Introduction
疟疾是一个重大的全球健康问题。 1严重疟疾的特征部分是脑受累，往往是不良预后因素。疟疾传播高的地区，五岁以下儿童的脑梗死是常见的，并且是该年龄组疟疾相关死亡的主要原因。 1虽然积极的治疗可以挽救生命，但是特别是早期阶段的脑疟疾检测可能很困难。涉及脑疟疾的病理过程包括微血管破裂和脑水肿，可导致严重的脑肿胀。在本文中，我们提出了磁共振成像（MRI）协议，允许全脑脑实验性脑疟疾（ECM） 体内成像。全脑高分辨率成像方法在这种疾病中已经广泛利用不足，尽管对ECM如何在中枢起搏方面知之甚少神经系统或什么具体机制导致疾病。涵盖全脑的体内 MRI代表了一种重要的研究工具，可以更好地了解ECM病理学。 MRI能够评估全球大脑脑肿胀，最近已经被认为是ECM的重要预测因子，也是人脑疟疾的重要预测因素。 2，3严重的脑肿胀发生在致命疾病中，代表了ECM模型与人类疾病之间的几种病理特征之一，其特征是炎症和微血管改变。 4
可以通过感染致死的疟原虫疟原虫ANKA在CBA或C57BL小鼠中诱导ECM 。 ECM的发病通常发生在感染后6天和10天之间，并且导致拟合，共济失调，呼吸窘迫和昏迷，这导致说唱id死亡。 4快速鼠类昏迷和行为量表（RMCBS）是评估ECM临床症状的有益成绩。它由10个参数组成，每个评分从0到2，最大可能得分为20. 6最近，我们在ECM小鼠中RMCBS评分的严重程度和MRI证实的病理变化之间表现出良好的一致性。 7在本协议中，我们描述了小鼠的ECM诱导和ECM小鼠的体内磁共振成像。
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Protocol
本文中报道的所有动物实验均根据实验动物科学协会联合会（FELASA）B类和实验动物科学学会（GV-SOLAS）标准指南进行，并得到当地德国当局在卡尔斯鲁厄（卡尔斯鲁厄大学（RegierungspräsidiumKarlsruhe） ，德国）。请注意，生物安全级别2适用于蚊子和Bermhei疟原虫ANKA子孢子工作。
感染
- 通过在拜访模式鼠标上喂养15分钟来感染按摩皂甙Stephensi蚊子与Berghei ANKA 疟原虫 。将感染的蚊子保持在80％湿度和21°C。
- 在血餐后17天至22天，从笼子里收集女性蚊子。将它们放在冰上麻醉它们。
- 使用镊子，将三至四只蚊子放在载有一滴冷RPMI培养基的玻片上。将幻灯片放在显微镜下。 <li>使用镊子，小心翼翼地伸展头部和身体之间的蚊子。使用注射器和针头分离唾液腺。用剩余的蚊子重复这个步骤。
- 通过用玻璃移液管吸取玻璃移液管，从玻片上收集唾液腺，并将其收集在1.5 mL离心管中。
注意：根据感染率，每唾液腺通常可以获得8,000至15,000个感染性子孢子。 - 约3分钟，用小的塑料棒粉碎离心管内的分离的唾液腺，以将子孢子与唾液腺组织分离。
- 在1,000×g和4℃下离心3分钟以净化剩余组织中的子孢子。
- 将含有子孢子（SPZ）的上清液吸移到新的离心管中，并计数Neubauer血细胞计数器中的纯化子孢子。
- 通过添加ph将浓缩的子孢子浓度调整为10,000 / mL盐酸缓冲盐水。
- 将总共1000个子孢子（0.1mL）注入近交C57BL / 6小鼠的尾静脉中以引发感染。为了方便注射，将C57BL / 6小鼠置于限制器中，并将尾巴放入温热（约37℃）的水中以帮助尾静脉的可视化;
注意：注射本身是一个简短的过程，可以在几秒钟内完成。 - 每天一次，在SPZ感染后，从第3天开始，检查血液涂片上的血液寄生虫血症。
注意：监测寄生虫血症以前在Mueller 等人的JoVE文章中可视化。 8 - 从子孢子注射后的第5天开始，用Rapid Murine Coma and Behavior Scale（RMCBS）评分每日一次。
注意：Caroll 等人已经发表了此程序的详细描述，包括视频演示。 6 - 评估根据RMCBS评分的MRI成像小鼠和研究问题需要解决。 6
磁共振成像设置
- 使用用于射频传输的音量谐振器和4通道相控阵表面接收器线圈在9.4T小型动物扫描仪上进行MRI。将温度控制的水浴打开至42°C，以保持鼠标的体温。
- 在室内使用2％异氟烷和压缩空气诱导麻醉，直到鼠标不再对脚趾反应。维持麻醉1-1.5％。
- 将尾静脉导管放入小鼠的尾静脉。将鼠标放置在MRI上，并将其放置在装有头锁和牙杆的动物床上，以尽量减少头部运动。注意不要拉直老鼠的颈椎。
- 将造影剂注射系统连接到尾静脉导管。使用填充有Gd-DTPA（0.3 mmol / kg）注射器的定制注射系统，或使用连接到Gd-DTPA（0.3 mmol / kg）注射器的PE管。
- 将双酚茴香眼膏用于双眼。将4通道相控阵表面接收头线圈放置在鼠标头上。将呼吸垫放在鼠标背面并将其连接到呼吸监测装置上。
成像协议
注意：根据要解决的研究问题，从下面列出的协议中选择成像序列。所有列出的参数对MRI软件有效，但如果使用其他软件程序，则可能需要进行调整。
- 首先进行本地化扫描，以确保鼠标的大脑位于磁铁的等中心。
- 为了定性评估血管性水肿，通过选择多切片RARE序列，使用3D T2加权成像。
- 输入以下pa参考MRI软件：重复时间= 2.000 ms，回波时间= 22 ms，各向同性分辨率= 0.1mm，视场= 20 x 10 x 12 mm 3 ;矩阵= 200×100×120，翻转角= 90〜180°; （自旋回波），稀有因子= 8.启动序列，等待10分48秒获取原始图像。
- 定量评估血管性水肿，通过选择多切片多自旋回波序列来进行T2松弛度测定。
- 使用以下参数：重复时间= 3.100 ms，回波时间= 8-136 ms，增量为8 ms，切片数为17，切片厚度= 0.7 mm，平面分辨率= 0.116 mm x 0.116 mm，视场20 x 20 mm 2 ，矩阵= 172 x 172，翻转角= 90-180度; （自旋回波）。启动序列，等待8分53秒获取原始图像。
- 为了定量评估血管性水肿和细胞毒性水肿，进行扩散加权成像/表观扩散系统通过选择自旋回波EPI扩散序列来实现（ADC）映射。
- 使用以下参数：重复时间= 3.400ms，回波时间= 20ms，切片厚度= 0.7mm，切片数= 17，扩散敏化方向数= 30，b值= 1.500s / mm 2 ，δ= 3ms ，Δ= 9ms，部分傅里叶编码加速因子= 1.51，视场= 12×15mm 2 ，矩阵= 96×128，平面内分辨率= 0.125mm×0.117mm，翻转角= 90-180度，以及饱和片数（矢状）= 1.启动序列，等待7分56秒，直到获取原始图像。
- 评估微血肿，使用3D T2 *加权成像。选择流量补偿FLASH序列。
- 在MRI软件中输入以下参数：重复时间= 2.000 ms，回波时间= 22 ms，各向同性分辨率0.08 mm，视场= 32 x 15 x 8 mm 3 ，矩阵大小= 400 x 188 x 100，f唇角= 12度。启动序列，等待15分40秒获取原始图像。
- 为了评估动脉通畅，通过选择3D FLASH序列来使用飞行时间血管造影。
- 在MRI软件中使用以下参数：重复时间= 16 ms，回波时间= 3.5 ms，切片厚度= 0.07 mm，平面内分辨率= 0.104 x 0.104 mm，视场= 20 x 20 x 10 mm 3 ，矩阵= 192×192×142，翻转角= 15度。启动序列并等待7分钟16秒直到获取图像。
- 为了评估血脑屏障破坏，在造影剂注射0.3 mmol / kg之前和之后使用3D T1加权成像。选择具有全球射频激励的射频损坏FLASH序列。
- 在MRI软件中使用以下序列参数：重复时间= 5 ms，回波时间= 1.9 ms，各向同性分辨率= 0.156 mm，视场20 x 18.7×18.7mm 3 ，矩阵128×120×120，翻转角= 8.5°。启动序列并等待1分14秒，直到获取图像。
图像处理与分析
- 为了分析血脑屏障破坏，使用ImageJ中的算术工具或图像计算器工具从增强型T1加权图像中减去3D非增强T1加权图像。评估减法图像以增加信号，这对应于血脑屏障破坏。 9
