Summary
Para estudar a progressão do tumor do ovário num modelo fisiologicamente relevante, esferóides multicelulares foram cultivadas num microdispositivo sob fluxo de fluido simulado. Este modelo 3D dinâmica emula o ambiente intraperitoneal com os componentes celulares e mecânicas onde ocorre a metástase do cancro do ovário.
Abstract
O câncer de ovário é caracterizada por extensa metástase peritoneal, com esferas de tumor comumente encontrados nas ascite maligna. Isto é associado com resultados clínicos pobres e carece actualmente de um tratamento eficaz. Tanto o ambiente tridimensional (3D) e as forças mecânicas dinâmicas são factores muito importantes nesta cascata metastática. No entanto, culturas de células tradicionais não conseguem recapitular esse microambiente do tumor natural. Assim, os modelos in vivo -como que pode emular o ambiente intraperitoneal são de importância óbvia. Neste estudo, uma nova plataforma de microfluidos do peritoneu foi criado para simular a situação de esferóides de cancro do ovário na cavidade peritoneal durante a metástase. esferóides de cancro do ovário gerados sob uma condição não-aderentes foram cultivadas em canais microfluidicos revestidas com células mesoteliais peritoneais submetidas a uma tensão de cisalhamento fisiologicamente relevante. Em resumo, este mic câncer de ovário mesotélio 3D dinâmicaplataforma rofluidic pode proporcionar novos conhecimentos sobre a biologia básica do câncer e servir como uma plataforma para o potencial de despistagem de drogas e desenvolvimento.
Introduction
O câncer de ovário é o câncer ginecológico mais letal e é caracterizada pela disseminação peritoneal generalizada e a formação de ascite maligna 1. Esta extensa metástase peritoneal representa um grande desafio clínico e está associado com resultados clínicos pobres. Ao contrário da maioria carcinomas sólidos que metastatizam através do sangue, cancro do ovário divulga primariamente dentro da cavidade peritoneal. As células tumorais existir como agregados multicelulares / esferóides durante o processo de metástase 2. O facto de a cultura em suspensão pode enriquecer cancro de células estaminais /-iniciação do tumor dos ovários sugere ainda que estes esferóides podem estar associados tanto com a agressividade do tumor e reforçada quimiorresistência 3, 4. Existem diferenças na resposta à droga entre 2D e 3D culturas, o que presumivelmente têm mecanismos moleculares diferentes 5.
_content "> A interacção essencial com o mesotélio constrói o microambiente primária para a progressão do tumor do ovário. Estas células mesoteliais encontram-se em uma matriz extracelular (ECM), onde a fibronectina é um constituinte ubíqua. A ligação entre a expressão aumentada de fibronectina derivada de células de mesotélio e a progressão do tumor foi demonstrada. a fibronectina é abundantemente presentes em ascite maligna 6, 7. células de cancro do ovário são também capazes de induzir a secreção de fibronectina a partir de células mesoteliais, a fim de promover o início de metástases do cancro do ovário 8.Emergentes evidência mostra que estímulos mecânicos, incluindo tensão de cisalhamento, pode modular a morfologia celular, a expressão do gene, e, por isso, os fenótipos de células tumorais 9, 10, 11. Como ascite maligna desenvolver e acumulam-se durante tumor progressão, as células do tumor dos ovários são expostos ao fluxo de fluido e a tensão de corte resultante. Uma série de grupos, o nosso incluídos, têm demonstrado o impacto da tensão de cisalhamento na progressão do câncer de ovário, incluindo modificações do citoesqueleto, transições epitelial-a-mesenquimal e stemness câncer de 12, 13, 14, 15. Assim, um microambiente fisiologicamente relevante é importante para a investigação de metástase de tumor peritoneal. No entanto, correntes in vitro sistemas de cultura hidrodinâmicos têm limitações no que imita e controlar uma constante, baixa, o stress fisiologicamente relevante de corte 16, 17, 18, 19. In vitro convencional aproxima-se de focagem em ambos o ambiente celular ou mecânica ainda são limitadas emimitando a complexidade do microambiente intraperitoneal com relevância fisiológica adequada.
Aqui, a fim de engendrar um novo modelo do peritoneu para ultrapassar as limitações das estratégias convencionais e para avançar no estudo do compartimento intraperitoneal na metástase do cancro, uma plataforma de microfluidos à base de 3D com o fluxo de fluido controlado foi concebido. Neste modelo, os esferóides de cancro do ovário foram co-cultivadas com células peritoneais humanas primárias mesoteliais em chips de microfluidos sob fluxo contínuo de fluidos (Figura 1A). As células mesoteliais foram plaqueadas em fibronectina. Não aderentes esferóides de cancro do ovário foram semeadas em canais de microfluidos com meio de fluxo contínuo perfundidos por uma bomba de seringa. Tanto o ambiente 3D e as forças mecânicas dinâmicas são factores muito importantes da cascata metastática. Esta plataforma pode ser usado para investigar o microambiente intraperitoneal em termos de cel complexolular ea co-cultura interacções, bem como no que diz respeito a estímulos mecânicos dinâmicos.
