Summary
لدراسة المبيض تطور الورم في نموذج ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، وكانت الكروية المتعددة الخلايا المستنبتة في microdevice تحت تدفق السوائل المحاكاة. هذا نموذج 3D دينامية يحاكي البيئة داخل الصفاق مع المكونات الخلوية والميكانيكية التي يحدث فيها المبيض سرطان خبيث.
Abstract
يتميز سرطان المبيض بنسبة الانبثاث البريتوني واسعة، مع المجالات ورم شائع في استسقاء الخبيثة. ويرتبط هذا مع النتائج السريرية الفقيرة ويفتقر حاليا العلاج الفعال. كل من ثلاثية الأبعاد (3D) البيئة والقوى الميكانيكية الحيوية هي عوامل هامة جدا في هذا تتالي النقيلي. ومع ذلك، تفشل مزارع الخلايا التقليدية أن ألخص هذه المكروية ورم الطبيعية. وهكذا، في الجسم الحي تشبه النماذج التي يمكن أن تحاكي البيئة داخل الصفاق ذات أهمية واضحة. في هذه الدراسة، تم إنشاء منصة ميكروفلويديك جديدة الصفاق إلى تقليد وضع الكروية سرطان المبيض في التجويف البريتوني خلال الانبثاث. كانت الكروية سرطان المبيض ولدت في ظل حالة غير ملتصقة مثقف في قنوات ميكروفلويديك المغلفة مع الخلايا الظهارية البريتوني تعرض لإجهاد القص ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. وباختصار، هذه الديناميكية 3D المبيض هيئة التصنيع العسكري للسرطان ميسوثيليوممنصة rofluidic يمكن أن توفر المعرفة الجديدة في مجال بيولوجيا السرطان الأساسية، ويكون بمثابة منصة لفحص المخدرات المحتملين والتنمية.
Introduction
سرطان المبيض هو السرطان أمراض النساء الأكثر فتكا ويتميز نشر البريتوني على نطاق واسع وتشكيل استسقاء خبيث 1. ويمثل هذا ورم خبيث البريتوني واسعة تحديا كبيرا السريري ويترافق مع النتائج السريرية الفقيرة. وخلافا لمعظم السرطانات الصلبة التي metastasize عن طريق الدم، وسرطان المبيض ينشر في المقام الأول داخل التجويف البريتوني. الخلايا السرطانية موجودة الركام كما متعددة الخلايا / الكروية خلال عملية ورم خبيث 2. حقيقة أن الثقافة تعليق يمكن أن تثري السرطان الجذعية / خلايا بدء ورم المبيض وتشير كذلك إلى أن هذه الأجسام الشبه الكروية قد تترافق مع كل من عدوانية الورم وتعزيز مقاومة كيميائية 3 و 4. هناك اختلافات في الاستجابة للدواء بين 2D و 3D الثقافات، والتي يفترض أن الآليات الجزيئية مختلفة 5.
_content "> التفاعل الضروري مع ميسوثيليوم يبني المكروية الأولية لتطور الورم المبيض. هذه الخلايا الظهارية تكمن في المصفوفة خارج الخلية (ECM)، حيث الفيبرونكتين هي المكونة في كل مكان. وصلة بين زيادة تعبير عن الظهارية الفيبرونكتين المشتقة من خلية و وقد تبين تطور الورم. [فيبرونكتين موجودة بوفرة في استسقاء خبيث 6 و 7. الخلايا السرطانية المبيض هي أيضا قادرة على حمل إفراز الفيبرونكتين من الخلايا الظهارية من أجل تعزيز أوائل المبيض سرطان خبيث 8.شواهد يدل على أن المحفزات الميكانيكية، بما في ذلك إجهاد القص، يمكن أن تعدل شكل الخلية، التعبير الجيني، وبالتالي، فإن الظواهر الخلايا السرطانية 9 و 10 و 11. كما استسقاء الخبيثة تطوير وتتراكم خلال رumor التقدم، تتعرض الخلايا السرطانية في المبيض لتدفق السوائل وإجهاد القص الناتجة عن ذلك. وهناك عدد من الجماعات، ولنا شمل، وقد أظهرت تأثير إجهاد القص على تطور سرطان المبيض، بما في ذلك التعديلات الهيكل الخلوي، والتحولات الظهارية إلى الوسيطة، وstemness السرطان 12، 13، 14، 15. وهكذا، فإن المكروية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية مهمة للتحقيق في ورم خبيث البريتوني. ومع ذلك، نظم الاستزراع الهيدروديناميكية في المختبر الحالية لديها قيود على محاكاة والسيطرة على ثابت، وانخفاض، والإجهاد ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية القص 16، 17، 18، 19. التقليدية في المختبر نهج التركيز إما على البيئة الخلوية أو الميكانيكية لا تزال محدودة فيمحاكاة تعقيد المكروية داخل الصفاق مع أهميتها الفسيولوجية المناسبة.
هنا، من أجل هندسة نموذجا جديدا من الصفاق للتغلب على القيود المفروضة على الاستراتيجيات التقليدية والنهوض دراسة حجرة داخل الصفاق في الانبثاث السرطان، تم تصميم منصة تستند ميكروفلويديك-3D مع تدفق السوائل التي تسيطر عليها. في هذا النموذج، كانت الكروية سرطان المبيض شارك في تربيتها مع الخلايا البريتوني الإنسان الأساسية الظهارية في رقائق ميكروفلويديك تحت تدفق فلويديك المستمر (الشكل 1A). كانت مطلية الخلايا الظهارية على فبرونيكتين. وكانت المصنفة غير ملتصقة الكروية سرطان المبيض إلى قنوات ميكروفلويديك مع متوسط التدفق المستمر perfused بواسطة مضخة الحقنة. كل من البيئة 3D والقوى الميكانيكية الحيوية من العوامل الهامة جدا من سلسلة النقيلي. هذا البرنامج يمكن أن تستخدم للتحقيق في المكروية داخل الصفاق من حيث سل معقدةlular وشارك في ثقافة التفاعلات، وكذلك فيما يتعلق الاشارات الميكانيكية الحيوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تصميم جهاز ميكروفلويديك وتلفيق
- التصميم الرئيسي ميكروفلويديك
- تصميم ورسم نمط قناة ميكروفلويديك مع أي (CAD) برامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر.
ملاحظة: عادة، يمكن أن ترسل الرسم كندي لشركة الضوئية الرئيسية لإنتاج الضوئية الرئيسية. تصميم ميكروفلويديك يتكون من ثلاث قنوات موازية متطابقة، مع كل الأبعاد التالية: 4 مم × 25 مم × 250 ميكرون (العرض × الطول × الارتفاع) وتعيين 2 مم على حدة. تم تصميم كلا طرفي قناة مع 127 درجة الزوايا لتسهيل دخول وخروج السائل (الشكل 1B). وذكرت القناة المستخدمة في هذا البروتوكول في منشور السابق 13. - غسل رقاقة السيليكون مع ultrasonication (500 W / 42 كيلو هرتز) في الأسيتون، الأيزوبروبانول، والماء منزوع الأيونات لمدة 15 دقيقة لكل منهما. تجفيف رقاقة مع غاز النيتروجين المضغوط. تسخين رقاقة السيليكون على طبق ساخن عند 250 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة حتى يجف تماماذلك.
- تدور معطف طبقة من SU-8 2075 مقاومة للضوء (125 ميكرون سميكة) على رقاقة السيليكون مع سرعة الدوران من 1800 دورة في الدقيقة. خبز الرقاقة المغلفة مقاومة للضوء مباشرة على طبق ساخن عند 65 درجة مئوية، ثم في 95 درجة مئوية، لإزالة المذيب الزائد، لمدة 5 و 25 دقيقة على التوالي (وفقا لدليل المنتج SU-8).
- كرر الخطوة 3 وتدور معطف طبقة أخرى من SU-8 2075 مقاوم الضوء للحصول على سمك النهائي من 250 ميكرون. خبز الرقاقة المغلفة مقاومة للضوء مباشرة على طبق ساخن عند 65 درجة مئوية لمدة 7 دقائق، ثم في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ببطء تبريد ويفر إلى درجة حرارة الغرفة. لا تبرد بالهواء المضغوط.
- محاذاة ووضع الضوئية الرئيسية مباشرة على الجزء العلوي من الرقاقة. تعريضها للأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 ق لتشعبي نمط.
