de multiples souches de levure en co-culture.
Maladie fongique invasive due à des espèces de Candida continue d'être un défi pour la santé humaine importante qui est difficile à traiter et est associée à une forte morbidité et de mortalité, en particulier chez les patients immunodéprimés 14, 15. Ainsi, les outils moléculaires qui permettent la rechercheteurs pour étudier plus rapidement et facilement Candida interactions espèces-hôtes sont d' une importance vitale pour approfondir notre compréhension des mécanismes de la biologie et la pathogenèse de Candida.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous remercions N. Dean pour fournir la séquence mCherry FP d'origine, M. Gerami-Nejad pour la construction de plasmides, B. Larson pour l'assistance technique, et T. Heisel pour obtenir des conseils utiles lors de l'élaboration de ce projet. JB a été soutenu par le Prix du Conseil européen de la recherche avancée 340087 (RAPLODAPT). systèmes de microscopie et d'imagerie ont été fournis par la Fondation Université de Minnesota Pediatrics et l'Université du Minnesota Imaging Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 W mercury lamp | CHIU Technical Corporation | M-100T | |
| 95% Ethanol | Any | NA | |
| Adenine | Any | NA | |
| Ampicillin | Any | NA | |
| Carrier DNA | Ambion | AM9680 | Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml |
| CCD Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ | |
| Conical Tube | Corning | 430828 | 50 ml |
| Culture Tube Rotator | New Brunswick | 2013923 | TC-8, or Any Culture Tube Rotator |
| Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade | Any | NA | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 022363719, 022363212 | 0.5 ml, 1.5 ml |
| Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | 7250089 | 125 ml |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any | NA | |
| Freezer (-80 °C) | Thermo Electron Corporation | ULT-1386-9-V | Revco Ultima II |
| GFP, YFP and Texas Red Filter Sets | Chroma Technology Corporation | 49002, 86004v2, 49008 | |
| Glass culture tubes | Fisher Scientific | 1496126 | 75 mm |
| HRP goat anti-mouse antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2005 | |
| HRP goat anti-rabbit antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2301 | |
| Incubator (30 °C) | Any | NA | |
| Lithium Acetate | Any | NA | |
| Lysogeny Broth (LB) Media | Any | NA | |
| Magnesium Chloride | Any | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Microscope | Nikon | E600 | Nikon Eclipse E600 |
| Microscope Image Analysis Software | Universal Imaging Corporation | 6.3r7 | MetaMorph Software Series 6.3r7 |
| Mouse anti-GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| Nourseothricin | Fisher Scientific | 50997939 | |
| PCR Thermocycler | Applied Biosystems | 9700 | GeneAmp PCR System |
| PCR tubes | BioExpress, GeneMate | T-3035-1 | 0.2 ml |
| Polyethylene Glycol 3350 | Any | NA | |
| Potassium Chloride | Any | NA | |
| Rabbit anti-mCherry antibody | BioVision | 5993-100 | |
| Refrigerator (4 °C) | Any | NA | |
| Sodium Acetate | Any | NA | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Table Top Centrifuge | Labnet | Z 400 | Hermle Z 400 |
| Taq DNA Polymerase | Any | NA | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media | Any | NA |
References
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