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Protocol
1. Projeto de dispositivos microfluídicos e Fabricação
- Design Master microfluídico
- Concepção e desenhar o padrão de canal microfluídico com qualquer software de desenho assistido por computador (CAD).
NOTA: Normalmente, o desenho CAD pode ser enviado para uma empresa fotomáscara para produzir a foto-mascara. O design de microfluidos consiste em três canais paralelos idênticos, cada um com as seguintes dimensões: 4 mm x 25 mm x 250 m (largura x comprimento x altura) e ajustou 2 mm entre si. Ambas as extremidades de canal foram concebidos com ângulos 127 ° para facilitar a entrada e saída de líquido (Figura 1B). O canal utilizado neste protocolo foi relatado em publicação anterior 13. - Lava-se a pastilha de silício com ultra-sons (500 W / 42 kHz) em acetona, isopropanol, e água desionizada durante 15 min cada. Seca-se a pastilha com azoto gasoso pressurizado. Aquece-se a pastilha de silício sobre uma placa quente a 250 ° C durante 15 minutos para secar completamenteisto.
- Spin-coat uma camada de SU-8 2075 fotorresiste (125 um de espessura) sobre a bolacha de silício com uma velocidade de rotação de 1.800 rpm. Cozer a bolacha revestidos por foto-resistente directamente sobre uma placa quente a 65 ° C e, em seguida, a 95 ° C, para remover o excesso de solvente, durante 5 e 25 min, respectivamente (de acordo com o manual do produto SU-8).
- Repita o passo 3 e spin-coat outra camada de SU-8 2075 fotorresiste para obter uma espessura final de 250 m. Asse o wafer foto-resistente revestida de directamente sobre uma placa quente a 65 ° C durante 7 minutos e depois a 95 ° C durante 30 min. Se arrefecer lentamente a bolacha para a temperatura ambiente. Não arrefecer com ar pressurizado.
- Alinhar a foto-mascara e colocar directamente no topo da bolacha. Exponha à luz UV por 20 s para reticular o padrão.
- Asse o wafer foto-resistente com o a 65 ° C e 95 ° C numa placa de aquecimento durante 5 e 12 min, respectivamente, para remover o solvente para a polimerização (de acordo com o manual do produto SU-8). Depois, resfriar o wafer detemperatura do quarto.
- Remover o material fotosensitivo não reticulado por imersão a bolacha em SU-8 programador durante 25 min. Lavar o wafer com isopropanol e seque-o com ar sob pressão.
NOTA: Se uma solução leitosa foi observado quando a lavagem com isopropanol, indicando desenvolvimento incompleto, mergulhe o wafer de volta para SU-8 desenvolvedor para um tempo de desenvolvimento mais tempo. - Coloque a bolacha sobre uma placa quente a 180 ° C durante 10 minutos para curar o padrão de potenciais fendas. Desligue a placa quente e lentamente arrefecer a bolacha à temperatura ambiente, deixando-o sobre a placa quente.
- Adicionar algumas gotas de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perf lúor-octilo) silano em um frasco de tampa. Coloque a tampa do frasco no exsicador de vácuo. Coloque a bolacha ao lado da tampa do frasco para silanizar a bolacha durante 10 min.
- Concepção e desenhar o padrão de canal microfluídico com qualquer software de desenho assistido por computador (CAD).
- PDMS fabricação de chips
- Enrole o wafer com folha de alumínio para criar um suporte.
- Misture a base de polidimetilsiloxano (PDMS) e agente de cura a uma proporção de 10: 1 massacom um misturador centrífugo sob a função de mistura e Degas. Verter a mistura de PDMS lentamente sobre a bolacha de uma altura de cerca de 5 mm. Desgasificar o PDMS, sob vácuo, durante 40 min. Curar o PDMS numa estufa a 65 ° C durante 2 h.
- Retire cuidadosamente a laje PDMS fora do mestre e aparar o PDMS ao longo dos canais até que seja o tamanho de uma lamela de vidro. Perfurar o PDMS com um perfurador de biópsia de 1 mm para criar as entradas e saídas do dispositivo.