- 要分析大脑体积，请使用本机3D T1-或3D T2加权数据集。使用分割编辑器将大脑从嗅球描绘成小脑。 10
- 血管性水肿
- 用MRI软件处理T2松弛度数据或使用非线性最小二乘法拟合程序。 11使用MRI sof处理扩散加权数据以获得ADC图tware或FDT工具箱（请参阅材料表 ）。
- 将感兴趣区域手动放置到不同的解剖区域。
注意：感兴趣区域的自动放置可能由于显着的大脑肿胀而不正确地注册。以这种方式获得所选解剖区域的T2时间和ADC值。
- 为了分析微出血体积，使用分割编辑器描绘在T2 *加权数据集上显示为卵形，黑色焦点的微出血。
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Representative Results
在C57BL / 6小鼠中，可以观察到ECM的第一临床症状，在用Berghei ANKA子孢子感染后的第 6天和第10天之间。 ECM在60-80％的感染小鼠中发展，并在24至48小时内迅速进入昏迷和死亡。相比之下，不会发展ECM的小鼠在感染后第二周因死于高血糖症严重贫血而死亡。 12
在MRI成像中，ECM的最早的迹象在嗅球中是可见的，嗅球属于小鼠的嗅觉系统，位于脑的脊髓部分。 7，13血脑屏障破裂的增加（在对比度增强的T1加权图像上看到）和流体增加（T2加权图像上的T2信号增加，T2弛豫测量和扩散加权成像）表明早期血管性水肿在已经存在轻度疾病（RMCBS评分20-16）的嗅球中，随着疾病的严重程度的增加而开始扩散。相对的T1信号图像有助于检测微小的血脑屏障中断（ 图1 ）。血脑屏障破坏和血管性水肿以特定的方式进展。这些病理变化沿着非常严重的疾病（RMCBS疮9-0）达到的脑干移植物流，成为神经母细胞的迁移途径。在T2图上， 如图2所示 ，通过将感兴趣的区域绘制到特定解剖区域可以量化血管性水肿的严重程度。对于每个区域，可以获得随着水肿增加而增加的T2弛豫时间。随着血管性水肿和血脑屏障破坏，脑肿胀开始于ECM严重程度增加。脑水肿指示水肿开始显着增加中度病态小鼠com与严重病态小鼠相比基线和进一步增加（ 图3 ）。
如血脑屏障破裂和血管性水肿的首次征象发生在微血管出血和血管易感性对比（对应于缓慢流量）的证据表明的微血管病理学，并且可以用T2 *加权成像显现。微出血主要发生在嗅球（ 图4 ）。随着进行性疾病，微出血数量增加。伴有进行性疾病，大脑皮质，基底神经节，小脑，白质和脑干中也出现微血管出血。
通过飞行时间血管造影术可以看出动脉通畅减少是与微血管变化平行的大血管损伤的征兆。脑梗塞不是ECM中的关键发现。然而，在非常严重的疾病，重点领域可以鉴定ADC减少，表明脑梗死。
图1：血脑屏障中断。 （ A ）代表冠状3D T1加权图像。在嗅球的中心区域中T1信号的增加是可见的。 （ B ）在相应的T1相对信号图像（T1对比度图像中减去T1对比度图像）后，造影剂外渗更易于描绘。造影剂外渗可见于额叶皮层区域（白色箭头）。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2：T2放松ometry。以不同高度的样本T2映射，其中RMCBS评分为5（ A ）的RMCBS评分和基线扫描（ B ）的不同高度以颜色标度显示，以灰度显示，灰度显示为ROI作为彩色重叠。深蓝色= RMS，绿色=皮质，绿松石=外胶囊，黄色=基底神经节，浅蓝色= DMS，橙色=丘脑，红色=脑干请点击此处查看此图的较大版本。
图3：脑体积测量。中度病态小鼠的脑体积显着增加（RMCBS 15-10）。显示了10只小鼠的代表性值。数据表示为平均标准差。配对的学生t检验用于分析胸罩的差异在组之间膨胀。在中度/重度病态的小鼠中，与基线相比，脑体积显着增加（p = 0.021 / 0.001）。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4：微出血。显示在血液感染发生前（ A ）和感染RMCBS评分为14（ B和C ）的第8天之后的小鼠的代表性T2 *加权图像。在第一个图像中，没有明显的出血（ A ），而在第二和第三图像中，几个微出血是可见的，在嗅球中占优势（B：平面冠状图像; C：具有分段微出血的3D投影）。
