Introduction
La malaria è un grave problema di salute globale. 1 La malaria grave è caratterizzata in parte dal coinvolgimento cerebrale e spesso è un fattore prognostico scarso. Il coinvolgimento cerebrale è comune nei bambini al di sotto dei cinque anni in aree di trasmissione di malaria elevata e rappresenta la causa principale della morte correlata alla malaria in quel gruppo di età. 1 Mentre il trattamento aggressivo può essere salvato, il rilevamento della malaria cerebrale, soprattutto nelle fasi iniziali, può essere difficile. I processi patologici coinvolti nella malaria cerebrale includono la disfunzione microvascolare e l'edema cerebrale, che possono portare a rigonfiamenti del cervello. In questo articolo, presentiamo un protocollo di risonanza magnetica (MRI) che consente l'imaging in vivo di tutta la cervello della malaria cerebrale sperimentale (ECM). I metodi di imaging ad alta risoluzione ad intero cervello sono stati ampiamente inutilizzati in questa malattia, anche se poco conosciuto su come l'ECM inizia nel centroIl sistema nervoso o quali meccanismi specifici conducono alla malattia. La risonanza magnetica in vivo , che copre l'intero cervello, rappresenta un importante strumento di ricerca per ottenere una migliore comprensione della patologia ECM. La MRI è in grado di valutare il gonfiore del cervello cerebrale globale, che è stato recentemente riconosciuto come un importante predittore della morte non solo in ECM, ma anche nella malaria cerebrale umana. 2 , 3 Il gonfiore cerebrale si manifesta in malattie fatali e rappresenta una delle caratteristiche patologiche tra i modelli ECM e la malattia umana, una malattia caratterizzata da alterazioni infiammatorie e microvascolari. 4
ECM può essere indotto nei topi CBA o C57BL attraverso l'infezione con letale Plasmodium berghei ANKA. 5 L'insorgenza di ECM si verifica tipicamente tra i giorni 6 e 10 dopo l'infezione e produce risultati di attaccamento, atassia, distress respiratoria e coma, che portano a rapId di morte. 4 La Coma di Rapid Murine e la Scala del Comportamento (RMCBS) è un utile punteggio per valutare i sintomi clinici di ECM. È composto da 10 parametri, ognuno segnato da 0 a 2, con un punteggio massimo di 20 possibile. 6 Recentemente, abbiamo mostrato un buon accordo tra la gravità dei punteggi RMCBS nei topi ECM e le modificazioni patologiche dimostrate da MRI. 7 In questo protocollo, descriviamo l'induzione di ECM nei topi e la rappresentazione in vivo di risonanza magnetica dei topi con ECM.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali riportati in questo articolo sono stati condotti secondo le linee guida della Federazione per le Associazioni di Scienza degli Animali del Laboratorio (FELASA) e le norme standard della Società di Scienze del Laboratorio (GV-SOLAS) e sono state approvate dalle autorità locali tedesche a Karlsruhe (Regierungspräsidium Karlsruhe , Germania). Si prega di notare che il livello 2 di biosavidità si applica alla zanzara e al lavoro di sporozoite Plasmodium berghei ANKA.
1. Infezione
- Infettare Anopheles stephensi zanzare con Plasmodium berghei ANKA alimentandole per 15 minuti su un topo gametocytemico. Mantenere le zanzare infette con umidità del 80% e 21 ° C.
- Raccogli le zanzare femminili dalla loro gabbia da 17 a 22 giorni dopo il pasto del sangue. Posizionarli sul ghiaccio per anestetizzarli.
- Usando le pinze, piazzate tre o quattro zanzare su una vetrata in vetro coperta da una goccia di mezzo RPMI a freddo. Posizionare la diapositiva sotto un microscopio. <Li> Usando le pinze, allungare attentamente la zanzara tra la testa e il corpo. Isolare la ghiandola saliva utilizzando una siringa e un ago. Ripetere questa procedura con le zanzare restanti.
- Raccogliere le ghiandole salivari dal vetrino vetrino succhiandole con una pipetta di vetro e raccoglierle in un tubo da centrifuga da 1,5 ml.
NOTA: A seconda delle frequenze di infezione, possono essere ottenute da 8 a 15.000 sporozoiosi infettive per ghiandola saliva. - Per circa 3 minuti, distruggere le ghiandole salivari isolate all'interno del tubo di centrifuga con un piccolo bastone di plastica per isolare gli sporozoi dal tessuto ghiandolare salivare.
- Centrifugare per 3 minuti a 1.000 xg e 4 ° C per purificare le sporozoie dal tessuto rimanente.
