Dissection, MicroCT Scanning en Morfometrische Analyses van de Baculum

Summary

Vele biologische structuren ontbreken gemakkelijk definieerbare bezienswaardigheden, waardoor het moeilijk is om de moderne morfometrische methoden toe te passen. Hier tonen we methoden om de muis baculum (een bot in de penis), waaronder dissectie en microCT scannen, gevolgd door computationele werkwijzen semi-monumenten die worden gebruikt om de grootte en vorm kwantificeren variatie definiëren bestuderen.

Abstract

Modern morfometrie biedt krachtige methoden om de grootte en vorm variatie kwantificeren. Een eerste vereiste is een lijst van coördinaten die mijlpalen te definiëren; maar dergelijke coördinaten moeten homologe structuren vertegenwoordigen in specimens. Hoewel veel biologische objecten bestaan ​​uit gemakkelijk te herkennen oriëntatiepunten tot de veronderstelling van homologie te voldoen, veel ontberen dergelijke structuren. Een mogelijke oplossing is om plaats semi-oriëntatiepunten mathematisch op een object dat dezelfde morfologische regio over exemplaren vertegenwoordigen. Hier illustreren we een recent ontwikkelde pijpleiding naar semi-oriëntatiepunten van de muis baculum (penis bot) mathematisch te definiëren. De methoden van toepassing worden op uiteenlopende voorwerpen.

Introduction

Het gebied van morfometrie bevat diverse methoden om de grootte en vorm van de biologische vorm, een fundamentele stap in wetenschappelijk onderzoek ^{1, 2, 3, 4, 5, 6} kwantificeren. Traditioneel is de statistische analyse van de grootte en vorm begint door het identificeren oriëntatiepunten op een biologische structuur, en vervolgens meten van lineaire afstanden, hoeken en verhoudingen, die in een multivariate kader kunnen worden geanalyseerd. -Landmark gebaseerde Geometric Morfologie is een aanpak die de ruimtelijke positie van monumenten behouden, behoud van geometrische gegevens uit het verzamelen van gegevens door middel van analyse en visualisatie ^5. Gegeneraliseerde Procrustes Analyse (GPA) kan worden toegepast om de variatie in de locatie, omvang, en de rotatie van bezienswaardigheden verwijderen om een ​​afstemming tussen specimens dat m producereninimizes hun kwadraat verschillen - wat overblijft is vorm verschil ^7.

Een belangrijk concept van elke morfometrische analyse homologie, of het idee dat men een betrouwbare oriëntatiepunten die biologisch zinvolle en discrete functies die overeenkomen tussen exemplaren of structuren kunnen identificeren. Bijvoorbeeld, menselijke schedels hebben homologe processen foramina, hechtingen, en leidingen die kunnen toelaten morfometrische analyses. Helaas, de identificatie van overeenkomstige plekken die moeilijk in veel biologische structuren, vooral die met gladde oppervlakken of bochten ^{8, 9, 10.}

We benaderen dit probleem hieronder met behulp van computationele geometrie. De algemene werkstroom is een driedimensionale scan van het object dat kan worden voorgesteld als een puntenwolk genereren en draai transformeren dat puntenwolk zodat alle specimens zijn gericht op een gemeenschappelijk coördinatensysteem. Toen we mathematisch definiëren semi-oriëntatiepunten van specifieke regio's van het object. Discrete semi-oriëntatiepunten geplaatst op deze regio's zijn biologisch arbitrair ^11. Het uitvoeren van GPA en de daaropvolgende statistische analyses kan ongewenste artefacten produceren ^{8, 12} omdat willekeurig geplaatst oriëntatiepunten niet biologisch homoloog kan zijn. Daarom laten we deze semi-oriëntatiepunten om mathematisch "slide". Deze procedure minimaliseert het potentiaalverschil tussen de structuren. Zoals elders voerden de schuivende algoritme hier gebruikt dient soortgelijke anatomische gebieden die niet gemakkelijk te kwantificeren die overeenkomt oriëntatiepunten ^{3, 6, 8, 10, 11, 12.} Deze methoden hebben hun limitations ^13, maar moet worden aangepast aan voorwerpen van verschillende grootte en vorm.