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Discussion
在本文中，我们描述了一个全脑MRI方案来描绘实验性脑疟疾的变化。我们认为迄今为止，疟疾研究中MRI尚未得到充分利用，希望我们的方案能够帮助其他调查人员。我们想描述一些可能有帮助的附加要点。
如果严重恶心的小鼠成像，定位至关重要。由于颅内压升高，小鼠易死亡，因此颈椎不应伸展。麻醉也应保持在最低限度。如果轻度疾病的小鼠成像，MRI的最佳时间点是在预期首次出现临床症状前12-24小时。嗅球中的轻度血管性水肿在不显示ECM的临床体征的小鼠中是可见的（RMCBS评分为20）。
MRI协议本身的长度可以根据具体的研究问题进行调整。最小的原型col应包括T2加权序列或T2松弛度和T2 *加权序列，以判断血管性水肿和微血管负荷/微血管损伤的存在。为了获得优质图像，运动文物应保持在最低限度。运动将通过鼠标的适当定位并通过将呼吸速率保持在每分钟约60-80次呼吸来减少。
其他体内成像方法，如活体显微术，显示出在细胞水平上可视化ECM中的病理改变的希望。 14，15，16，17与MRI相比，活体显微镜可以提供高空间分辨率，但只能覆盖有限的皮层区域。相比之下，MRI能够以高达80μm的分辨率覆盖整个大脑。因此，MRI可以通过识别来指导进一步的细胞调查偏好地点 - 疾病的开始以及疾病的阶段，然后可以使用进一步的方法来评估疾病。可以将ECM中的MRI发现与在人脑疟疾中用MRI检测到的病理学改变进行比较。人类和实验性脑疟疾都在神经发生区域显示血管性水肿，以及微血管病变，如流域区域的继发性脑梗塞。 7，18白色和灰色物质以类似的方式受到影响，人和实验性脑疟疾中的脑肿胀都涉及严重疾病中的脑干，从而解释昏迷状态。 2，7
我们希望体内成像有助于揭开目前仍然难以捉摸的脑疟疾的潜在病理机制。由于水肿和脑肿胀几乎看不到体内，我在体内可视化这种病理学的方法是关键，将有助于改善新型疗法和疫苗接种的评估。
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Acknowledgments
衷心感谢Miriam Reinig的专家技术援助。 AH由海德堡大学医学院的博士后补助金资助。 MP由Else-Kröner-Fresenius基金会的纪念津贴支持。 AKM是德国感染研究中心（DZIF）DZIF学院的产假津贴的获得者。 JP是海德堡分子医学研究中心（HRCMM）职业发展奖学金的获得者。我们进一步感谢Julia M. Sattler和Friedrich Frischknecht提供了子孢子运动的典型电影。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Baxter | 1001747 | for anesthesia |
| Dotarem | Guebert | 1086923 | Gd-DTPA contrast agent; 0.5 mmol/mL |
| Amira (Image Processing Program) | FEI Group | Version Amira 5.3.2 | |
| MATLAB | The MathWorks, Inc., | Release 2012b | |
| FDT toolbox | FMRIB's Software Library | http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fdt/index.html |
References
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