- Pipettare il surnatante, che contiene gli sporozoietti (SPZ), in un nuovo tubo di centrifuga e contare i sporozoiemi purificati in un neutro di hemocytometer Neubauer.
- Regolare la concentrazione di sporozoiemi purificati a 10.000 / mL aggiungendo phSalina tampone osfato.
- Iniettare un totale di 1.000 sporozoiti (0.1 mL) nelle vene della coda dei topi C57BL / 6 inbred per iniziare l'infezione. Per facilitare le iniezioni, posizionare i topi C57BL / 6 in un contenitore e mettere le code in acqua calda (circa 37 ° C) per assistere alla visualizzazione delle vene della coda;
NOTA: L'iniezione stessa è una procedura breve che può essere eseguita entro pochi secondi. - Una volta al giorno, controllare la parassitemia dello stadio del sangue sui rilievi del sangue dal 3 ° giorno dopo l'infezione da SPZ.
NOTA: Il monitoraggio della parassitemia è stato precedentemente visualizzato in un articolo di JoVE di Mueller et al. 8 - Valutare i topi una volta al giorno con il punteggio Coma Rapid Coma e Comportamento (RMCBS), a partire dal giorno 5 dopo l'iniezione di sporozoite.
NOTA: Una descrizione dettagliata di questa procedura, inclusa una dimostrazione video, è stata pubblicata da Caroll et al. 6 - ValutareI topi con immagini RM in base al punteggio RMCBS e alla domanda di ricerca da affrontare. 6
2. Impostazione di risonanza magnetica
- Eseguire la MRI su un piccolo scanner animale 9,4T utilizzando un risonatore di volume per la trasmissione di radiofrequenza e una bobina di ricevitore di superficie a matrice a 4 canali. Accendere il bagno d'acqua controllato dalla temperatura a 42 ° C per mantenere la temperatura corporea del mouse.
- Indurre l'anestesia in una camera usando 2% isoflurano e aria compressa finché il topo non reagisce più a un pizzico di punta. Mantenere l'anestesia a 1-1,5%.
- Posizionare un catetere della coda della coda nella vena della coda del mouse. Posizionare il mouse per la risonanza magnetica, posizionandolo inclinato e con schiena crudelata su un letto animale dotato di un blocco di testa e di un dente per minimizzare il movimento della testa. Fare attenzione a non raddrizzare la colonna cervicale del mouse.
- Collegare un sistema di iniezione del agente di contrasto al catetere della coda della coda. Utilizzare un sistema di iniezione su misura con una siringa Gd-DTPA (0,3 mmol / kg) o utilizzare tubi PE collegati ad una siringa Gd-DTPA (0,3 mmol / kg).
- Applicare un occhio di dexpanthenol agli occhi. Collocare la bobina di testa del ricevitore di superficie a matrice a 4 canali sulla testa del mouse. Posizionare un rilievo di respirazione sul retro del mouse e collegarlo ad un dispositivo di monitoraggio della respirazione.
3. Imaging Protocol
NOTA: Scegliere le sequenze di imaging dal protocollo elencato di seguito in base alle domande di ricerca da affrontare. Tutti i parametri elencati sono validi per il software MRI, ma potrebbero essere necessari aggiustamenti se vengono utilizzati altri programmi software.
- Iniziare eseguendo una scansione di localizzazione per assicurarsi che il cervello del mouse sia nell'isocentro del magnete.
- Per valutare qualitativamente l'edema vasogenico, utilizzare 3D imaging ponderato con T2 selezionando una sequenza RARE multi-slice.
- Immettere il seguente paRameters nel software MRI: tempo di ripetizione = 2.000 ms, tempo di eco = 22 ms, risoluzione isotropica = 0.1mm, campo visivo = 20 x 10 x 12 mm 3 ; Matrice = 200 x 100 x 120, angolo di rotazione = 90-180 °; (Spin-echo) e fattore raro = 8. Avviare la sequenza e attendere 10 min 48 s per acquisire le immagini grezze.
- Per valutare quantitativamente l'edema vasogenico eseguire la rilassometria T2 selezionando una sequenza multipla di eco multipli di spin.
- Utilizzare i seguenti parametri: tempo di ripetizione = 3.100 ms, echo time = 8-136 ms in incrementi di 8 ms, numero di fette = 17, spessore di spessore = 0.7 mm, in risoluzione piano = 0.116 mm x 0.116 mm, campo visivo 20 X 20 mm 2 , matrice = 172 x 172, angolo di rotazione = 90-180 gradi; (Spin-echo). Avviare la sequenza e attendere 8 min 53 s per acquisire le immagini originali.
- Per valutare quantitativamente sia l'edema vasogenico che l'edema citotossico, effettuare un'immagine ponderata diffusione / apparente diffusione coeMappatura Fficient (ADC) selezionando una sequenza di diffusione EPI di spin-echo.
- Utilizzare i seguenti parametri: tempo di ripetizione = 3.400 ms, tempo di echo = 20 ms, spessore di spessore = 0.7 mm, numero di fette = 17, numero di sensi sensibili alla diffusione = 30, valore b = 1.500 s / mm 2 , δ = 3 ms , Δ = 9 ms, fattore di accelerazione parziale Fourier encoder = 1,51, campo visivo = 12 x 15 mm 2 , matrice = 96 x 128, risoluzione in-plane = 0,125 mm x 0,117 mm, angolo di rotazione = 90-180 gradi e Numero di fasce di saturazione (sagittale) = 1. Avviare la sequenza e attendere 7 min 56 s fino a acquisire le immagini grezze.
- Per valutare i microemorramenti, utilizzare l'imaging in 3D T2 *. Selezionare una sequenza FLASH compensata dal flusso.
- Immettere i seguenti parametri nel software MRI: tempo di ripetizione = 2.000 ms, tempo di eco = 22 ms, risoluzione isotropica 0.08 mm, campo visivo = 32 x 15 x 8 mm 3 , dimensione matrice = 400 x 188 x 100 e fL'angolo del labbro = 12 gradi. Avviare la sequenza e attendere 15 min 40 s per acquisire le immagini originali.
- Per valutare la libertà arteriosa, utilizzare il tempo di angiografia del volo selezionando una sequenza FLASH 3D.
- Utilizzare i seguenti parametri nel software MRI: tempo di ripetizione = 16 ms, tempo di echo = 3,5 ms, spessore della fetta = 0,07 mm, risoluzione in-plane = 0,104 x 0,104 mm, campo visivo = 20 x 20 x 10 mm 3 , matrice = 192 x 192 x 142 e angolo di rotazione = 15 gradi. Avviare la sequenza e attendere 7 min 16 s fino a acquisire le immagini.
- Per valutare la perturbazione della barriera emato-sangue, utilizzare l'imaging 3D T1-ponderato prima e dopo l'iniezione di un agente di contrasto di 0,3 mmol / kg. Selezionare una sequenza FLASH viziata con frequenza radio con un'eccitazione globale a radiofrequenza.
- Utilizzare i seguenti parametri di sequenza nel software MRI: tempo di ripetizione = 5 ms, tempo di eco = 1,9 ms, risoluzione isotropica = 0,156 mm, campo visivo 20 x 18,7X 18,7 mm 3 , matrice 128 x 120 x 120 e angolo di avvolgimento = 8,5 ° ;. Avviare la sequenza e attendere 1 min. 14s fino a acquisire le immagini.
4. Elaborazione e analisi delle immagini
- Per analizzare la perturbazione della barriera emato-sangue, sottrarre immagini in 3D non migliorate con T1 da immagini aumentate di T1 con lo strumento aritmetico o con il calcolatore di immagini in ImageJ. Valutare le immagini di sottrazione per un aumento del segnale, che corrisponde alla rottura della barriera emato-sangue. 9
- Per analizzare il volume del cervello, utilizzare i nativi 3D T1 o 3D T2-weighted set di dati. Delineare il cervello dalla lampadina olfattiva al cervelletto usando l'editor di segmentazione. 10
- Edema vasogenico
- Processare i dati della rilassometria T2 con il software MRI o utilizzare una procedura di adattamento non lineare di minimi quadrati. 11 Dati di diffusione di processo elaborati per ottenere mappe ADC usando il sof MRITware o FDT (vedi tabella dei materiali ).
- Posizionare manualmente le regioni di interesse nelle varie regioni anatomiche.
NOTA: il posizionamento automatico di regioni di interesse può registrarsi in modo errato a causa di un rigonfiamento del cervello significativo. I valori T2 e ADC delle regioni anatomiche scelte sono ottenuti in questo modo.
- Per analizzare il volume di microemorragia, delineare microemorramenti, che appaiono come ovoidi, foci scuri su set di dati ponderati T2 *, utilizzando l'editor di segmentazione.