Hier tonen we hoe deze methode in een recente studie van de muis baculum ¹⁴ werd toegepast, een bot in de penis die is opgedaan en meerdere onafhankelijke keren verloren tijdens de evolutie van zoogdieren ^15. We bespreken de dissectie en de voorbereiding van een specifiek bot, de baculum (Protocol 1), het genereren van microCT beelden (Protocol 2), en de omzetting van deze beelden naar een formaat dat alle downstream computationele geometrie maakt (Protocollen 3 en 4). Na deze stappen, wordt elk monster vertegenwoordigd door ~ 100K xyz-coördinaten. We dan lopen door een reeks van veranderingen die effectief alle exemplaren in een gemeenschappelijke oriëntatie (Protocol 5) af te stemmen, hier semi-oriëntatiepunten van uitgelijnde exemplaren (Protocol 6). Protocollen 1-4 moet ongeacht het object dat wordt onderzocht gelijk zijn. Protocol 5 en 6 Protocol zijn specifiek ontworpen voor een baculum, maar het is onze hoop dat door detaillering deze stappen, kunnen de onderzoekers voorstellen wijzigingen die relevant zijn voor hun doel van belang zou zijn. Zo werden modificaties van deze methoden toegepast op walvissen bekken en ribben ¹⁶ te bestuderen.

Protocol

Alle procedures en personeel werd goedgekeurd door de University of Southern California Institute for Animal Care en gebruik Comite (IACUC), protocol # 11394.

1. Baculum Dissection en voorbereiding

1. Euthanaseren een geslachtsrijpe mannelijke muis via koolstofdioxide overmatige blootstelling, volgens de protocollen uiteengezet door de relevante Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC).
2. Leg het dier in rugligging, en rekken de penis door het toepassen van druk met de duimen lateraal van de preputiale opening.
3. Zodra de penis is langdurig, uitbreiding van het weefsel door de voorhuid zoveel mogelijk.
4. Met een schaar, knip de penis lichaam proximaal van de eikel waar de baculum woont.
5. Breng de ontleed penis naar een 1,7 ml buis en voeg 200 pi water uit de kraan. Zorg ervoor dat de penis volledig is ondergedompeld in de vloeistof.
6. Incubeer het weefsel in water bij -50 ° C gedurende 3-5 dagen.
7. Plaats de ontleed baculum in een nieuwe microcentrifugebuis met de kap open. Verlof kap open O / N te drogen bot.

2. MicroCT Scannen

1. Druk op een microCT scan cilindrische houder in een baksteen van bloemist schuim om een ​​cilinder van bloemist schuim te creëren.
2. Pak de cilinder van de bloemist schuim en snijd plakjes ~ 2-5 cm dik.
3. Druk gedroogd bacula in de oasis, rond de omtrek van een segment om interferentie te minimaliseren tijdens het scannen. De precieze oriëntatie van de botten moet worden opgemerkt, waardoor een goede identificatie van individuele exemplaren in Protocol 4.
4. Plaats voorzichtig het schijfje met de embedded botten in de microCT houder.
5. Acquire microCT scans. Bij muis Bacula ¹⁴

3. MicroCT Processing: Het omzetten van een .DCM Stack voor een interne .xyz File

OPMERKING: Elke microCT scan levert een stapel .DCM, of 'DICOM', bestanden die het plakken genomen door het object te vertegenwoordigen. Alle stroomafwaartse computationele geometrie vereist vlakke .xyz bestanden, die eenvoudig een tekstbestand vier kolommen bevat - de x, y en z coördinaten van elke pixel en de intensiteit van de pixel, van -5000 (zwart) tot 5000 (wit). Een pixel drempel 3000 het algemeen goed functioneert als een drempelwaarde voor het definiëren botten.

1. Installeer Python (www.python.org) en de PYTHON modules COMMANDS, DICOM, PYLAB, SYS, en numpy.
2. Open "01_process_dicom.py "{} Figshare met elke tekstverwerker. Onder de sectie Variabelen, verandering pad, pixel drempels, en directory namen als dat nodig is.
3. Run "python 01_process_dicom.py". De vooruitgang zal worden afgedrukt op het scherm. Binnen elke map met de naam in stap 3.2, wordt een nieuw bestand gemaakt met de naam; bijvoorbeeld directory_name.PT3000.xyz wanneer PT3000 geeft de pixel drempel die in stap 3,2.

4. MicroCT verwerking: segmenteren-out Individuele Specimen .xyz Files

1. Installeer R (https://www.r-project.org/) met de bibliotheek RGL.
2. Open het bestand '02_segment_dicoms.r' {} Figshare met elke tekstverwerker. Onder de sectie Variabelen, wijzigt de naam van het pad te wijzen op de .xyz bestand gemaakt in Protocol 3 hierboven.
3. Vanuit R, voert u de opdracht 'source (' 02_segment_dicoms.r ') "(zonder de aanhalingstekens).
4. Na de drie dimensionale afbeelding van de .xyz bestand gemaakt in Protocol 3 verschijnt, voert de number van specimens in de totale .xyz bestand. labelen dan en selecteer de punten van elk monster met behulp van de scroll en zoomfuncties.
   LET OP: Op de achtergrond, aparte .xyz bestanden worden gemaakt voor elk specimen. Deze worden in een directory genaamd bijvoorbeeld XYZ_FILES_PT3000 wanneer PT3000 geeft de drempelwaarde voor pixels gebruikt.

5. "uitlijnen" Specimen .xyz bestanden naar Common Coördinaten.

1. Open de Python-script "03_transform.py" {Figshare}, waarin de extra module mattdean_modules.py {Figshare}, evenals twee op zichzelf staande applicaties vereist: "rotate_translate_cylindrical" (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) en "qconvex" (www.qhull.org/html/qconvex.htm) die worden gebruikt door dit script.
2. Onder de sectie Variabelen, identificeren van de volledige namen pad naar mattdean_modules.py, rotate_path en qconvex_dir. Daarnaast identificeren het volledige pad naar de directory met de individuele .xyz bestanden die zijn gemaakt in stap 4.
3. Run 03_transform.py, die een nieuw bestand per exemplaar met het achtervoegsel .TRANSFORMED.xyz creëert.

6. "Snijden" Aligned Specimen .xyz bestanden naar Semi-oriëntatiepunten te identificeren.

1. Open en voer het Python-script "04_identify_landmarks.py" {Figshare}. In de sectie Variabelen identificeren volledige namen pad naar de map met de .TRANSFORMED.xyz bestanden. Dit script identificeert 802 semi-monumenten die kan worden gebruikt om de grootte en vorm van de structuur te kwantificeren.

Representative Results

De xyz coördinaten van het semi-oriëntatiepunten geproduceerd in Protocol 6 kunnen direct worden geïmporteerd in any-monument op basis geometrische morfometrie analyse ^17. De computationele pijplijn hierboven is toegepast voor muis- bacula ^14, en walvissen bekken en ribben ¹⁶ bestuderen. Meer details over de rekenkundige bepaling van semi-plaatsen worden hier voorgesteld in een poging om onderzoekers visualiseren stappen die kunnen worden gemodificeerd om hun eigen object of interest tegemoet. De baculum bevat een aantal unieke eigenschappen die werden uitgebuit om bepaalde transformaties te automatiseren. Bijvoorbeeld na rekenkundig snijden het bot in twee helften langs een proximaal-distale as, identificeerden we de proximale helft eenvoudig door het vergelijken van het aantal punten (het proximale meer). Zolang er bestaan ​​unieke kenmerken, zoals deze, zou onze methoden aanpasbaar aan elke wordenvoorwerp. Daarnaast moet worden benadrukt dat we empirisch bepaald bepaalde drempels, zoals "10% proximale" die goed gepresteerd in onze baculum studies, maar zeker moeten worden herbeoordeeld voor andere objecten.

Vanaf Protocol 5, hoe het eerste stap is de convex omhulsel (het kleinste aantal punten dat alle andere punten in een monster bevat) aan de twee punten die het verst uit elkaar identificeren berekenen. Deze twee punten (rode bolletjes, figuur 1C) beginnen een nieuwe z-as (rode lijn, figuur 1C) die loopt proximaal-distale door het bot te definiëren. Bij de baculum, wordt helft van de puntenwolk die meer punten bevat gedefinieerd als het proximale uiteinde.

Ten tweede wordt het gehele puntenwolk omgezet, zodat het proximale punt neemt de x, y, z-coördinaten van 0,0,0 en de distale punt tvlokken op het x, y, z-coördinaten van 0,0, + z, waarbij z + positieve waarde afhankelijk van de grootte van het bot. Aan het eind van deze stap, een z-as gaat door de lengte van het bot. Voor onderstaande procedures, zal de lengte van minimale tot maximale z-coördinaten worden genoemd Zlength.

Ten derde, om te corrigeren voor variaties in verband met de exacte positie van de proximale en distale punten boven geïdentificeerde, de 10% proximale en 10% meest distale punten worden afzonderlijk bemonsterd (figuur 1D), hun respectieve zwaartepunten geïdentificeerd (rode gebieden figuur 1E) en de puntenwolk getransformeerd zodat het proximale zwaartepunt is 0,0,0, en het distale zwaartepunt is 0,0, + z, een nieuwe z-as die door het midden van het monster passeert (rode lijn figuur 1E) .

Ten vierde wordt de puntenwolk geroteerd rond de z-as door eerst de slice punten in de proximale 15-15,25% Zlength van de structuur (blauwe punten, figuur 1E). Dit stukje van de punten wordt afgevlakt in de z-dimensie (ie z-coördinaten worden gewoon genegeerd), de bolle romp genomen, en de minimale begrenzende rechthoek (de kleinste rechthoek die alle andere punten bevat) berekend. Stel je een lijn die de middens van de twee korte zijden van deze minimale begrenzende rechthoek. We draaien de puntenwolk totdat deze twee middelpunten geworden -x, 0, + z en + x, 0, + z, respectievelijk, waardoor deze lijn wordt een nieuwe x-as. Na transformatie, de afstand tussen de maximale en minimale x-waarden worden aangeduid als Xlength. Een nieuw bestand wordt gemaakt op basis van specimen.xyz naar specimen.TRANSFORMED.xyz.

Ten vijfde, punten binnen 1% Xlength van de z-as worden gesneden uit (blauwe punten, figuur 1F), en de meest proximale en meest distale punt geïdentificeerd uit deze centrale slijs en gelabeld distale en proximale respectievelijk. Dit zijn de eerste twee semi-oriëntatiepunten geïdentificeerd.

Zesde, 50 gelijkmatig verdeeld plakjes punten bemonsterd langs de z-as (rode punten, figuur 1G). Elk segment is een dikte van 1% Zlength. Elk segment wordt dan afgevlakt in de z-dimensie, en gelijk verdeeld door 7 verticale lijnen (rode lijnen, Figuur 1H). Punten binnen 2% Xlength van elke lijn worden gehouden (rood punten, figuur 1H), dan de punten met de maximale en minimale y-coördinaat worden gehouden, geprojecteerd op elke respectievelijke lijn, en gelabeld ventrale en rug-, respectievelijk. Bovendien, labels bevatten slice nummer en het lijnnummer, bijvoorbeeld P15_VENTRAL4 is het ventrale punt bemonsterd uit de 4 ^e verticale lijn van de 15 ^e slice. Belangrijker elk punt gelabeld bijvoorbeeld P15_VENTRAL4, treedt slechts éénmaal voor alle monsters, behoud Correspondence. Naast de ventrale en dorsale van elke van de 7 lijnen (14 semi-oriëntatiepunten totaal), worden de punten met maximale en minimale x-waarde bemonsterd en gemerkt links en rechts, respectievelijk. De y en z-coördinaten van links en rechts afgevlakt met behulp van de lowess functie R. Voor de baculum, een totaal van 16 semi-oriëntatiepunten zijn gedefinieerd per slice (rode bollen, figuur 1H); met 50 plakken plus de proximale en distale semi-oriëntatiepunten hierboven gedefinieerd, zijn 802 semi-oriëntatiepunten bemonsterd per monster (groene bolletjes, figuur 1I). Alle andere punten uit het oorspronkelijke microCT scan worden verwijderd.