- Limpe a superfície de PDMS com ar pressurizado e fita adesiva para remover a poeira e PDMS detritos.
- Colocar a placa de PDMS, com o lado do canal para cima, para um produto de limpeza de plasma. Coloque uma lâmina de vidro limpa para o limpador de plasma ao lado da laje de PDMS.
- Trate os PDMS e lâmina de vidro sob plasma do ar em alto nível RF durante 1 min. Vincular os PDMS para a lâmina de vidro para criar uma ligação covalente irreversível.
- Colocar o chip PDMS em uma placa quente a 150 ° C durante 1 h para aumentar a força de ligação e para retornar o hydrophobicity do PDMS antes da utilização.
2. Semeando o chip microfluídico com células mesoteliais peritoneal primário (HPMC)
- Fibronectina revestimento de canais de microfluidos
- Esteriliza-se o canal microfluídico com 30 ul de etanol a 75%. Remover o etanol e lavar duas vezes com 30 ul de solução salina tamponada com fosfato esterilizada (PBS) utilizando uma ponta de pipeta. Absolutamente aspirar PBS nos canais.
NOTA: Para minimizar a contaminação, a cultura de células de microfluidos deve ser cuidadosamente conduzida sob condições totalmente assépticas, através da utilização de uma câmara de fluxo laminar. - Prepara-se uma solução de 10 ug / ml de fibronectina em M199 isento de soro: MCDB105 (1: 1) meio. Pipeta a solução cima e para baixo, com cuidado especial para evitar a formação de bolhas. não vortex.
- Lentamente encher-se cada canal com 30 mL de solução de fibronectina. Selar os canais com fita adesiva e incuba-se o chip durante a noite a 4 ° C.
- Esteriliza-se o canal microfluídico com 30 ul de etanol a 75%. Remover o etanol e lavar duas vezes com 30 ul de solução salina tamponada com fosfato esterilizada (PBS) utilizando uma ponta de pipeta. Absolutamente aspirar PBS nos canais.
- HPMCs de cultura no meio de cultura a 10% de soro fetal de bovino (FBS) (M199: MCDB105 suplementado com FBS a 10% e 100 U / mL de penicilina / estreptomicina), sob 5% de CO2 a 37 ° C até 80% de confluência.
- Lavar os HPMCs com 3 ml de PBS e trypsinize com 2 mL de tripsina a 0,05% / EDTA a 0,01% solução (TE) durante 30 s. Neutralizar com 4 mL de meio de cultura FBS a 10% e girar para baixo as células a 1000 xg durante 5 min.
- Ressuspender as HPMC em 2 ml de meio de cultura FBS a 10%. Contar o número de células com um hemocitómetro e ajustar a concentração de células de 3,5 x 10 6 / mL.
- Aquecer o chip de microfluidos revestidos por fibronectina em uma incubadora a 37 ° C durante 5 min antes da utilização. Completamente aspirar a solução de fibronectina.
- Lentamente pipeta 30 ul de suspensão de HPMC em cada canal. Selar os canais com fita e colocar os dispositivos na incubadora de CO 2 durante a noite.
- formação esferóide câncer de ovário
- Manter a linha celular epitelial humana do cancro do ovário SKOV-3 em 5% de meio de cultura FBS (M199: MCDB105 com FBS a 5% e 100 U / mL de penicilina / estreptomicina), sob 5% de CO2 a 37 ° C antes das experiências.
- Dissolve-se 0,5% de agarose em água esterilizada por fervura. Pipetar 50 ul de solução de agarose em cada poço de placas de 96 poços. Deixar as placas em o capuz durante 20 min para permitir que a agarose solidificar; agarose solidificar o revestimento dos poços pode impedir a adesão de células e indica que as placas estão prontas para utilização.
- Lavar as células SKOV-3 com 3 ml de PBS. Tripsinizar com 2 ml de solução TE durante 3 min. Neutralizar com 4 mL de meio de cultura FBS a 5% e girar para baixo as células a 1000 xg durante 5 min.
- Contar o número de células SKOV-3 com um hemocitómetro e ressuspender as células em 5% de meio de cultura FBS a uma densidade de 5000 células / ml. Transfer 200 uL de suspensão celular em cada um de agarose-revestido e assim a cultura sob 5% de CO2 a 37 ° C durante 48 h.
- Carregando esferóide câncer
- Transferir esferóides cancerosas para um tubo de centrífuga de 50 ml pré-humedecido com 1 ml de meio isento de soro e girar a 750 xg durante 5 min.
NOTA: Pré-molhada pontas de pipetas e tubos de centrífuga pode impedir a fixação esferóide indesejada sobre os tubos de centrifugação. - Prepare 2,5 mg / mL de solução 5-chloromethylfluorescein diacetato (CMFDA) em isento de soro M199: medium MCDB105. Ressuspender esferóides cancerosas em 1 ml de solução CMFDA e incubar a 37 ° C durante 30 min. Centrifugar a 750 xg durante 5 min.
- Lavar os esferóides cancerosas com 2 ml de meio isento de soro e centrifugar a 750 xg durante 5 min. Repetir este passo duas vezes para remover o corante fluorescente restante a partir do meio.
NOTA: O sinal fluorescente pode ser retida em esferóides durante mais de 96 h. - Ressuspender o cânceresferóides em isento de soro M199: meio MCDB105 e contar o número esferóide com um hemocitômetro. Ajustar a concentração para 2.000 esferóides / mL com meio isento de soro.
- Antes do carregamento esferóides, lentamente injectar 100 ul de isento de soro M199: meio MCDB105 para lavar as células não-aderente de mesotélio no interior dos canais.
NOTA: A injecção rápida, a aspiração ou a formação de bolhas irá conduzir ao desprendimento da monocamada mesotelial. - Carga 30 uL de suspensão esferóide marcado com fluorescência em cada canal. Colocar o chip de microfluidos para a incubadora de CO 2.
- Transferir esferóides cancerosas para um tubo de centrífuga de 50 ml pré-humedecido com 1 ml de meio isento de soro e girar a 750 xg durante 5 min.
- conjunto de plataforma de perfusão e co-cultura
- Anexar uma seringa carregada com M199 fresco, livre de soro: MCDB105 meio a um tubo de 1 m de comprimento.
- Colocar a seringa sobre a bomba de seringa e fixar o êmbolo e o corpo da seringa. Instalar a bomba de seringa na posição horizontal na mesma altura que o chip de microfluidos dentro da incubadora.
NOTA: O número e tamanho de seringas dependerão do número de canais utilizados e a duração da experiência. - Rapidamente infundir o tubo inteiro com meio ao pressionar e segurar o botão de avanço rápido até o meio transborda a tubulação.
- Executar a injecção a uma taxa de fluxo desejada. Estimar a tensão de cisalhamento utilizando a seguinte equação:
onde τ representa o estresse da parede de corte no interior da câmara, ǫ = caudal, μ = viscosidade (0,01 g cm-1); altura câmara h = fluxo, e a largura da câmara w = fluxo. - Ligue o tubo para a entrada do canal. Colocar o excesso de tubagem de admissão na incubadora para assegurar que o meio é aquecido antes de injectada nos canais. Para facilitar a ligação entre o tubo e o canal, conectores apropriados podem ser escolhidos. NOTA: Tenha cuidado para não introduzir qualquer bolha para o Syringe, tubos e conexões.
- Ligue a saída do canal para um tubo cónico de 50 mL, para recolher o meio de saída, com um tubo de saída curta.
NOTA: O sistema de co-cultura dinâmica completa é mostrado na Figura 1D.
4. Observação de HPMC e Câncer Spheroids após a perfusão
- Observe as HPMC e esferóides de câncer com um campo brilhante ou microscópio de fluorescência e tirar fotos após 1 h de perfusão.
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Representative Results
Usando este protocolo, uma plataforma microfluídica foi criada para modelar esferóides cancro do ovário com células mesoteliais em condições hidrodinâmicas. células mesoteliais peritoneais humanas primárias foram cultivadas na microdispositivo durante 16 horas e observadas sob um microscópio de campo brilhante. Como mostrado na Figura 2A, a parte inferior de canal com sucesso foi coberto com uma monocamada de HPMC. É importante notar que a formação de bolhas durante a fibronectina ou HPMC padronização vai levar ao fracasso revestimento canal. Por meio de cultura em suspensão não-aderente, esferóides multicelulares com diâmetros de cerca de 100 um, que são semelhantes em tamanho aos encontrados em ascites de doentes, foram geradas e marcadas com corante fluorescente verde, CMFDA. Os esferóides foram então transferidas para os canais de microfluidos de HPMC revestidas e manteve-se em suspensão. Morfologias celulares foram observadas ao microscópio e as imagens foram capturadas (Figura 2B). Os esferóides de cancro fluorescentes-marcado pode ser facilmente diferenciadas das células mesoteliais sob um microscópio de fluorescência (Figura 2C).
Figura 1. Um dinâmico 3D Peritoneal microdispositivos para a modelagem do cancro do ovário multicelulares Spheroid Comportamentos. (A) Representação esquemática de um chip de microfluidos utilizado para co-cultura esferóides cancro do ovário com HPMC sob condição de escoamento. (B) Diagrama esquemático mostrando a concepção dos canais de microfluidos. (C) Fotografia de um chip microfluídico utilizado no protocolo, com os seus canais com infusão de solução de corante para visualização clara. Barra = 1 cm. (D) Fotografia que mostra a configuração experimental. Por favor clique aqui para ver uma versão maior oesta figura f.
Figura 2. Imagens do celular do cancro do ovário Spheroid-mesotelial dinâmico modelo de co-cultura. (A) Imagem da monocamada HPMC crescido no canal microfluídico. (B) Imagens de esferóides de câncer de ovário no canal microfluídico revestido com células mesoteliais peritoneais sob microscopia de contraste de fase (painel da esquerda) ou (C) microscopia de fluorescência (Green, CMFDA; painel da direita). Barra = 100 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este ensaio oferece um modelo flexível e fisiologicamente relevante que podem ser incorporados com vários ensaios bioquímicos e à base de células, incluindo, mas não se limitando a, ensaios de adesão, testes de eliminação mesoteliais, e o rastreio de drogas. Ele pode ser aplicado para a avaliação do efeito do microambiente intraperitoneal na progressão do cancro. No entanto, várias condições experimentais pode necessitar de ser optimizado, dependendo dos objectivos do projecto (por exemplo, o número de HPMC e esferóides cancerosas semeadas por canal, o tempo de co-cultura, etc.). Outros tipos de células no microambiente intraperitoneal, tais como fibroblastos, células endoteliais, ou células do sistema imunológico, também pode ser incluído no sistema, a fim de estudar as interacções entre essenciais esferóides de cancro do ovário e células vizinhas. Outros componentes da matriz extracelular, tais como laminina, vitronectina, colagénio, ou, também podem ser usados. Uma fraqueza deste protocolo que podem precisar de ser considerado é que, enquanto oacoplamento de reposição de nutrientes e tensão de cisalhamento é uma reminiscência do que a observada in vivo, não há nenhum controle separado de reposição de nutrientes e tensão de cisalhamento em nosso sistema atual. Além disso, técnicas tais como a tripsinização on-chip combinada com separação de células activada por fluorescência será necessário para recolher separadamente células de cancro do ovário e HPMC para estudos moleculares sobre diferentes tipos de células.
Esta técnica apresenta diversas vantagens quando comparado com as abordagens tradicionais. Em primeiro lugar, 3D co-cultura melhor imita a comunicação intercelular in vivo entre as células de cancro do ovário e células mesoteliais. Em segundo lugar, as células são cultivadas sob fluxo de fluidos, mas não estão em condições estáticas, a geração de uma resposta celular que é, potencialmente, representativo da situação in vivo 12, 13. Além disso, o fluxo de fluido pode ser controlado com precisão, imitando o hydrodynamic condições em diferentes fases da progressão tumoral.
Em resumo, o modelo de co-cultura dinâmica 3D do cancro do ovário-mesotélio aqui apresentada fornece uma estrutura flexível para o comportamento do tumor modelagem na cavidade peritoneal. Com este modelo, a interação entre células cancerosas e células mesoteliais sob uma condição hidrodinâmica dinâmica pode ser exaustivamente analisados. Ele pode avançar muito a nossa compreensão dos mecanismos subjacentes da progressão metastática e também pode facilitar o desenvolvimento terapêutico.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por Hong Kong Research Conselho Grant (subsídios 17.122.014, C1013-15G, 719813E, e 17.304.514). AST Wong é um receptor da Croucher Senior Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafer | University wafer | #1196 | 100 mm |
| SU-8 2075 photoresist | Microchem | ||
| SU-8 developer | Microchem | 108-65-6 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 1673921 | Polydimethylsiloxane (PDMS) + curing agent kit |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31AA | 1 mm diameter |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Polyethylene tubing | SCI | BB31695-PE/5 | 0.86 mm (inner diameter) |
| Syringe | Terumo | ||
| Syringe pump | Longer precision pump | LSP01-2A | |
| Medium 199 | Invitrogen | 31100-035 | Add 2.2 g/L sodium bicarbonate |
| MCDB 105 Medium | Sigma | M6395 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30068.02 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Trypsin EDTA solution | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin - 0.01% EDTA, phenol red |
| Fibronectin human | BD | 354008 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| 5-chloromethylfluorescein diacetate | Life technologies | C7025 | Green CMFDA |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-18AIC | |
| Centrifuge | Hitachi | CT15RE | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Model: 80i or ECLIPSE Ti; software: SPOT | |
| SKOV-3 | Gift from Dr. N Auersperg (University of British Columbia) |
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