- خبز الرقاقة مع مقاومة للضوء عند 65 درجة مئوية و 95 درجة مئوية على موقد لمدة 5 و 12 دقيقة على التوالي، لإزالة المذيب للبلمرة (وفقا لدليل المنتج SU-8). بعد ذلك، تبريد رقاقة لدرجة حرارة الغرفة.
- إزالة مقاومة للضوء غير crosslinked بغمر رقاقة في SU-8 مطور لمدة 25 دقيقة. شطف الرقاقة مع الأيزوبروبانول والجافة مع الهواء لضغوط.
ملاحظة: إذا لوحظ وجود حل حليبي عند الشطف مع الأيزوبروبانول، مشيرا إلى تطور غير مكتملة، تزج الرقاقة مرة أخرى إلى SU-8 المطور لفترة أطول تنمية. - وضع رقاقة على طبق ساخن على حرارة 180 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على شفاء نمط من الشقوق المحتملة. إيقاف طبق ساخن وبارد ببطء الرقاقة إلى درجة حرارة الغرفة التي تركها على طبق ساخن.
- إضافة بضع قطرات من ثلاثي كلورو (1H، 1H، 2H، 2H-perfluorooctyl) سيلاني في غطاء القارورة. وضع غطاء القارورة في مجفف فراغ. وضع رقاقة المقبل لغطاء القارورة إلى silanize الرقاقة لمدة 10 دقيقة.
- تصميم ورسم نمط قناة ميكروفلويديك مع أي (CAD) برامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر.
- PDMS رقاقة تلفيق
- لف رقاقة مع رقائق الألومنيوم لإنشاء حامل.
- خلط (PDMS) قاعدة وكيل علاج وثنائي ميثيل بولي سيلوكسان في 10: 1 نسبة كتلةمع خلاط الطرد المركزي في إطار مهمة خلط وديغا. يصب الخليط PDMS ببطء على الرقاقة على ارتفاع حوالي 5 ملم. ديغا في PDMS في ظل فراغ لمدة 40 دقيقة. علاج PDMS في فرن عند 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- بعناية قشر بلاطة PDMS قبالة الرئيسية وتقليم PDMS على طول القنوات حتى يصبح حجم شريحة زجاجية. لكمة PDMS مع خزعة لكمة 1 ملم لإنشاء مداخل ومنافذ الجهاز.
- تنظيف السطح PDMS مع الهواء المضغوط وشريط لاصق لإزالة الغبار والحطام PDMS.
- وضع بلاطة PDMS، مع الجانب القناة متجهة لأعلى، إلى نظافة البلازما. وضع شريحة زجاجية نظيفة في نظافة البلازما جنبا إلى جنب مع بلاطة PDMS.
- علاج PDMS وشريحة زجاجية تحت البلازما الجوية على مستوى RF عالية لمدة 1 دقيقة. ربط PDMS لشريحة زجاجية لإنشاء الرابطة التساهمية لا رجعة فيه.
- وضع رقاقة PDMS على طبق ساخن على 150 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لتعزيز قوة الترابط وإعادة hydrophobicity من PDMS قبل الاستخدام.
2. بذر رقاقة ميكروفلويديك مع الخلايا الظهارية البريتوني الابتدائية (HPMCs)
- طلاء الفيبرونكتين من القنوات ميكروفلويديك
- تعقيم قناة ميكروفلويديك مع 30 ميكرولتر من 75٪ من الإيثانول. إزالة الإيثانول وشطف مرتين مع 30 ميكرولتر من تعقيمها الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) باستخدام طرف ماصة. تماما نضح برنامج تلفزيوني في القنوات.
ملاحظة: للحد من التلوث، وينبغي إجراء ثقافة الخلية ميكروفلويديك بعناية تحت ظروف معقمة تماما من خلال استخدام غطاء تدفق الصفحي. - إعداد / مل من محلول 10 ميكروغرام فبرونيكتين في المصل خالية M199: MCDB105 (1: 1) متوسطة. ماصة الحل صعودا وهبوطا، مع عناية خاصة لتجنب تشكيل فقاعة. لا الدوامة.
- ملء ببطء كل قناة مع 30 ميكرولتر من محلول فبرونيكتين. اغلاق قنوات مع الشريط واحتضان الشريحة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- تعقيم قناة ميكروفلويديك مع 30 ميكرولتر من 75٪ من الإيثانول. إزالة الإيثانول وشطف مرتين مع 30 ميكرولتر من تعقيمها الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) باستخدام طرف ماصة. تماما نضح برنامج تلفزيوني في القنوات.
- HPMCs الثقافة في 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) الثقافة المتوسطة (M199: MCDB105 تستكمل مع FBS 10٪ و 100 U / مل البنسلين / الستربتومايسين) أقل من 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية حتى 80٪ التقاء.
- شطف HPMCs مع 3 مل من برنامج تلفزيوني ويعرض للتريبسين مع 2 مل من 0.05٪ التربسين / 0.01٪ EDTA (TE) حل لمدة 30 ثانية. تحييد مع 4 مل من 10٪ مستنبت FBS وتدور أسفل الخلايا في 1000 x ج لمدة 5 دقائق.
- Resuspend وHPMCs في 2 مل من 10٪ مستنبت FBS. حساب عدد الخلايا مع عدادة الكريات وضبط تركيز خلية إلى 3.5 × 10 6 / مل.
- تدفئة رقاقة ميكروفلويديك المغلفة فبرونيكتين في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل الاستخدام. تماما نضح الحل فبرونيكتين.
- ببطء ماصة 30 ميكرولتر من تعليق HPMC في كل قناة. اغلاق قنوات مع الشريط ووضع الأجهزة في حاضنة CO 2 بين عشية وضحاها.
"jove_title"> 3. المبيض تشكيل السرطان الجسم الشبه الكروي المشارك والثقافة
- تشكيل كروي سرطان المبيض
- الحفاظ على الظهارية خط البشري الخلايا السرطانية في المبيض سكوف-3 في 5٪ FBS الثقافة المتوسطة (M199: MCDB105 مع 5٪ FBS و 100 U / مل البنسلين / الستربتومايسين) أقل من 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية قبل التجارب.
- حل 0.5٪ الاغاروز في الماء المعقم بالغليان. الاستغناء عن 50 ميكرولتر من محلول الاغاروز في كل بئر من لوحات 96-جيدا. ترك لوحات في غطاء محرك السيارة لمدة 20 دقيقة للسماح للالاغاروز ليصلب. الاغاروز طدت طلاء يمكن أن الآبار منع التصاق الخلايا ويشير إلى أن لوحات جاهزة للاستخدام.
- شطف الخلايا سكوف-3 مع 3 مل من برنامج تلفزيوني. يعرض للتريبسين مع 2 مل من محلول TE لمدة 3 دقائق. تحييد مع 4 مل من 5٪ مستنبت FBS وتدور أسفل الخلايا في 1000 x ج لمدة 5 دقائق.
- حساب عدد الخلايا سكوف-3 مع عدادة الكريات و resuspend الخلايا في 5٪ FBS مستنبت في مناطق ذات كثافة من 5000 خلية / مل. آرansfer 200 ميكرولتر من تعليق خلية في كل الاغاروز المغلفة جيدا والثقافة تحت 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
- سرطان كروي تحميل
- نقل الكروية السرطان إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل قبل مبلل مع 1 مل من المصل خالية المتوسطة وتدور باستمرار في 750 x ج لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: قبل المبللة-نصائح ماصة، ويمكن أن أنابيب الطرد المركزي يمنع مرفق كروي غير مرغوب فيها على أنابيب الطرد المركزي. - إعداد 2.5 ميكروغرام / مل من 5 chloromethylfluorescein ثنائي الأسيتات (CMFDA) حل في المصل خالية M199: متوسطة MCDB105. و resuspend الكروية سرطان في 1 مل من محلول CMFDA واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي في 750 x ج لمدة 5 دقائق.
- شطف الكروية السرطان مع 2 مل من المتوسط وأجهزة الطرد المركزي المصل خالية في 750 x ج لمدة 5 دقائق. كرر هذه الخطوة مرتين لإزالة صبغة الفلورسنت المتبقية من المتوسط.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ إشارة الفلورسنت في الكروية لأكثر من 96 ساعة. - Resuspend والسرطانالكروية في المصل خالية M199: متوسطة MCDB105 و يحصون عدد كروي مع عدادة الكريات. ضبط تركيز إلى 2000 الكروية / مل مع المصل خالية المتوسطة.
- قبل كروي تحميل، ببطء ضخ 100 ميكرولتر من المصل خالية M199: MCDB105 المتوسطة ليغسل خلايا غير الالتزام الظهارية داخل القنوات.
ملاحظة: حقن سريع، والطموح، أو تشكيل فقاعة سوف يؤدي إلى انفصال أحادي الطبقة الظهارية. - تحميل 30 ميكرولتر من الفلورسنت وصفت تعليق كروي في كل قناة. وضع رقاقة ميكروفلويديك في حاضنة CO 2.
- نقل الكروية السرطان إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل قبل مبلل مع 1 مل من المصل خالية المتوسطة وتدور باستمرار في 750 x ج لمدة 5 دقائق.
- التجمع منصة نضح وثقافة مشتركة
- نعلق حقنة محملة M199 جديدة، خالية من المصل: MCDB105 المتوسطة إلى أنبوب 1 م طويلة.
- وضع الحقنة على ضخ حقنة وتأمين المكبس والجسم من الحقنة. تثبيت ضخ حقنة في وضع أفقي في نفس ارتفاع رقاقة ميكروفلويديك داخل الحاضنة.
NOTE: عدد وحجم الحقن تعتمد على عدد من القنوات المستخدمة ومدة التجربة. - يبث بسرعة الأنبوب كله مع المتوسطة عن طريق الضغط والضغط على زر التقديم السريع حتى امتدت المتوسطة الأنبوب.
- تشغيل حقن بمعدل تدفق المرجوة. تقدير الجهد على جدار القص باستخدام المعادلة التالية:
حيث يمثل τ الضغط جدار القص داخل الغرفة، Ǫ = معدل التدفق، μ = اللزوجة (0.01 ز سم -1)؛ ارتفاع الغرفة ح = التدفق، وث = تدفق عرض الغرفة. - توصيل الأنابيب إلى مدخل القناة. وضع أنابيب مدخل الزائدة في الحاضنة لضمان المتوسطة وارتفعت درجة حرارة قبل حقنه في القنوات. لتسهيل الاتصال بين الأنابيب والقنوات، وصلات مناسبة ويمكن اختيار. ملاحظة: حذار عدم إدخال أي فقاعة على syrinشركة جنرال الكتريك، وأنابيب، والاتصالات.
- قم بتوصيل منفذ للقناة إلى أنبوب مخروطي 50 مل لجمع المتوسطة تدفق مع أنبوب الانتاج قصيرة.
ملاحظة: يظهر نظام المشاركة في الثقافة الديناميكي الكامل في الشكل 1D.
4. مراقبة من HPMCs والسرطان الأجسام الشبه الكروية بعد الإرواء
- مراقبة HPMCs والكروية السرطان مع مشرق الميدان أو المجهر مضان والتقاط الصور بعد 1 ساعة من نضح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام هذا البروتوكول، تم إنشاء منصة ميكروفلويديك تصل إلى نموذج الكروية سرطان المبيض مع الخلايا الظهارية في ظل ظروف الهيدروديناميكية. كان المثقف الخلايا الظهارية البريتوني الإنسان الأساسية في microdevice لمدة 16 ساعة، ولاحظ تحت المجهر مشرق الميدان. كما هو مبين في الشكل 2A، وتمت تغطية قاع القناة بنجاح مع أحادي الطبقة من HPMCs. من المهم أن نلاحظ أن تشكيل فقاعة خلال فبرونيكتين أو HPMC الزخرفة سوف يؤدي إلى فشل قناة الطلاء. من خلال ثقافة تعليق غير ملتصقة، الكروية المتعددة الخلايا بأقطار من حوالي 100 ميكرون، والتي تشبه في حجمها لتلك الموجودة في استسقاء المرضى، وإنشاء والمسمى مع صبغة الفلورسنت الأخضر، CMFDA. ثم تم نقل الكروية إلى قنوات ميكروفلويديك المغلفة HPMC وبقي في تعليق. وقد لوحظت الأشكال التضاريسية الخلايا تحت المجهر وتم القبض على الصور (الشكل 2B). الأجسام الشبه الكروية سرطان الفلورسنت ذات العلامات يمكن التمييز بسهولة من الخلايا الظهارية تحت المجهر مضان (الشكل 2C).
الشكل 1. دينامية 3D البريتوني Microdevice للنمذجة سرطان المبيض متعددة الخلايا الجسم الشبه الكروي السلوكيات. (A) رسم تخطيطي لرقاقة ميكروفلويديك المستخدمة للمشاركة في الثقافة الكروية سرطان المبيض مع HPMCs تحت ظروف التدفق. (ب) رسم تخطيطي يظهر تصميم قنوات الموائع الدقيقة. (C) صورة لشريحة ميكروفلويديك المستخدمة في بروتوكول، مع قنواتها التي غرست مع محلول الصبغة لرؤية واضحة. شريط = 1 سم. (D) صورة تبين الإعداد التجريبية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر سو هذا الرقم.
الشكل 2. صور من خلية سرطان المبيض كروي-الظهارية الحيوي المشارك الثقافة النموذجي. (أ) صورة أحادي الطبقة HPMC تزرع في قناة ميكروفلويديك. (ب) صور الكروية سرطان المبيض في قناة ميكروفلويديك المغلفة مع الخلايا الظهارية البريتوني تحت المجهر النقيض من المرحلة (اللوحة اليسرى) أو (C) مضان المجهر (الأخضر، CMFDA، اللوحة اليمنى). بار = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يقدم هذا الاختبار نموذجا مرنا وذات الصلة من الناحية الفسيولوجية التي يمكن أن تدمج مع مختلف فحوصات الكيمياء الحيوية وخلية القاعدة، بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، فحوصات التصاق، المقايسات التخليص الظهارية، وفحص المخدرات. ويمكن أن يطبق على تقييم تأثير المكروية داخل الصفاق على تطور السرطان. ومع ذلك، قد تحتاج عدة ظروف تجريبية ليكون الأمثل، وهذا يتوقف على أهداف المشروع (على سبيل المثال، وعدد من HPMCs والكروية سرطان المصنف لكل قناة، وهي المرة ثقافة مشتركة، وما إلى ذلك). أنواع الخلايا الأخرى في المكروية داخل الصفاق، مثل الخلايا الليفية والخلايا البطانية، أو الخلايا المناعية، ويمكن أيضا أن يدرج في النظام من أجل دراسة التفاعلات الأساسية بين الكروية سرطان المبيض والخلايا المجاورة. مكونات ECM أخرى، مثل laminin، vitronectin، أو الكولاجين، ويمكن أيضا أن تستخدم. ضعف واحدة من هذا البروتوكول التي قد تحتاج إلى النظر فيها هو أنه في حين أناقتران ربلنيشينغ المغذيات وإجهاد القص تذكر أن ينظر في الجسم الحي، ليست هناك سيطرة منفصلة من ربلنيشينغ المغذيات وإجهاد القص في نظامنا الحالي. وعلاوة على ذلك، ستكون هناك حاجة إلى تقنيات مثل trypsinization على رقاقة جنبا إلى جنب مع مضان تنشيط الخلايا الفرز لجمع منفصل خلايا سرطان المبيض وHPMCs لمزيد من الدراسات الجزيئية حول أنواع مختلفة من الخلايا.
هذه التقنية يسلك العديد من المزايا بالمقارنة مع الطرق التقليدية. أولا، 3D يقلد شارك في ثقافة أفضل في الجسم الحي الاتصالات بين الخلايا بين خلايا سرطان المبيض وخلايا الظهارية. ثانيا، الخلايا المستزرعة تحت تدفق فلويديك ولكنها ليست في حالة ثابتة، وتوليد استجابة الخلوية التي يحتمل أن تكون ممثلة في الجسم الحي حالة 12، 13. وعلاوة على ذلك، فإن تدفق السوائل يمكن أن تسيطر على وجه التحديد، ومحاكاة hydrodynamiشروط ج في مراحل مختلفة من تطور الورم.
وباختصار، فإن سرطان ميسوثيليوم نموذج 3D دينامية المبيض شارك في ثقافة المعروضة هنا يوفر إطارا مرنا للسلوك النمذجة ورم في التجويف البريتوني. مع هذا النموذج، والتفاعل بين الخلايا السرطانية والخلايا الظهارية في ظل حالة الهيدروديناميكية ديناميكية يمكن تحليل شامل. ويمكن أن تقدم إلى حد كبير فهمنا للآليات الكامنة وراء تطور المنتشر، وربما أيضا تسهيل التنمية العلاجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل مجلس هونج كونج منحة بحثية (منح 17122014، C1013-15G، 719813E، و17304514). AST ونغ هو المستفيد من Croucher كبار زمالة أبحاث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafer | University wafer | #1196 | 100 mm |
| SU-8 2075 photoresist | Microchem | ||
| SU-8 developer | Microchem | 108-65-6 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 1673921 | Polydimethylsiloxane (PDMS) + curing agent kit |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31AA | 1 mm diameter |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Polyethylene tubing | SCI | BB31695-PE/5 | 0.86 mm (inner diameter) |
| Syringe | Terumo | ||
| Syringe pump | Longer precision pump | LSP01-2A | |
| Medium 199 | Invitrogen | 31100-035 | Add 2.2 g/L sodium bicarbonate |
| MCDB 105 Medium | Sigma | M6395 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30068.02 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Trypsin EDTA solution | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin - 0.01% EDTA, phenol red |
| Fibronectin human | BD | 354008 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| 5-chloromethylfluorescein diacetate | Life technologies | C7025 | Green CMFDA |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-18AIC | |
| Centrifuge | Hitachi | CT15RE | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Model: 80i or ECLIPSE Ti; software: SPOT | |
| SKOV-3 | Gift from Dr. N Auersperg (University of British Columbia) |
References
- Jemal, A., et al. Global cancer statistics. CA: Cancer J. Clin. 61, 69-90 (2011).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Chau, W. K., Ip, C. K., Mak, A. S., Lai, H. C., Wong, A. S. c-Kit mediates chemoresistance and tumor-initiating capacity of ovarian cancer cells through activation of Wnt/beta-catenin-ATP-binding cassette G2 signaling. Oncogene. 32, 2767-2781 (2013).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).
- Tang, M. K. S., Zhou, H. Y., Yam, J. W. P., Wong, A. S. T. c-Met overexpression contributes to the acquired apoptotic resistance of nonadherent ovarian cancer cells through a cross talk mediated by phosphatidylinositol 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase 1/2. Neoplasia. 12, 128-144 (2010).
- Ksiazek, K., et al. Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin. Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).
- Hafter, R., Klaubert, W., Gollwitzer, R., Vonhugo, R., Graeff, H. Crosslinked Fibrin Derivatives and Fibronectin in Ascitic Fluid from Patients with Ovarian-Cancer Compared to Ascitic Fluid in Liver-Cirrhosis. Thromb Res. 35, 53-64 (1984).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307, 58-62 (2005).
- Chang, S. F., et al. Tumor cell cycle arrest induced by shear stress: Roles of integrins and Smad. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 3927-3932 (2008).
- Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator. Trends Cell Biol. 17, 44-50 (2007).
- Rizvi, I., et al. Flow induces epithelial-mesenchymal transition, cellular heterogeneity and biomarker modulation in 3D ovarian cancer nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, E1974-E1983 (2013).
- Ip, C. K., et al. Stemness and chemoresistance in epithelial ovarian carcinoma cells under shear stress. Sci. Rep. 6, 26788 (2016).
- Avraham-Chakim, L., et al. Fluid-flow induced wall shear stress and epithelial ovarian cancer peritoneal spreading. PloS one. 8, e60965 (2013).
- Burkhalter, R. J., et al. Peritoneal mechanobiology and metastatic success in epithelial ovarian cancer. Faseb Journal. 26, (2012).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Botta, G. P., Manley, P., Miller, S., Lelkes, P. I. Real-time assessment of three-dimensional cell aggregation in rotating wall vessel bioreactors in vitro. Nat. Protoc. 1, 2116-2127 (2006).
- Ismadi, M. Z., et al. Flow characterization of a spinner flask for induced pluripotent stem cell culture application. PloS one. 9, e106493 (2014).
- Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PloS one. 9. 9, e89966 (2014).