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Representative Results
Nei topi C57BL / 6 i primi sintomi clinici di ECM possono essere osservati nei giorni 6 e 10 dopo l'infezione con sporozoites P. berghei ANKA . ECM si sviluppa nel 60-80% dei topi infetti e progredisce rapidamente al coma e alla morte entro 24 - 48 h. Al contrario, i topi che non sviluppano ECM muoiono dopo la seconda settimana dopo l'infezione da anemia grave a causa di iperparastasiemia. 12
Nell'immagine MRI, i primi segni di ECM sono visibili nella lampadina olfattiva, che appartiene al sistema olfattivo del topo e si trova nella parte rostrale del cervello. 7 , 13 Un aumento della disfunzione della barriera emato-sangue (visto sulle immagini a ponderazione T1-aumentata del contrasto) e un aumento del fluido (aumento del segnale T2 sulle immagini a ponderazione T2, la rilassometria T2 e l'imaging ponderato sulla diffusione) indicano un edema vasogenico precoceNella lampadina olfattiva già presente in lieve malattia (RMCBS score 20-16) e inizia a diffondersi come la gravità della malattia aumenta. Le immagini relative al segnale T1 aiutano a individuare una delicata disfunzione della barriera emato-sangue ( Figura 1 ). La disfunzione della barriera emato-cerebrale e l'edema vasogenico procedono in modo specifico. Questi cambiamenti patologici si sviluppano lungo il flusso migratorio rostrale, un percorso migrativo per i neuroblasti, verso il sistema cerebrale, raggiunto in una malattia molto grave (RMCBS malata 9-0). Su mappe T2, la gravità dell'edema vasogenico può essere quantificata disegnando regioni di interesse in regioni anatomiche specifiche, come dimostrato nella figura 2 . Per ogni regione si può ottenere un tempo di rilassamento T2 che aumenta con l'aumentare dell'edema. Insieme con l'edema vasogenico e la disfunzione della barriera emato-sangue, il gonfiore del cervello inizia quando la gravità del ECM aumenta. Il volume del cervello indicativo di edema inizia ad aumentare significativamente nei topi moderatamente malati come comAlla base e ad ulteriori aumenti nei topi gravemente malati ( Figura 3 ).
Patologie microvascolari, come evidenziato da microemorramenti e un aumento del contrasto di suscettibilità dei recipienti (corrispondenti a flusso lento), si verifica dopo i primi segni della disfunzione della barriera emato-sangue e dell'edema vasogenico e possono essere visualizzati con l'imaging ponderato T2 *. Le microemorrazie si verificano prevalentemente nella lampadina olfattiva ( Figura 4 ). Il numero di microemorramenti aumenta con malattia progressiva. Con progressive malattie microemorramenti sono anche evidenti in corteccia, gangli basali, cerebellum, materia bianca e cerebrale.
La diminuzione della patologia arteriosa è vista dall'angiografia del tempo di volo come segno di alterazione macrovascolare in parallelo ai cambiamenti microvascolari. L'infarto cerebrale non è un risultato fondamentale in ECM. Nelle malattie molto gravi, tuttavia, le aree focali diLa diminuzione dell'ADC può essere identificata, indicando infarti cerebrali.
Figura 1: Interruzione del Barriere Sanguigno-Cervello. ( A ) Una rappresentazione coronale 3D di T1-ponderata immagine. Un aumento del segnale T1 è visibile nella regione centrale della lampadina olfattiva. ( B ) Sulla corrispondente immagine del segnale relativo T1 (immagine di pre-contrasto T1 sottratta dall'immagine post-contrasto T1), è più facile definire l'estravasi dell'agente di contrasto. L'extravasazione dell'agente di contrasto è visibile nelle regioni corticali frontali (frecce bianche). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: T2 Relaxometry. Le mappe T2 di esempio a diverse altezze da un topo gravemente malato con un punteggio RMCBS di 5 ( A ) e dalla scansione di base ( B ) vengono visualizzate in scala di colore, in scala di grigi e in scala grigia con ROI come sovrapposizioni colorate. Blu scuro = RMS, verde = corteccia, turchese = capsula esterna, giallo = gangli basali, azzurro = DMS, arancio = talamo e rosso = cerebrale Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Misura del volume del cervello. Il volume del cervello aumenta significativamente in topi moderatamente malati (RMCBS 15-10). Sono mostrati valori rappresentativi di 10 topi. I dati sono presentati come la deviazione standard media. Un test t-paired Student's è stato utilizzato per analizzare le differenze nel reggisenoIn gonfiamento tra i gruppi. Nei topi moderatamente / gravemente malati, il volume del cervello è stato significativamente aumentato rispetto al basale (p = 0.021 / 0.001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Microemorramenti. Sono mostrate immagini rappresentative di T2 * di un topo prima dell'insorgenza dell'infezione del sangue ( A ) e del giorno 8 dopo l'infezione con un punteggio RMCBS di 14 ( B e C ). Nella prima immagine non sono evidenti microemorge ( A ), mentre nella seconda e terza immagine sono visibili diverse microemorrage, con una predominanza nella lampadina olfattiva (B: immagine coronale a pianta; proiezione C: 3D con microemorramenti segmentate).
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Discussion
In questo articolo, descriviamo un protocollo MRI intero a cervello per delineare i cambiamenti nella malaria cerebrale sperimentale. Riteniamo che la risonanza magnetica sia stata poco utilizzata nella ricerca sulla malaria e speriamo che i nostri protocolli aiuteranno altri investigatori. Vorremmo descrivere alcuni punti aggiuntivi che possono essere utili.
Se i topi gravemente malati vengono imaged, il posizionamento è cruciale. A causa di una maggiore pressione intracranica, i topi sono suscettibili di morte, e quindi la colonna vertebrale cervicale non deve essere allungata. L'anestesia dovrebbe anche essere mantenuta al minimo. Se i topi con malattia lieve sono imaged, il momento migliore per la risonanza magnetica è 12-24 h prima dell'inizio previsto dei primi sintomi clinici. L'edema vasogenico lieve nel bulbo olfattivo è visibile nei topi che non presentano segni clinici di ECM (punteggio RMCBS di 20).
La lunghezza del protocollo MRI stesso può essere adattata in base alla specifica domanda di ricerca. Il proto minimoCol deve includere una sequenza P2-weighted o T2 relaxometria e una sequenza P2 * per valutare la presenza di edema vasogenico e carico di microemorragia / compromissione microvascolare. Per ottenere immagini di buona qualità, i manufatti di movimento dovrebbero essere mantenuti al minimo. Il movimento sarà ridotto attraverso il corretto posizionamento del topo e mantenendo il tasso di respirazione a circa 60-80 breath per min.
Altri metodi di imaging in vivo , come la microscopia intravitale, mostrano promesse nella visualizzazione delle alterazioni patologiche in ECM a livello cellulare. 14 , 15 , 16 , 17 Rispetto al MRI, la microscopia intravitale può offrire un'elevata risoluzione spaziale al costo di coprire solo una zona corticale limitata. Al contrario, l'MRI è in grado di coprire l'intero cervello con una risoluzione fino a 80 μm. MRI può quindi guidare ulteriori indagini cellulari identificandoI siti di predilezione - l'inizio della malattia - nonché lo stadio della malattia, che può essere valutato usando ulteriori metodologie. Le scoperte di MRI in ECM possono essere confrontate con alterazioni patologiche rilevate con MRI in malaria cerebrale umana. Sia la malaria cerebrale umana che sperimentale dimostrano l'edema vasogenico nelle aree di neurogenesi, così come la patologia microvascolare, come gli infarti cerebrali secondari nelle aree spartiacque. 7 , 18 La materia bianca e grigia sono influenzate in modo analogo e il gonfiore del cervello sia nella malaria cerebrale umana che sperimentale coinvolge il sistema cerebrale in gravi malattie, spiegando lo stato comatose. 2 , 7
Speriamo che l'imaging in vivo aiuterà a svelare il meccanismo patologico sottostante della malaria cerebrale, che rimane attualmente inafferrabile. Come l'edema e il gonfiore del cervello sono appena visibili ex vivo, ioI thods per visualizzare questa patologia in vivo sono fondamentali e contribuiranno a migliorare la valutazione di nuove terapie e vaccinazioni.
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Acknowledgments
L'intervento tecnico esperto di Miriam Reinig è riconosciuto con gratitudine. AH ha ricevuto finanziamenti da uno stipendio postdoctorale della Facoltà di Medicina dell'Università di Heidelberg. Il deputato è sostenuto da uno stipendio commemorativo della Fondazione Else-Kröner-Fresenius. AKM è un destinatario di uno stipendio per la maternità dall'Accademia DZIF del Centro tedesco per la ricerca sulle infezioni (DZIF). JP è il destinatario di un Centro di Ricerca Heidelberg per la Medicina Molecolare (HRCMM) Borsa di Sviluppo per la Carriera. Inoltre riconosciamo con gratitudine Julia M. Sattler e Friedrich Frischknecht per aver fornito un film esemplare di movimento sporozoite.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Baxter | 1001747 | for anesthesia |
| Dotarem | Guebert | 1086923 | Gd-DTPA contrast agent; 0.5 mmol/mL |
| Amira (Image Processing Program) | FEI Group | Version Amira 5.3.2 | |
| MATLAB | The MathWorks, Inc., | Release 2012b | |
| FDT toolbox | FMRIB's Software Library | http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fdt/index.html |
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