Opgemerkt wordt dat hoewel ventrale / dorsale en proximale / distale polariteit mathematisch bepaald, zijn alle specimen alignementen visueel bevestigd handmatig aangepast zoals vereist. In ons monster van 369 bacula ongeveer 10 moest handmatig worden aangepast.

Figuur 1: visuele weergave van de Computational Workflow (Protocol 4-6). (A) Een screenshot van de 02_segment_dicoms.r script (protocol 4), die de toewijzing van afzonderlijke puntenwolken individuele exemplaren. (B) vergrote weergave van een baculum, vertegenwoordigd door een wolk van ~ 100K xyz punten. (C) Identificatie van de twee punten verst van elkaar (rode bolletjes), gebruikt om een nieuwe z-as die loopt proximaal-distale door het bot (rode lijn) definiëren. (D) Bemonstering de meest proximale 10% en meest distale 10% punten (rode punten) een middel om te corrigeren voor kleine variatie in de exacte plaatsing van de z-as. (E) De hartlijnen van de meest proximale 10% en meest distale 10% (rode bolletjes) worden gebruikt om een nieuwe z-as (rode lijn) definiëren. Vervolgens werd een stuk punten die tussen 15,00-15,25% van deze nieuwe z-as (blauwe vlekken) wordt verstaan ​​de minimale begrenzende rechthoek wordt. De puntenwolk wordt geroteerd totdat de lange zijde van de minimale begrenzende rechthoek evenwijdig is aan een nieuwe x-as. F) een segment van punten langs de middellijn (blauwe punten) wordt bemonsterd en de meest proximale en meest distale gedefinieerd als een semi-landmark. G) 50 gelijkmatig verdeeld plakjes punten worden bemonsterd (rode punten), met H) toont een dergelijke slice. 16 punten (rode cirkels) vastgesteld om de omtrek van elk segment te vangen. I) Als herhaald voor alle segmenten, in totaal 802 semi-oriëntatiepunten (groene bolletjes) definiëren de structuur en worden gebruikt in alle downstream morfometrische toepassingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De kritische stappen in het bovenstaande protocol zijn: 1) het ontleden van de bacula, 2) het verzamelen van de microCT beelden, 3) het omzetten van de microCT uitvoer naar een plat bestand van xyz coördinaten, 4) het segmenteren uit elk monster's puntenwolk, 5) het transformeren van elk monster aan een gestandaardiseerd assenstelsel, en 6) die semi-oriëntatiepunten. Deze stappen worden gemakkelijk aangepast om verschillende objecten tegemoet.

Deze werkwijzen kunnen waarschijnlijk worden toegepast op elk object dat in essentie "staafvormig", of althans niet zo gebogen. Objecten die krommerug zichzelf om "U-vormige" momenteel niet worden geanalyseerd omdat snijden (figuur 1G) punten zou terugkeren uit verschillende delen van het object. Dergelijke voorwerpen kunnen in de toekomst worden opgevangen door computationeel rechttrekken het object voorafgaand aan het snijden.

We hebben een algemene methode voor het mathematisch definiëren semi-oriëntatiepunten gepresenteerd vanuit vormen die s missenolid bezienswaardigheden. Deze algemene werkwijzen zijn aangepast aan de evolutie van walvissen bekken en ribben ^16, die zeer verschillende vormen hebben bestuderen. Onze computationele methoden voor het definiëren van mijlpalen moeten gelden voor elke serie xyz coördinaten zijn. We gebruikten hier microCT scannen, gezien de geringe omvang van de muis Bacula ^14. Voor grotere botten, zoals de walvis bekken en ribben, gebruikten we een laserscanner dat het oppervlak van de botten ¹⁶ gereconstrueerd. Het is belangrijk om visueel alle sets van semi-oriëntatiepunten om de kwaliteit van de werkwijze te controleren. Het belangrijkste voordeel van onze rekenmethoden is ze nauwkeurig de grootte en vorm kwantificeren variatie en bewaren van de correspondentie tussen afzonderlijke gebieden van het object.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting scissors	VWR	470106-338	Most sizes should work
Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved	VWR	82027-406
1.7 mL microcentrifuge tube	VWR	87003-294
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	CAS 64-17-5	To be diluted to 70% for dissections
Floral Foam	Wholesale Floral	6002-48-07
uCT50 scanner	Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland