Dissezione, microCT scansione e morfometriche analisi del Baculum

Summary

Molte strutture biologiche mancano punti di riferimento facilmente definibili, il che rende difficile applicare moderni metodi morfometrici. Qui illustriamo metodi per studiare la baculum mouse (un osso nel pene), compresa la dissezione e la scansione microCT, seguita da metodi computazionali per definire semirimorchi punti di riferimento che sono usati per quantificare dimensione e forma variazione.

Abstract

morfometria moderni fornisce potenti metodi per quantificare dimensioni e la forma di variazione. Un requisito fondamentale è un elenco di coordinate che definiscono punti di riferimento; tuttavia tali coordinate devono rappresentare strutture omologhe tra i campioni. Mentre molti oggetti biologici costituiti da punti di riferimento facilmente identificabili per soddisfare l'ipotesi di omologia, in molti casi mancano tali strutture. Una possibile soluzione è quella di Matematicamente luogo semi-punti di riferimento su un oggetto che rappresentano la stessa regione morfologica tra i campioni. Qui, illustriamo una pipeline recentemente sviluppato per definire matematicamente semi-punti di riferimento dal mouse baculum (osso del pene). I nostri metodi dovrebbero essere applicabile ad una vasta gamma di oggetti.

Introduction

Il campo di morfometria include una varietà di metodi per quantificare le dimensioni e la forma della forma biologica, un passo fondamentale nella ricerca scientifica ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Tradizionalmente, l'analisi statistica di forma e dimensioni comincia identificando punti di riferimento su una struttura biologica, e poi misurando distanze lineari, angoli e rapporti, che possono essere analizzati in un quadro multivariata. Landmark a base geometrica Morfometria è un approccio che mantiene la posizione spaziale dei punti di riferimento, conservando le informazioni geometriche dalla raccolta dei dati attraverso l'analisi e la visualizzazione ^5. Generalized Analisi Procrustes (AAP) può essere applicato per rimuovere variazione di posizione, scala e rotazione dei punti di riferimento per produrre un allineamento tra esemplari minimizes le loro differenze squadrate - ciò che rimane è la forma dissomiglianza ^7.

Un concetto importante di qualsiasi analisi morfometrica è omologia, o l'idea che si possa identificare in modo affidabile punti di riferimento che rappresentano le caratteristiche biologicamente significativi e discreti che corrispondono tra i campioni o strutture. Ad esempio, teschi umani hanno processi omologhi, forami, suture, e condotti che possono consentire le analisi morfometriche. Purtroppo, l'individuazione dei punti di riferimento corrispondenti è difficile in molte strutture biologiche, in particolare quelli con superfici lisce o curve ^{8, 9, 10.}

Ci avviciniamo a questo problema di seguito utilizzando la geometria computazionale. Il flusso generale è quello di generare tre scansione tridimensionale dell'oggetto che può essere rappresentato come una nuvola di punti, e quindi ruotare e trasformare questa nuvola di punti in modo che tutti specimens sono orientati su un sistema di coordinate comune. Poi abbiamo matematicamente definiamo semi-punti di riferimento provenienti da regioni specifiche dell'oggetto. Discrete semi-punti di riferimento posti su tali regioni sono biologicamente arbitraria ^11. Condurre GPA e successive analisi statistiche in grado di produrre artefatti indesiderabili ^{8, 12} perché monumenti arbitrariamente collocati non possono essere biologicamente omologa. Pertanto, lasciamo che questi semi-punti di riferimento matematicamente "slide". Questa procedura riduce al minimo la differenza di potenziale tra le strutture. Come sostenuto altrove l'algoritmo scorrevole usato qui è opportuno quantificare regioni anatomiche simili, privi facilmente identificati punti di riferimento ^{3, 6, 8, 10, 11, 12} corrispondente. Questi metodi hanno loro limitations ^13, ma dovrebbe essere adattabile ad oggetti di dimensione e forma diversa.

Qui, illustriamo come questo metodo è stato applicato in un recente studio del baculum del mouse ^14, un osso nel pene che è stato guadagnato e perso più volte indipendenti nel corso dell'evoluzione dei mammiferi ^15. Discutiamo la dissezione e la preparazione di un osso specifico, il baculum (protocollo 1), la generazione di immagini microCT (Protocol 2), e la conversione di queste immagini in un formato che consente a tutti geometria computazionale valle (protocolli 3 e 4). Dopo questi passaggi, ogni esemplare è rappresentato da coordinate ~ 100K xyz. Abbiamo poi a piedi attraverso una serie di trasformazioni che si allineano in modo efficace tutti i campioni in un orientamento comune (Protocollo 5), quindi definire semi-punti di riferimento da campioni allineati (Protocollo 6). I protocolli 1-4 dovrebbero essere simili a prescindere dell'oggetto analizzato. Protocollo 5 e il protocollo 6 sono specifically progettato per un baculum, ma è la nostra speranza che, in dettaglio questi passaggi, gli investigatori possono immaginare le modifiche che potrebbero essere rilevanti per il loro oggetto di interesse. Ad esempio, sono state applicate modifiche di questi metodi per studiare balena ossa del bacino e le costole ^16.

Protocol

Tutte le procedure e il personale sono stati approvati dalla University of Southern California Institute per la cura degli animali e del Comitato uso (IACUC), il protocollo # 11394.

1. Baculum dissezione e preparazione

1. Euthanize un topo maschio sessualmente maturo via anidride carbonica sovraesposizione, secondo i protocolli stabiliti dal comitato competente Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC).
2. Posare l'animale in posizione supina, e protrarre le pene facendo pressione con i pollici lateralmente alla apertura del prepuzio.
3. Una volta che il pene è protratto, estendere il tessuto attraverso prepuzio quanto possibile.
4. Con le forbici, tagliare il corpo prossimale del pene di glande in cui risiede il baculum.
5. Trasferire le pene sezionato in una provetta da 1,7 ml e aggiungere acqua di rubinetto 200 l. Assicurarsi che il pene è completamente sommerso nel liquido.
6. Incubare il tessuto in acqua a ~ 50 ° C per 3-5 giorni.
7. Posizionare il baculum sezionato in una nuova provetta con il tappo aperto. Lasciare Cappa di apertura / N per asciugare l'osso.

2. microCT Scansione

1. Premere un supporto cilindrico scansione microCT in un mattone di schiuma fiorista per creare un cilindro di schiuma fioraio.
2. Estrarre il cilindro di schiuma fioraio e tagliare fette ~ spessore di 2-5 cm.
3. Premere bacula essiccati nella schiuma fioraio, intorno alla periferia di una singola porzione di minimizzare le interferenze durante la scansione. L'orientamento preciso delle ossa deve essere osservato che permette per una corretta identificazione dei singoli esemplari nel protocollo 4.
4. Posizionare delicatamente la fetta con le ossa incorporato nel supporto microCT.
5. Acquisire scansioni microCT. Nel caso di topo Bacula ¹⁴

3. Il trattamento microCT: Conversione di un .dcm Pila a un file xyz singolo

NOTA: Ogni scansione microCT produce una pila di .dcm, o "DICOM", file che rappresentano fette di immagini scattate attraverso l'oggetto. Tutta la geometria computazionale a valle richiede file xyz piatte, che è semplicemente un file di testo contenente quattro colonne - i x, y, z e coordinate di ogni pixel, e l'intensità del pixel, che vanno da -5.000 (nero) a 5000 (bianca). Una soglia di pixel superiore a 3.000 generalmente funziona bene come soglia per la definizione delle ossa.

1. Installare Python (www.python.org) ei moduli Python COMANDI, DICOM, PYLAB, SYS, e numpy.
2. Aperto 01_pr "ocess_dicom.py "{} Figshare con qualsiasi editor di testo. Nella sezione Variabili, percorso cambiamento, le soglie di pixel, e nomi di directory, se necessario.
3. Eseguire "python 01_process_dicom.py". Il progresso verrà stampato a schermo. All'interno di ogni directory chiamata al punto 3.2, un nuovo file è reso nominato; per esempio, directory_name.PT3000.xyz, dove PT3000 indica la soglia di pixel indicato nel passaggio 3.2.

4. elaborazione microCT: Segmentazione-out singolo provino xyz Files

1. Installare R (https://www.r-project.org/) con la RGL biblioteca.
2. Aprire il file '02_segment_dicoms.r' {} Figshare con qualsiasi editor di testo. Nella sezione Variabili, cambiare il nome del percorso per puntare al file xyz creato nel precedente protocollo 3.
3. Dall'interno R, eseguire la "fonte ( '02_segment_dicoms.r')" di comando (senza le virgolette).
4. Dopo l'immagine tridimensionale del file xyz creato nel protocollo 3 appare, inserire il numbeR di esemplari nel file generale xyz. Poi etichettare e selezionare i punti da ogni campione utilizzando le funzioni di scorrimento e di zoom.
   NOTA: Sullo sfondo, saranno effettuati i file xyz separati per ogni campione. Questi appaiono in una directory chiamata, ad esempio, XYZ_FILES_PT3000, dove PT3000 indica la soglia di pixel utilizzato.

5. "Allineamento" Specimen xyz File da comuni coordinate.

1. Aprire lo script "03_transform.py" Python {} Figshare, che richiede la mattdean_modules.py modulo aggiuntivo {} Figshare, così come due applicazioni a sé stanti: "rotate_translate_cylindrical" (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) e "qconvex" (www.qhull.org/html/qconvex.htm) che sono utilizzati da questo script.
2. Nella sezione Variabili, identificare i nomi di percorso completo per mattdean_modules.py, rotate_path e qconvex_dir. Inoltre, identificare il percorso completo della directory contenente il .xy individualefile z creato nel passaggio 4.
3. 03_transform.py Run, che crea un nuovo file per ogni campione con il suffisso .TRANSFORMED.xyz.

6. "affettare" campioni Allineati xyz File da identificare Semi-punti di riferimento.

1. Aprire ed eseguire lo script Python "04_identify_landmarks.py" {} Figshare. Nella sezione Variabili, identificare i nomi percorso completo per la directory contenente i file .TRANSFORMED.xyz. Questo script identifica 802 semirimorchi punti di riferimento che possono essere utilizzati per quantificare dimensioni e forma della struttura.

Representative Results

Le coordinate XYZ dei semi-punti di riferimento prodotte nel protocollo 6 possono essere importati direttamente in qualsiasi morfometria geometrica analisi punto di riferimento basata su ^17. La conduttura di calcolo di cui sopra è stato applicato per studiare topo bacula ^14, nonché pelvico balena e costole ^16. Maggiori dettagli sulla definizione di calcolo di semi-punti di riferimento sono presentati qui, nel tentativo di aiutare i ricercatori a visualizzare passaggi che potrebbero essere modificati per accogliere la loro particolare oggetto di interesse. Il baculum contiene diverse caratteristiche uniche che sono state sfruttate per automatizzare certe trasformazioni. Ad esempio, dopo computazionalmente tagliando l'osso in due metà lungo un asse prossimale-distale, abbiamo identificato metà prossimale semplicemente confrontando il numero totale di punti (prossimale ha più). Finché esistono caratteristiche uniche come questa, i nostri metodi dovrebbero essere adattabili a qualsiasioggetto. Inoltre, va sottolineato che empiricamente determinati determinate soglie, come "10% prossimale" che ha eseguito bene nei nostri studi Baculum, ma certamente devono essere riesaminati per altri oggetti.

A partire dal protocollo 5, il primo passo di calcolo è calcolare convesso (il più piccolo insieme di punti che contiene tutti gli altri punti in un campione) identificare i due punti che sono più distanti l'uno dall'altro. Questi due punti (sfere rosse, Figura 1C) iniziano a definire un nuovo asse z (linea rossa, Figura 1C) che si avvia prossimale-distale attraverso l'osso. Nel caso del baculum, la metà della nuvola di punti che contiene più punti è definita come l'estremità prossimale.

In secondo luogo, l'intera nuvola di punti viene trasformata in modo che il punto prossimale assume il x, y, z coordinate 0,0,0 e punto t distalefiocchi di x, y, z coordinate 0,0, + z, dove z + è un certo valore positivo dipende dalle dimensioni dell'osso. Al termine di questa fase, un asse z attraversa la lunghezza dell'osso. Per le procedure seguenti, la lunghezza dalla minima alla massima coordinate z verrà indicato come Zlength.

In terzo luogo, per correggere la varianza associata con l'esatto posizionamento delle prossimale e distale punti sopra individuate, il 10% più prossimale e il 10% punti più distali vengono campionati separatamente (Figura 1D), i rispettivi baricentri identificato (sfere rosse, Figura 1E) e la nuvola di punti trasforma tale che il baricentro prossimale è 0,0,0, e il centroide distale è 0,0, z +, con un nuovo asse z che passa attraverso il centro del provino (linea rossa, Figura 1E) .

In quarto luogo, la nuvola di punti viene ruotato attorno all'asse z prendendo un slice dei punti nel prossimale 15 al 15,25% Zlength della struttura (punti blu, Figura 1E). Questa fetta di punti è appiattito nella dimensione z (cioè z-coordinate sono semplicemente ignorati), convesso preso, e l'MBR (il più piccolo rettangolo che contiene tutti gli altri punti) calcolato. Immaginate una linea che collega i punti medi dei due lati corti di questo rettangolo minimo. Ruotiamo la nuvola di punti fino a quando questi due punti medi diventano -x, 0, + Z e + x, 0, + Z, rispettivamente, in tal modo questa linea diventa un nuovo asse x. Dopo la trasformazione, la distanza tra i valori di x massimi e minimi sono indicati come Xlength. Un nuovo file viene creato da specimen.xyz a specimen.TRANSFORMED.xyz.

In quinto luogo, i punti entro l'1% Xlength del asse z sono tagliati fuori (punti blu, figura 1F), e l'unico punto più prossimale e singolo più distale individuate da questo sl centraleghiaccio ed etichettati distale e prossimale, rispettivamente. Queste sono le prime due semi-punti di riferimento identificati.

Sesto, 50 fette uniformemente distanziate di punti vengono campionati lungo l'asse z (punti rossi, Figura 1G). Ogni sezione è uno spessore di 1% Zlength. Ogni fetta è poi appiattito nella dimensione z, e diviso in parti uguali da 7 linee verticali (linee rosse, figura 1H). Punti entro il 2% Xlength di ogni linea sono conservati (punti rossi, figura 1H), poi i punti con la massima e la minima coordinata y sono tenuti, proiettati su ogni rispettiva linea, ed etichettati rispettivamente ventrale e dorsale,. Inoltre, le etichette contengono il numero sezione e il numero di riga, per esempio P15_VENTRAL4 è il punto ventrale campionata dalla verticale 4 ^th del ¹⁵ slice. È importante sottolineare che ogni punto marcato, per esempio, P15_VENTRAL4, si verifica una sola volta in tutti i campioni, preservando correscorri-. In aggiunta ai punti ventrale e dorsale di ciascuna delle 7 linee (14 semirimorchi punti di riferimento totale), i punti con il massimo e minimo valore x vengono campionati ed etichettati rispettivamente LEFT e RIGHT. Le coordinate Y e Z di destra e sinistra vengono smussate utilizzando la funzione lowess in R. Per la baculum, un totale di 16 semi-punti di riferimento sono definiti per fetta (sfere rosse, figura 1H); con 50 fette più prossimale e semi-punti di riferimento DISTALI sopra definiti, 802 semi-punti di riferimento sono campionati per esemplare (sfere verdi, Figura 1 decies). Tutti gli altri punti dalla scansione microCT originale vengono scartati.

Va notato che sebbene ventrale / dorsale e prossimale / distale polarità stata calcolata matematicamente, tutti gli allineamenti campioni sono stati confermati visivamente e regolati manualmente come richiesto. Nel nostro campione di 369 Bacula, circa il 10 doveva essere regolato manualmente.

Figura 1: Rappresentazione visiva del flusso di lavoro computazionale (Protocollo 4-6). (A) Uno screenshot dallo script 02_segment_dicoms.r (protocollo 4), che mostra l'assegnazione di nuvole di punti distinti ai singoli esemplari. (B) Visualizzazione ingrandita di una baculum, rappresentato da una nuvola di ~ 100K punti xyz. (C) Identificazione delle due punti più distanti gli uni dagli altri (sfere rosse), utilizzata per definire un nuovo z-asse che corre prossimale-distale attraverso l'osso (linea rossa). (D) Campionamento prossimale più a 10% e distale più a 10% di punti (punti rossi) fornisce un mezzo per regolare la leggera variazione nel posizionamento esatto del z. (E) I centroidi delle prossimali più a 10% e distale più a 10% (sfere rosse) sono usati per definire un nuovo asse z (linea rossa). Poi, una fetta di punti compreso tra il 15,00-15,25% di questo nuovo asse Z (punti blu) è preso per calcolare rettangolo minimo. La nuvola di punti viene ruotato finché il lato lungo del rettangolo minimo è parallela ad un nuovo asse x. F) una fetta di punti che corrono lungo la linea mediana (punti blu) viene campionato e prossimale-distale di più e più a punto definito come un semi-punto di riferimento. G) 50 fette uniformemente distanziate di punti vengono campionati (punti rossi), con H) che mostra una tale fetta. 16 punti (cerchi rossi) sono definiti per catturare il contorno di ogni fetta. I) Quando ripetuto in tutte le sezioni, per un totale di 802 semi-i luoghi di interesse (sfere verdi) definire la struttura e vengono utilizzati in tutte le applicazioni morfometriche a valle. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Le fasi critiche nel protocollo di cui sopra sono: 1) la dissezione del Bacula, 2) la raccolta delle immagini microCT, 3) convertire l'uscita microCT di un file flat di coordinate XYZ, 4) la segmentazione fuori nuvola di punti per ogni campione, 5) trasformando ogni campione per un standardizzato sistema di coordinate, e 6) che definisce semi-punti di riferimento. Questi passaggi possono essere facilmente modificati per accogliere oggetti diversi.

Questi metodi possono probabilmente essere applicati a qualsiasi oggetto che è essenzialmente "rod-shaped", o almeno non troppo curvo. Gli oggetti che curva su se stessi per diventare "-u forma" non può essere attualmente analizzata, perché affettare (Figura 1G) sarebbe tornato punti da diverse parti dell'oggetto. Tali oggetti potrebbero essere ospitati in futuro dal punto di vista computazionale raddrizzare l'oggetto prima di affettare.

Abbiamo presentato un metodo generale per la semi-punti di riferimento matematicamente Definizione dalle forme che la mancanza di spunti di riferimento Olid. Questi metodi generali sono stati modificati per studiare l'evoluzione della balena ossa pelviche e costola ^16, che hanno forme molto diverse. I nostri metodi computazionali per punti di riferimento che definiscono devono essere applicabili a qualsiasi serie di coordinate xyz. Abbiamo impiegato scansione microCT qui, viste le ridotte dimensioni del mouse di Bacula ^14. Per ossa più grandi, come gli balena ossa pelviche e costola, abbiamo impiegato uno scanner laser che ricostruisce la superficie delle ossa ^16. È importante ispezionare visivamente tutti i set di semirimorchio punti di riferimento per verificare la qualità del metodo. Il vantaggio principale dei nostri metodi di calcolo è che essi quantificare con precisione le dimensioni e la forma di variazione, e conservano la corrispondenza tra regioni distinte dell'oggetto.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting scissors	VWR	470106-338	Most sizes should work
Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved	VWR	82027-406
1.7 mL microcentrifuge tube	VWR	87003-294
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	CAS 64-17-5	To be diluted to 70% for dissections
Floral Foam	Wholesale Floral	6002-48-07
uCT50 scanner	Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland