Summary
Многие биологические структуры испытывают недостаток легко определяемых ориентиров, что делает его трудно применять современные методы морфометрические. Здесь мы проиллюстрируем методы для изучения бакулюм мыши (кость в половом члене), в том числе рассечение и сканирования microCT, а затем вычислительные методы для определения полуприцепы ориентиры, которые используются для количественной оценки размера и формы вариации.
Abstract
Современные морфометрии предоставляет мощные методы для количественного определения размера и формы вариации. Основным требованием является список координат, которые определяют ориентиры; Однако такие координаты должны представлять собой гомологичные структуры по образцов. В то время как многие биологические объекты состоят из легко выявляемых ориентиров для удовлетворения предположение о гомологии, многие из них не таких структур. Одним из возможных решений является математически место полу-ориентиров на объекте, которые представляют один и тот же морфологический область через образцов. Здесь мы проиллюстрируем недавно разработанной трубопровода математически определить полу-ориентиров от мыши бакулюм (пениса кости). Наши методы должны быть применимы к широкому кругу объектов.
Introduction
Поле морфометрии включает в себя разнообразие методов количественной оценки размера и формы биологической формы, фундаментальный шаг в научном исследовании 1, 2, 3, 4, 5, 6. Традиционно, статистический анализ размера и формы начинается с определения ориентиров на биологическую структуру, а затем измерения линейных расстояний, углов и отношения, которые могут быть проанализированы в многомерном рамках. Ориентир на основе геометрической морфометрии является подход , который сохраняет пространственное положение ориентиров, сохранение геометрической информации из систем сбора данных на основе анализа и визуализации 5. Обобщенный анализ Procrustes (GPA) может быть применен, чтобы удалить изменение местоположения, масштаба и вращения ориентиров для получения соответствия между образцами, что мinimizes их квадратов разностей - что остается форма несходство 7.
Важным понятием любого морфологического анализа гомологии, или идея, что можно надежно определить ориентиры, представляющие биологически значимые и дискретные функции, которые соответствуют между образцами или структурами. Например, человеческие черепа имеют гомологичные процессы, отверстий, швов, а также каналы, которые могут позволить морфометрического анализа. К сожалению, определение соответствующих ориентиров сложно во многих биологических структур, особенно тех , с гладкими поверхностями или кривыми 8, 9, 10.
Мы подходим к этой проблеме ниже с использованием вычислительной геометрии. Общая схема работы заключается в создании трехмерного сканирования объекта, который может быть представлен в виде облака точек, а затем повернуть и трансформировать эту облако точек, так что все Specimens ориентированы на общей системе координат. Тогда мы математически определить полу-ориентиры из конкретных областей объекта. Дискретные полуприцепы ориентиры , размещенные на таких регионах , являются биологически произвольный 11. Проведение ГПД и последующего статистического анализа могут привести к нежелательным артефакты 8, 12 , поскольку произвольно расположенные ориентиры не могут быть биологически гомологичны. Таким образом, мы позволяем эти полу-ориентиры математически "слайд". Эта процедура минимизирует разность потенциалов между структурами. Как было сказано в другом месте скользящий алгоритм , используемый здесь уместно дать количественную оценку подобных анатомических областей , лишенные легко определить соответствующие ориентиры 3, 6, 8, 10, 11, 12. Эти методы имеют свои Limitations 13, но они должны быть адаптированы к объектам различного размера и формы.
Здесь мы покажем , как этот метод был применен в недавнем исследовании бакулюм 14 мыши, кость в половом члене , которые были получены и потеряли несколько независимых раз в процессе эволюции млекопитающих 15. Мы обсуждаем Вскрытие и подготовка конкретной кости, бакулюм (Протокол 1), генерация microCT изображений (Протокол 2), и преобразование этих изображений в формат, который позволяет все вниз по течению вычислительной геометрии (протоколы 3 и 4). После выполнения этих шагов, каждый образец представлен координатами ~ 100K XYZ. Затем мы пройти через ряд преобразований, которые эффективно выравнивают все образцы в общей ориентации (протокол 5), а затем определить полу-ориентиры из выровненных образцов (протокол 6). Протоколы 1-4 должны быть похожи, независимо от анализируемого объекта. Протокол 5 и Протокол 6 являются спеcifically предназначен для бакулюм, но мы надеемся, что эти шаги подробно, исследователи могут представить себе изменения, которые будут иметь отношение к их интересующего объекта. Например, были применены модификации этих методов для изучения китов тазовые кости и реберные кости 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры и персонал были одобрены университета Института Южной Калифорнии по уходу и использованию животных комитета (IACUC), протокол # 11394.
1. бакулюм Вскрытие и подготовка
- Эвтаназии сексуально зрелого самца мыши с помощью углекислого газа переэкспонирования, в соответствии с протоколами, изложенными в соответствующих институциональных животных по уходу и использованию комитета (IACUC) путем.
- Положите животное в положении лежа на спине, и растягивать пенис, применяя давление с пальцами сбоку от препуциального отверстия.
- После того, как пенис растянуто, продлить ткани через крайней плоти, насколько это возможно.
- С помощью ножниц обрежьте пениса проксимальный тела к головке полового члена, где бакулюм проживает.
- Передача расчлененный пенис в 1,7 мл трубки и добавляют 200 мкл водопроводной воды. Убедитесь, что пенис полностью погружен в жидкость.
- Инкубируйте ткани в воде при температуре ~ 50 ° С в течение 3-5 дней.
- Поместите расчлененный бакулюм в новую пробирку микроцентрифужных с крышкой открытой. Оставьте колпачок открытым O / N, чтобы высохнуть кости.
2. MicroCT Сканирование
- Нажмите на microCT держатель цилиндрического сканирования в кирпич из цветочной пены, чтобы создать цилиндр цветочном пены.
- Извлечь цилиндр цветочном пены и нарезать ломтиками толщиной ~ 2-5 см.
- Нажмите сушеные Bacula в цветочном пены, по периметру отдельного среза, чтобы свести к минимуму помехи во время сканирования. Точная ориентация костей Следует отметить, что позволяет должным образом идентификации отдельных образцов в Протоколе 4.
- Аккуратно поместите кусочек с заделанными костей в держатель microCT.
- Приобретать microCT сканирования. В случае мыши Bacula 14
3. MicroCT обработка: Преобразование .DCM стека к одному .xyz файла
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый microCT сканирования производит стек .DCM, или "DICOM", файлы, которые представляют собой кусочки изображения, сделанные с помощью объекта. Все ниже по течению вычислительной геометрии требует плоских .xyz файлов, что это просто текстовый файл, который содержит четыре столбца - х, у, г координаты каждого пикселя, а интенсивность пикселя, начиная от -5,000 (черный) до +5,000 (белый). Пороговое пикселей выше 3000, как правило хорошо работает в качестве порогового значения для определения костей.
- Установить Python (www.python.org) и питон модули КОМАНДЫ, DICOM, PYLAB, SYS и Numpy.
- Открыть "01_process_dicom.py "{Figshare} с помощью любого текстового редактора. В разделе Переменные, изменение пути, пороговые значения пикселов и имена каталогов по мере необходимости.
- Запуск "питона 01_process_dicom.py". Прогресс будет выведено на экран. В каждом каталоге, указанном в шаге 3.2, новый файл производится по имени; например, directory_name.PT3000.xyz, где PT3000 указывает порог пикселя указано на этапе 3.2.
4. Обработка MicroCT: Сегментирование-индивидуальные Specimen .xyz Файлы
- Установить R (https://www.r-project.org/) с библиотекой RGL.
- Откройте файл '02_segment_dicoms.r' {Figshare} с помощью любого текстового редактора. В разделе Переменные, измените путь, чтобы указать на файл .xyz, созданный в Протоколе 3 выше.
- Изнутри R, запустите команду "источник (" 02_segment_dicoms.r ")" (без двойных кавычек).
- После трехмерного изображения файла .xyz, созданного в Протоколе 3 появляется, введите Numbeг образцов в общем файле .xyz. Затем ярлык и выбрать точки из каждого образца с помощью функции прокрутки и масштабирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: На заднем плане, отдельные .xyz файлы будут сделаны для каждого образца. Они появляются в каталоге с именем, например, XYZ_FILES_PT3000, где PT3000 указывает пороговое значение пикселя используется.
5. "Выравнивание" Образцы .xyz файлов в общей системе координат.
- Откройте Python скрипт "03_transform.py" {Figshare}, что требует дополнительного модуля mattdean_modules.py {Figshare}, а также две самостоятельные приложения стоя: "rotate_translate_cylindrical" (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) и "qconvex" (www.qhull.org/html/qconvex.htm), которые используются этим сценарием.
- В разделе Переменные определить полные имена путей к mattdean_modules.py, rotate_path и qconvex_dir. Кроме того, определить полный путь к каталогу, содержащему индивидуальную .xyZ-файлы, созданные на шаге 4.
- Запуск 03_transform.py, который создает новый файл для каждого образца с суффиксом .TRANSFORMED.xyz.
6. "дележ" Унифицированные образца .xyz Файлы для идентификации Semi-ориентиры.
- Открыть и запустить Python скрипт "04_identify_landmarks.py" {Figshare}. В разделе Переменные определить полные имена пути к каталогу, содержащему файлы .TRANSFORMED.xyz. Этот сценарий идентифицирует 802 полу-ориентиры, которые могут быть использованы для количественного определения размеров и формы конструкции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Хуг координаты полуосей ориентиров , производимых в Протоколе 6 могут быть непосредственно импортированы в любой анализ знаковой на основе геометрической морфометрии 17. Вычислительный трубопровод выше, был применен для изучения мыши Bacula 14, а также китовый тазовой и реберные кости 16. Более подробную информацию о расчетной определении полупродуктов ориентиров представлены здесь, в попытке помочь исследователям визуализировать шаги, которые могут быть модифицированы с целью их конкретного объекта интереса. Бакулюм содержит несколько уникальных особенностей, которые были использованы для автоматизации определенных преобразований. Например, после того, как в вычислительном отношении разрезания кости на две половины вдоль проксимальной-дистальной оси, мы определили проксимальную половину просто путем сравнения общего количества баллов (проксимальный имеет более). До тех пор пока существуют уникальные функции, такие как это, наши методы должны быть адаптированы к любойобъект. Кроме того, следует подчеркнуть, что мы определены эмпирически определенные пороги, такие как "10% проксимальный", который хорошо зарекомендовал себя в наших бакулюм исследованиях, но, безусловно, должны быть переоценены для других объектов.
Начиная с 5 Протокола, первый вычислительный шаг для вычисления выпуклой оболочки (наименьшее множество точек, который содержит все остальные точки в образце), чтобы идентифицировать две точки, которые удалены друг от друга друг от друга. Эти две точки (красные сферы, рис 1C) начинают определять новую ось г (красная линия, рисунок 1С), запускаемый проксимального дистальной через кость. В случае бакулюм, половина облако точек, которое содержит больше точек определяется как проксимального конца.
Во-вторых, вся помутнения преобразуется так, чтобы ближний точка берет на х, у, г координаты 0,0,0 и дальняя точка тAKES на Х, Y, Z координаты 0,0, + г, где г + некоторое положительное значение зависит от размера кости. В конце этой стадии Z-ось проходит по всей длине кости. Для процедур ниже, длина от минимального до максимального значения Z-координат будет называться Zlength.
В- третьих, для коррекции дисперсии , связанной с точным размещением проксимальных и дистальных точках , указанных выше, 10% наиболее проксимальным и 10% наиболее дистальных точек отбираться отдельно (рис 1D), их соответствующие центры тяжести идентифицированы (красные сферы, рис 1E) и помутнения трансформируются таким образом, что проксимальные центроида 0,0,0, и дистальный центроида 0,0, + Z, с новой оси, проходящей через центр образца (красная линия, рис 1E) ,
В-четвертых, облако точка поворачивается вокруг оси, сначала принимая SLICе точек в проксимальном от 15 до 15,25% Zlength структуры (синих точек, рис 1E). Этот срез точек сплющивается в размерности г (то есть Z-координаты просто игнорируются), выпуклая оболочка берется, а минимальный ограничивающий прямоугольник (самый маленький прямоугольник , который содержит все остальные точки) вычисляются. Представьте себе линию, соединяющую середины двух коротких сторон этого минимального ограничивающего прямоугольника. Мы вращаем облако точек, пока эти два Середины не станут -х, 0, + г и + х, 0, + г, соответственно, таким образом, эта линия становится новой оси х. После трансформации, расстояние между максимальными и минимальными значениями х называются Xlength. Новый файл создается из specimen.xyz в specimen.TRANSFORMED.xyz.
В- пятых, указывает в пределах 1% Xlength от оси нарезаны из (синие точки, рис 1F), и единственный самый проксимальный и единственный наиболее дистальной точки , определенные из этого центрального сллед и маркированы дистальным и проксимальным, соответственно. Это первые два полу-ориентиры были определены.
В- шестых, 50 , равномерно распределенных по ломтика точек опрашиваются вдоль оси г (красные точки, рис 1G). Каждый ломтик толщиной 1% Zlength. Каждый ломтик выравнивают в размерности г, и делится поровну на 7 вертикальных линий (красные линии, рисунок 1H). Очки в пределах 2% Xlength каждой строки сохраняются (красные точки, рис 1H), то точки с максимальной и минимальной координаты у поддерживаются, проектируется на каждую соответствующую линию, и маркированы вентральной и дорзальной соответственно. Кроме того, этикетки содержат номер фрагмента и номер строки, например P15_VENTRAL4 является вентральный точка выборки из 4 - й вертикальной линии 15 - го среза. Важно отметить, что каждая точка маркированы, например, P15_VENTRAL4, происходит один раз и только один раз во всех образцах, сохраняя соответстотделе- ние. В дополнение к вентральной и дорзальной точек каждой из 7 линий (всего 14 полу-ориентиры), точки с максимальным и минимальным значением х оцифровываются и маркированы влево и вправо, соответственно. У и г координаты левого и правого сглаживаются с помощью функции lowess в R. Ради бакулюм, в общей сложности 16 полуприцепов ориентирам определены для каждого среза (красные шары, рисунок 1H); с 50 ломтиков плюс проксимальным и дистальным полупродуктов ориентиров , определенных выше, 802 полу-ориентиры оцифровываются на образец (зеленые сферы, рис 1и). Все остальные точки из исходного microCT сканирования отбрасываются.
Следует отметить, что, хотя вентральном / дорсальный и проксимальный / дистальный полярность была определена математически, все образца выравнивания были подтверждены визуально и регулировать вручную по мере необходимости. В нашей выборке 369 Bacula, приблизительно 10 должно было быть отрегулирован вручную.
Рисунок 1: визуальное представление вычислительного документооборота (Протокол 4-6). (A) Скриншот из 02_segment_dicoms.r сценария (Протокол 4), показывающий назначение отдельных облаков точек для отдельных образцов. (B) Увеличенный вид одного бакулюм, представленное облако ~ 100K точек XYZ. (C) Идентификация двух точек удалены друг от друга друг от друга (красные сферы), используется для определения новой Z-оси , которая проходит проксимального дистальной через кости (красная линия). (D) Выборка проксимального не более 10% и дистальных более 10% точек (красные точки) предоставляет средства для корректировки незначительной дисперсии в точном размещении оси. (E) центроиды проксимальных-самое большее 10% и дистальных не более 10% (красные сферы) используются для определения новой Z-оси (красная линия). Затем кусочек точек падения между 15.00-15.25% этой новой оси (синие точки) берется для расчета минимального ограничивающего прямоугольника. Облако точка поворачивается до тех пор, длинная сторона минимального ограничивающего прямоугольника не будет расположена параллельно к новой оси х. F) срез точек , работающих по средней линии (синие точки) оцифровывается и проксимального наиболее и дистальных наиболее точка , определяемая как полу-ориентир. G) 50 равномерно распределенных точек ломтика отбираются (красные точки), с H) , показывающие один такой кусочек. 16 очков (красные кружки) определены для захвата контуры каждого среза. I) Когда повторяется во всех срезах, в общей сложности 802 полу-ориентиров (зеленые сферы) определяют структуру и используются во всех последующих применений морфометрических. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги в приведенном выше протоколе являются: 1) рассекает Bacula, 2) собрать microCT изображения, 3) преобразования выходного сигнала microCT в плоский файл АБВ координат, 4) сегментирования из облака точек каждого образца, в 5) преобразование каждого образца стандартизированная система координат, и 6) определение полу-ориентиров. Эти шаги легко модифицирована для размещения различных объектов.
Эти методы могут, вероятно, будет применяться к любому объекту, который по существу "палочкообразный", или, по крайней мере, не слишком изогнута. Объекты , которые кривая обратно на себя , чтобы стать "U-образной" не может быть в настоящее время анализируется, так как нарезка (рис 1G) будет возвращать точки из разных частей объекта. Такие объекты могут быть размещены в будущем вычислительно выпрямления объекта перед нарезания.
Мы представили общий метод математически определяющих полупродуктов ориентиров из форм, которые испытывают недостаток SOlid ориентиры. Эти общие методы были модифицированы для изучения эволюции китов малого таза и ребер костей 16, которые имеют очень разные формы. Наши вычислительные методы для определения ориентиров должны быть применимы к любой серии координат XYZ. Мы использовали сканирование microCT здесь, учитывая небольшой размер мыши Bacula 14. Для более крупных костей, таких как кита малого таза и ребер костей, мы использовали лазерный сканер , который реконструировали поверхность кости 16. Важно, чтобы визуально осмотреть все множества полупродуктов ориентиров для проверки качества метода. Основным преимуществом наших вычислительных методов является то, что они точно количественно определить размер и форму, вариации, и сохраняют соответствие между различными регионами объекта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Тим Дейли и Эндрю Смит предоставили много полезных вычислительных дискуссий в течение первых дней; Тим Дэйли написал программу rotate_translate_cylindrical необходимую для протокола 5. Вычислительные ресурсы были предоставлены High Performance Computing Cluster в Университете Южной Калифорнии. Эта работа была поддержана NIH грант № GM098536 (MDD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting scissors | VWR | 470106-338 | Most sizes should work |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved | VWR | 82027-406 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | CAS 64-17-5 | To be diluted to 70% for dissections |
| Floral Foam | Wholesale Floral | 6002-48-07 | |
| uCT50 scanner | Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland |
References
- Slice, D. E. Geometrics morphometrics. Annu. Rev. Anthropol. 36, 261-281 (2007).
- Slice, D. E. Modern morphometrics in physical anthropology. 6, Springer. (2005).
- Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D. Geometric morphometrics for biologists: a primer. , 2nd, Elsevier. (2012).
- Bookstein, F. Morphometric tools for landmark data: geometry and biology. , Cambridge University Press. (1991).
- Rohlf, F. J., Marcus, L. F. A Revolution in Morphometrics. Trends. Ecol. Evol. 8 (4), 129-132 (1993).
- Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D., Fink, W. L. Geometric morphometrics for biologists: a primer. , Elsevier. (2004).
- Rohlf, F. J., Slice, D. E. Extensions of the Procrustes method for the optimal superimposition of landmarks. Syst. Zool. 39 (1), 40-59 (1990).
- Gunz, P., Mitteroecker, P. Semilandmarks: a method for quantifying curves and surfaces. Hystrix. 24 (1), 103-109 (2013).
- Gunz, P., Ramsier, M., Kuhrig, M., Hublin, J. J., Spoor, F. The mammalian bony labyrinth reconsidered, introducing a comprehensive geometric morphometric approach. J. Anat. 220 (6), 529-543 (2012).
- Mitteroecker, P., Gunz, P. Advances in geometric morphometrics. Evol. Biol. 36 (2), 235-247 (2009).
- Bookstein, F. J. Landmark methods for forms without landmarks: morphometrics of group differences in outline shape. Med. Im. Anal. 1 (3), 225-243 (1997).
- Gunz, P., Mitteroecker, P., Bookstein, F. Modern morphometrics in physical anthropology. Slice, D. E. , Kluwer Press. 73-98 (2005).
- Oxnard, C., O'Higgins, P. Biology Clearly Needs Morphometrics. Does Morphometrics Need Biology? Biological Theory. 4 (1), 84-97 (2009).
- Schultz, N. G., et al. The genetic basis of baculum size and shape variation in mice. G3. 6 (5), 1141-1151 (2016).
- Schultz, N. G., Lough-Stevens, M., Abreu, E., Orr, T. J., Dean, M. D. The baculum was gained and lost multiple times during mammalian evolution. Integr Comp Biol. 56 (4), 644-656 (2016).
- Dines, J. P., et al. Sexual selection targets cetacean pelvic bones. Evolution. 68 (11), 3296-3306 (2014).
- Adams, D. C., Otárola-Castillo, E. geomorph: an R package for the collection and analysis of geometric morphometric shape data. Methods Ecol. Evol. 4 (4), 393-399 (2013).
