Dissecação, digitalização MicroCT e morfométricas Análises do Baculum

Summary

Muitas estruturas biológicas falta marcos facilmente definíveis, o que torna difícil a aplicação de métodos morfométricos modernos. Aqui, ilustramos métodos para estudar o báculo rato (um osso do pénis), incluindo dissecção e digitalização microCT, seguido por métodos computacionais para definir semi-chave que são utilizadas para quantificar a forma e tamanho variação.

Abstract

morfometria modernos fornece métodos poderosos para quantificar o tamanho e forma variação. Um requisito básico é uma lista de coordenadas que definem marcos; no entanto, tais coordenadas devem representar estruturas homólogas em toda espécimes. Enquanto muitos objetos biológicos consistem de marcos facilmente identificadas para satisfazer a hipótese de homologia, muitos não têm tais estruturas. Uma possível solução é matematicamente lugar semi-marcos em um objeto que representam a mesma região morfológica através de espécimes. Aqui, nós ilustrar um gasoduto recentemente desenvolvido para definir matematicamente semi-marcos do rato baculum (osso do pênis). Os nossos métodos deve ser aplicável a uma vasta gama de objectos.

Introduction

O campo de morfometria inclui uma diversidade de métodos para quantificar o tamanho e a forma da forma biológica, uma etapa fundamental na investigação científica ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Tradicionalmente, a análise estatística de tamanho e forma começa pela identificação de pontos de referência em uma estrutura biológica, e depois medir distâncias lineares, ângulos e proporções, que podem ser analisadas num quadro multivariada. -Marco com base geométrica Morfometria é uma abordagem que mantém a posição espacial de pontos, preservando informações geométricas de coleta de dados por meio de análise e visualização ^5. Análise Procrustes Generalizada (GPA) pode ser aplicada para remover a variação na localização, dimensão e rotação dos pontos de referência para produzir um alinhamento entre amostras que a Minimizes suas diferenças ao quadrado - o que resta é a forma dissimilaridade ^7.

Um conceito importante de qualquer análise morfométrica é homologia, ou a ideia de que se pode identificar com segurança marcos representando características biologicamente significativas e discretas que correspondem entre amostras ou estruturas. Por exemplo, crânios humanos têm processos homólogos, forame, suturas, e dutos que podem permitir análises morfométricas. Infelizmente, a identificação de pontos de referência correspondente é difícil em muitas estruturas biológicas, especialmente aqueles com superfícies lisas ou curvas ^{8, 9, 10.}

Nós abordar este problema a seguir utilizando geometria computacional. O fluxo geral é para gerar uma análise tridimensional do objecto que pode ser representada como uma nuvem de pontos, e em seguida rodar e que transformar nuvem de pontos de modo a que todos specimens são orientados em um sistema de coordenadas comum. Então nós definimos matematicamente semi-marcos de regiões específicas do objeto. Discretas semi pontos de referência colocadas em tais regiões são biologicamente arbitrário ^11. Realização GPA e as análises estatísticas subsequentes podem produzir artefatos indesejáveis ^{8, 12,} porque os marcos colocados arbitrariamente pode não ser biologicamente homóloga. Portanto, permitimos que estas meias-marcos para matematicamente "slides". Este procedimento minimiza a diferença de potencial entre as estruturas. Como argumentei o algoritmo de correr aqui utilizada é apropriada para quantificar regiões anatômicas semelhantes faltam facilmente identificados marcos ^{3, 6, 8, 10, 11, 12} correspondente. Esses métodos têm o seu limitations ^13, mas deve ser adaptável para objectos de tamanho e forma diferentes.

Aqui, nós ilustrar como este método foi aplicado em um estudo recente da baculum rato ^14, um osso no pênis que tem sido ganhou e perdeu várias vezes independentes durante a evolução dos mamíferos ^15. Discute-se a dissecção e preparação de um osso específico, o báculo (Protocolo 1), a geração de imagens microCT (protocolo 2), ea conversão destas imagens para um formato que permite que toda a geometria computacional jusante (Protocolos 3 e 4). Após estas etapas, cada amostra é representado por ~ 100K xyz coordenadas. Em seguida, a pé através de uma série de transformações que efetivamente alinhar todas as amostras em uma orientação comum (Protocolo 5), em seguida, definir semi-marcos de espécimes alinhados (Protocolo 6). Protocolos 1-4 deve ser semelhante, independentemente do objeto analisado. O protocolo nº 5 e Protocolo 6 são specamente projetado para um báculo, mas é nossa esperança que, detalhando estes passos, os investigadores podem imaginar modificações que seriam relevantes para o seu objeto de interesse. Por exemplo, foram aplicadas modificações destes métodos para estudar ossos pélvicos baleia e costelas ^16.

Protocol

Todos os procedimentos e pessoal foram aprovados pela universidade do instituto do sul da Califórnia para Animal Care e do Comitê Use (IACUC), protocolo nº 11394.

1. Baculum Dissecção e Preparação

1. Euthanize um rato macho sexualmente maduros através de dióxido de carbono sobre-exposição, de acordo com protocolos estabelecidos pelo Comité pertinente Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC).
2. Coloque o animal em decúbito dorsal, e prolongar o pénis através da aplicação de pressão com os polegares lateralmente à abertura do prepúcio.
3. Uma vez que o pénis é prolongada, alargar o tecido através do prepúcio, tanto quanto possível.
4. Com uma tesoura, corte o proximal do corpo do pénis à glande do pénis onde o baculum reside.
5. Transfira os pénis dissecados para um tubo de 1,7 ml e adicionar 200 mL de água da torneira. Certifique-se de que o pênis está totalmente submersa no líquido.
6. Incubar o tecido em água a ~ 50 ° C durante 3-5 dias.
7. Colocar o báculo dissecados para um novo tubo de microcentrifugação com a tampa aberta. Deixe tampão aberto O / N a secar óssea.

Digitalização 2. MicroCT

1. Pressione um suporte cilíndrico digitalização microCT em um tijolo de espuma de florista para criar um cilindro de espuma de florista.
2. Extraia o cilindro de espuma de florista e cortar fatias ~ 2-5 cm de espessura.
3. Empurrar bacula seca na espuma florista, em torno da periferia de uma fatia individual a minimizar a interferência durante a verificação. A orientação precisa dos ossos deve ser comentou permitindo a identificação adequada das amostras individuais no Protocolo 4.
4. Delicadamente, coloque a fatia com os ossos incorporados no suporte para microCT.
5. Adquirir scans microCT. No caso de bacula rato ¹⁴

3. Processamento MicroCT: Convertendo um Stack .dcm para um arquivo .xyz Individual

NOTA: Cada varredura microCT produz uma pilha de .dcm, ou "DICOM", arquivos que representam fatias de imagem obtidos através do objeto. Toda a geometria computacional jusante requer arquivos .xyz planas, que é simplesmente um arquivo de texto que contém quatro colunas - X, Y e Z coordenadas de cada pixel, e a intensidade do pixel, que vão desde -5000 (preto) para 5000 (branco). Um limiar do pixel acima de 3.000 geralmente funciona bem como um limiar para a definição de ossos.

1. Instalar Python (www.python.org) e os módulos Python COMANDOS, DICOM, Pylab, SYS e Numpy.
2. Open "01_process_dicom.py "{} Figshare com qualquer editor de texto. Na seção Variáveis, caminho de mudança, limites de pixels, e nomes de diretórios, conforme necessário.
3. Execute "01_process_dicom.py python". Progress será impresso para a tela. Dentro de cada diretório nomeado na etapa 3.2, um novo arquivo é chamado; por exemplo, directory_name.PT3000.xyz, onde PT3000 indica o limiar do pixel indicado no passo 3.2.

4. Processamento MicroCT: Segmentando-out individual Specimen .xyz Arquivos

1. Instale R (https://www.r-project.org/) com o RGL biblioteca.
2. Abra o arquivo '02_segment_dicoms.r' {} Figshare com qualquer editor de texto. Na seção Variáveis, mudar o nome do caminho para apontar para o arquivo .xyz criado no Protocolo n.º 3 acima.
3. De dentro R, execute a "fonte ( '02_segment_dicoms.r')" comando (sem as aspas).
4. Após a imagem tridimensional do .xyz criado no Protocolo n.º 3 aparecer, digite o number de espécimes no arquivo geral .xyz. Em seguida, rotular e selecionar os pontos de cada amostra, utilizando as funções de rolagem e zoom.
   NOTA: No fundo, arquivos .xyz separadas será feita para cada espécime. Estes aparecem em um diretório chamado, por exemplo, XYZ_FILES_PT3000, onde PT3000 indica o limite de pixel usado.

5. "Alinhar" Specimen .xyz arquivos para Coordenadas Comum.

1. Abra o script "03_transform.py" Python {Figshare}, que exige a mattdean_modules.py adicional módulo {Figshare}, bem como duas aplicações autónomas: "rotate_translate_cylindrical" (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) e "qconvex" (www.qhull.org/html/qconvex.htm) que são usados ​​por este script.
2. Na seção Variáveis, identificar os nomes caminho completo para mattdean_modules.py, rotate_path e qconvex_dir. Além disso, identificar o caminho completo para o diretório que contém o .xy indivíduoarquivos z criou na etapa 4.
3. 03_transform.py executado, o que cria um novo arquivo por espécime com o sufixo .TRANSFORMED.xyz.

6. "fatiamento" Specimen Alinhados .xyz Arquivos identificar Semi-marcos.

1. Abrir e executar o script Python "04_identify_landmarks.py" {} Figshare. Na seção Variáveis, identificar nomes de caminho completo para o diretório que contém os arquivos .TRANSFORMED.xyz. Este script identifica 802 semi pontos de referência que pode ser usado para quantificar o tamanho e forma da estrutura.

Representative Results

As coordenadas xyz das meias-marcos produzidos no Protocolo 6 pode ser diretamente importado para qualquer morfometria geométrica análise baseada no marco ^17. O oleoduto computacional supra foi aplicado para estudar bacula rato ^14, bem como pélvica baleia e as costelas ^16. Mais detalhes sobre a definição computacional de semi-marcos são apresentados aqui, em uma tentativa de ajudar os pesquisadores a visualizar passos que podem ser modificados para acomodar o seu objeto de interesse particular. O baculum contém várias características únicas que foram exploradas para automatizar certas transformações. Por exemplo, depois de cortar o osso computacionalmente em duas metades ao longo de um eixo proximal-distal, identificou-se a metade proximal simplesmente comparando o número total de pontos (proximal tem mais). Enquanto existem características únicas, como este, os nossos métodos deve ser adaptável a qualquerobjeto. Além disso, deve-se enfatizar que determinada empiricamente determinados limites, como "10% proximal", que teve um bom desempenho em nossos estudos baculum, mas certamente precisa ser reavaliada para outros objetos.

Começando no protocolo 5, o primeiro passo é computacional para calcular o casco convexo (o menor conjunto de pontos que contém todos os outros pontos de amostra) para identificar os dois pontos que se encontram mais afastados um do outro. Estes dois pontos (esferas vermelho, Figura 1C) começam a definir um novo eixo z (linha vermelha, Figura 1C) que corre proximal-distal através do osso. No caso de o báculo, a metade do ponto de nuvem que contém mais pontos é definida como a extremidade proximal.

Em segundo lugar, toda a nuvem de pontos é transformada de modo a que o ponto proximal assume o x, y, z coordenadas de 0,0,0 e o ponto distai tflocos de X, Y, Z do 0,0, + Z, onde Z + é um pouco dependente do tamanho do osso positivo valor. No final deste passo, um eixo z passa através do comprimento do osso. Para os procedimentos abaixo, o comprimento desde o mínimo para coordenadas z máximos será referido como Zlength.

Em terceiro lugar, para corrigir para a variância associada com a colocação exacta dos pontos proximais e distais identificados acima, a 10% mais proximal e 10% de pontos mais distais são recolhidos separadamente (Figura 1D), os seus respectivos centroides identificado (esferas vermelho, Figura 1E) e o ponto de nuvem transformada de tal modo que o centróide é 0,0,0 proximal e distal do centróide é 0,0, + z, com uma nova Z-eixo que passa através do centro da amostra (linha vermelha, Figura 1E) .

Em quarto lugar, a nuvem de pontos é girado em torno do eixo z em primeiro lugar o slicE de pontos na Zlength proximal 15-15,25% da estrutura (pontos azuis, Figura 1E). Esta fatia de pontos é achatado na dimensão z (ou seja, z-coordenadas são simplesmente ignorados), a casca convexa tomada, e o retângulo delimitador mínimo (o menor retângulo que contém todos os outros pontos) calculado. Imagine uma linha que liga os pontos médios dos dois lados curtos deste retângulo de limite mínimo. Nós rodar a nuvem de pontos até que esses dois pontos médios tornar-x, 0, + z e + x, 0, + z, respectivamente, assim, esta linha torna-se um eixo x nova. Após a transformação, a distância entre os valores de x máximas e mínimas são referidos como Xlength. Um novo arquivo é criado a partir specimen.xyz para specimen.TRANSFORMED.xyz.

Em quinto lugar, pontos dentro de 1% Xlength do eixo z são cortados fora (pontos azuis, Figura 1F), e o único mais proximal e distai única mais ponto identificado a partir deste centro SLgelo e rotulados proximal e distal, respectivamente. Estas são as primeiras duas meias-marcos identificados.

Sexta, 50 fatias uniformemente espaçados de pontos são amostrados ao longo do eixo z (pontos vermelhos, Figura 1G). Cada fatia é uma espessura de 1% Zlength. Cada fatia é então achatada na dimensão z, e divididos igualmente por 7 linhas verticais (linhas vermelhas, Figura 1H). Pontos dentro de 2% Xlength de cada linha são mantidos (pontos vermelhos, Figura 1H), então os pontos com o máximo eo mínimo coordenada y são mantidos, projetada em cada linha respectiva, e rotulados ventral e dorsal, respectivamente. Além disso, etiquetas contêm o número fatia e o número da linha, por exemplo P15_VENTRAL4 é o ponto ventral amostrado a partir da linha vertical ^4º da ^15ª fatia. Importante, a cada ponto marcado, por exemplo, P15_VENTRAL4, ocorre uma vez e apenas uma vez em todas as amostras, preservando correspondence. Além dos pontos ventral e dorsal de cada uma das 7 linhas (14 semi-marcos total), os pontos com o máximo eo mínimo de valor x são amostrados e rotulados esquerda e direita, respectivamente. Os yez coordenadas de esquerda e direita são suavizados utilizando a função LOWESS na R. Para o báculo, um total de 16 semi-marcos são definidos por fatia (esferas vermelhas, Figura 1H); com 50 fatias mais proximal e semi-marcos DISTAIS definidos acima, 802 semi-marcos são amostrados por espécime (esferas verdes, Figura 1-I). Todos os outros pontos da verificação microCT original são descartados.

Deve notar-se que, embora ventral / dorsal e proximal polaridade / distal foi determinada matematicamente, todos os alinhamentos espécimes foram visualmente confirmada e ajustada manualmente, conforme necessário. Em nossa amostra de 369 bacula, cerca de 10 teve de ser ajustado manualmente.

Figura 1: Representação Visual do Computacional fluxo de trabalho (Protocolo 4-6). (A) Uma captura de tela do script 02_segment_dicoms.r (Protocolo 4), mostrando a atribuição de diferentes nuvens de pontos para espécimes individuais. (B) vista ampliada de uma baculum, representada por uma nuvem de pontos xyz ~ 100K. (C) Identificação de os dois pontos mais afastados um do outro (esferas vermelhas), utilizada para definir um novo Z-eixo que executa proximal-distal por meio da (linha vermelha) do osso. (D) A amostragem do proximal mais de 10% e mais distai-10% de pontos (pontos vermelhos) proporciona um meio para ajustar a ligeira variação no posicionamento exacto do eixo z. (E) o centróide dos proximais-mais de 10% e mais distal 10% (esferas vermelhas) são utilizadas para definir um novo eixo z (linha vermelha). Em seguida, uma fatia de pontos compreendidos entre 15,00-15,25% deste novo eixo z (pontos azuis) é levado para calcular o retângulo de limite mínimo. O ponto de nuvem é rodado até que o lado comprido do rectângulo de limite mínimo é paralelo a um novo eixo x. F) uma fatia de pontos que funcionam ao longo da linha média (pontos azuis) é amostrado e o mais proximal e distal ponto mais definido como um semi-marco. G) 50 fatias uniformemente espaçados de pontos são amostrados (pontos vermelhos), com H), mostrando uma tal fatia. 16 pontos vermelhos (círculos) são definidos para captar o contorno de cada fatia. I) Quando repetido em todas as fatias, um total de 802 pontos de referência (semi-esferas verdes), definem a estrutura e são usados em todas as aplicações a jusante morfométricas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

As etapas críticas do protocolo acima são: 1) dissecar o bacula, 2) coleta as imagens microCT, 3) converter a saída microCT para um arquivo plano de coordenadas XYZ, 4) segmentar a nuvem de pontos de cada espécime, 5) transformar cada amostra para um padronizado sistema de coordenadas, e 6) que define semi-marcos. Estes passos são facilmente modificado para acomodar diferentes objectos.

Estes métodos podem provavelmente ser aplicado a qualquer objecto que, pelo menos, não é, essencialmente "haste em forma de", ou demasiado curvada. Objetos que curva sobre si mesmas para se tornar "em forma de u" não pode ser actualmente analisados, pois cortando (Figura 1G) retornaria pontos de diferentes partes do objeto. Tais objetos podem ser acomodados no futuro, computacionalmente endireitar o objeto antes de cortar.

Nós apresentamos um método geral para matematicamente definidoras semi-marcos a partir de formas que não possuem smarcos Olid. Estes métodos gerais foram modificados para estudar a evolução de ossos pélvicos e de nervura baleia ^16, que têm formas muito diferentes. Nossos métodos computacionais para marcos que definem deve ser aplicável a qualquer série de coordenadas XYZ. Nós empregamos digitalização microCT aqui, dada a pequena dimensão da bacula rato ^14. Para ossos maiores, tais como os ossos pélvicos e de nervura de baleia, que empregue um scanner a laser que reconstruída a superfície dos ossos ^16. É importante para inspeccionar visualmente todos os conjuntos de semi-marcos para verificar a qualidade do método. A principal vantagem dos nossos métodos computacionais é que eles precisamente quantificar o tamanho ea forma variação, e preservar a correspondência entre regiões distintas do objeto.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting scissors	VWR	470106-338	Most sizes should work
Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved	VWR	82027-406
1.7 mL microcentrifuge tube	VWR	87003-294
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	CAS 64-17-5	To be diluted to 70% for dissections
Floral Foam	Wholesale Floral	6002-48-07
uCT50 scanner	Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland