在中短肛解剖，显微扫描和分析形态

Summary

许多生物结构缺乏容易定义的地标，从而难以应用现代形态的方法。在这里，我们举例说明的方法来研究的小鼠阴茎骨（在阴茎骨），包括夹层和显微扫描，随后计算方法来定义用于量化的尺寸和形状的变化的半标。

Abstract

现代形态测量提供了强大的方法来量化的大小和形状的变化。一个基本要求是，确定地标坐标列表;然而，这样的坐标必须代表整个标本同源结构。虽然许多生物对象包括容易识别标志，以满足同源性的假设，许多缺乏这种结构。一个可能的解决方案是在数学上横跨试样代表相同形态区域中的对象在地方半标。在这里，我们说明了一个新近开发的管道数学定义从鼠标阴茎骨（阴茎骨）半地标。我们的方法应该适用于广泛范围的对象。

Introduction

形态测量的领域包括的方法来量化的大小和生物形式的形状，在科学调查^{1，2，3，4，5，6}的一个基本步骤的分集。传统上，大小和形状的统计分析开始于识别上的生物结构的地标，然后测量线性距离，角度和比例，这可以在一个多变量的框架进行分析。里程碑式的基于几何形态特征是保留的地标空间位置，通过分析和可视化⁵保存从数据收集几何信息的方法。广义普鲁克分析（GPA）可以应用到消除位置，规模，和地标旋转变化，以产生是m标本之间的对准inimizes他们的平方差-剩下的就是形状相异^7。

任何形态分析的一个重要概念是同源性，或一个可以可靠地识别代表该标本或结构之间对应生物学意义的和离散的特征的地标的想法。例如，人头骨有同源流程，椎间孔，缝合线，和管道，可以使形态学分析。不幸的是，对应的地标标识是在许多生物结构困难，特别是那些具有光滑表面或曲线^{8，9，10。}

我们下面的办法使用计算几何这个问题。的一般工作流程，以产生可以被表示为点的云的物体的三维扫描，然后旋转和转换，该转换点云，使得所有specimens被定向一个共同的坐标系上。然后我们数学定义从物体的特定区域的半标。放在这些地区离散半地标生物任意^11。开展GPA和随后的统计分析可以产生不良的文物^8，12，因为随意放置地标可能不是生物同源。因此，我们允许这些半地标数学“滑动”。此过程减少结构之间的电势差。如别处认为这里使用的滑动算法是适当的量化缺乏类似解剖区域容易识别相应的地标^{3，6，8，10，11，12。}这些方法各有其利mitations ^13，但应该适应不同尺寸和形状的物体。

这里，我们说明这个方法是如何在近一个鼠标阴茎骨¹⁴的研究应用，在已经获得和哺乳动物进化¹⁵期间丢失多个独立倍阴茎骨。我们讨论解剖和制备的特定骨的，所述阴茎骨（协议1），生成显微图像（协议2），并且这些图像以一种格式，使所有下游计算几何变换（协议3和4）。完成这些步骤后，由〜100K XYZ坐标每个试样表示。然后，我们通过一系列的变革，有效地调整所有标本到一个共同的方向（协议5）走，然后定义从对准标本半地标（协议6）。协议1-4应该是相似的，无论被分析的对象。协议5和6号议定书是SPEcifically专为阴茎骨，但我们希望通过详细介绍这些步骤，研究者可以想像的修改，这将是对有关他们感兴趣的对象。例如，这些方法改进了用于研究鲸骨盆和肋骨^16。

Protocol

所有的过程和人员由南加州学院的大学动物护理和使用委员会（IACUC），协议＃11394批准。

1.解剖短肛和准备

1. 通过二氧化碳过度曝光安乐死一个性成熟的雄性小鼠，根据相关机构的动物护理和使用委员会（IACUC）提出的协议。
2. 躺在仰卧位的动物，并通过施加压力拖延阴茎大拇指外侧包皮开幕。
3. 一旦阴茎旷日持久，通过包皮尽可能延长组织。
4. 用剪刀，剪断阴茎体近端，其中阴茎骨所在的龟头。
5. 转移解剖阴茎1.7毫升管中，加入200μl自来水。使某些阴茎在液体完全浸没。
6. 孵育在水中的组织在约50℃下3-5天。
7. 放置解剖阴茎骨与盖打开一个新的离心管中。请假封顶开O / N为干骨。

2.显微扫描

1. 按一个显微扫描圆柱支架插入花店泡沫砖创造花店泡沫的圆柱体。
2. 提取花店泡沫缸和切割片〜2-5厘米厚。
3. 干燥后推入的bacula花店泡沫，围绕单个片的外围扫描过程中，尽量减少干扰。骨骼的精确定位应该说允许在协议4个人标本的正确识别。
4. 轻轻将切片与嵌入式骨头进入显微持有人。
5. 获得显微扫描。在小鼠的bacula ¹⁴的情况下

3.显微加工：转换一个.DCM堆栈到单个名为.xyz文件

注意：每个显微扫描产生一个堆栈.DCM的，或“DICOM”，即表示通过对象拍摄图像片段文件。所有下游计算几何需要平面名为.xyz文件，这是一个简单的包含四列的文本文件 - 在x，y和每个像素的z坐标的，并且所述像素的强度，范围从-5000（黑色）到5000 （白色）。超过3000像素的阈值通常工作以及定义骨骼的阈值。

1. 安装Python（www.python.org）和Python模块命令，DICOM，PYLAB，SYS和numpy的。
2. 打开“01_process_dicom.py“{} Figshare用任何文本编辑器，在变量部分，改变路径，像素阈值和目录名是必要的。
3. 运行“蟒蛇01_process_dicom.py”。进展情况将被打印到屏幕上。在每个步骤3.2命名的目录，新文件由命名;例如，directory_name.PT3000.xyz，其中PT3000指示像素阈在步骤3.2表示。

4.显微加工：细分出单独的标本名为.xyz文件

1. 与库RGL安装R（https://www.r-project.org/）。
2. 用任何文本编辑器打开文件02_segment_dicoms.r'{} Figshare。根据变量部分，更改路径名称指向上述协议3中创建的名为.xyz文件。
3. 从内部R，运行命令“源（'02_segment_dicoms.r'）”（不包括双引号）。
4. 在协议3中创建的名为.xyz文件的三维图像出现后，输入numbe在整体名为.xyz文件标本河然后贴上标签并选择使用滚动和缩放功能，每个样本点。
   注：在后台，独立名为.xyz文件将每个样品上进行。这些出现在一个新的目录，例如，XYZ_FILES_PT3000，其中PT3000表示使用的像素阈值。

5.“对齐”标本名为.xyz文件到通用坐标。

1. 打开Python脚本“03_transform.py”{} Figshare，这需要额外的模块mattdean_modules.py {} Figshare，以及两个自立的应用程序：“rotate_translate_cylindrical”（https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform）和“qconvex”（www.qhull.org/html/qconvex.htm）受此脚本中使用。
2. 根据变量部分，确定全路径名mattdean_modules.py，rotate_path和qconvex_dir。此外，确定到包含个体.xy目录的完整路径步骤4中创建ž文件。
3. 运行03_transform.py，它创建每个试样的新文件的后缀.TRANSFORMED.xyz。

6.“切片”不结盟标本名为.xyz文件识别半地标。

1. 打开并运行Python脚本“04_identify_landmarks.py”{} Figshare。在变量部分，确定全路径名包含.TRANSFORMED.xyz文件的目录。此脚本标识可以用来量化该结构的尺寸和形状802半标。

Representative Results

在协议6中产生的半地标XYZ坐标可以直接导入到任何基于具有里程碑意义的几何形态测量分析^17。计算管道上面已经用于研究小鼠的bacula ^14，以及鲸骨盆和肋骨^16。上半的地标计算定义的更多细节，这里提出，以试图帮助研究人员可视可能被修改，以适应他们感兴趣的特定对象的步骤。该阴茎骨包含了被利用来自动化某些变换几个独特的功能。例如，经过计算切断骨成两半沿近侧 - 远侧轴，我们确定近端半部简单地通过比较点的总数（在近端有更多的）。只要存在着独特的功能，因为这样，我们的方法应该适应任何目的。此外，应当强调的是，我们凭经验确定特定的阈值，例如“10％近侧”，在我们的阴茎骨研究表现良好，但肯定需要重新评估其他对象。

在协议5开始，第一计算步骤是计算的凸包（最小集合，其中包含在样品中的所有其他点的点），以确定这两个点是从彼此相距最远。这两点（红球， 图1C）开始来定义运行近端-远端穿过骨一个新的z轴（红线， 图1C）。在阴茎骨的情况下，包含更多的点的点云的一半被定义为近端。

第二，整个点云被变换，使得近端点发生在将x，y，0,0,0 z坐标的和远端点t在x，Y，Z 0,0，+ z，其中+ z是依赖于骨的大小一些正值的坐标碟刹。在此步骤结束时，z轴穿过骨的长度。对于下面的程序，从最小到最大z坐标的长度将被称为Zlength。

第三，以校正与上面确定的近端和远端的点的确切位置，在10％的最近端和10％最远侧点被分别采样关联方差（ 图1D），它们各自的质心确定（红球， 图1E）和点云转化使得近侧质心是0,0,0，和远端形心是0,0，+ Z，与通过样品的中心通过一个新的z轴（红线， 图1E） 。

第四，点云围绕z轴通过首先采取SLIC旋转在结构的近端15到15.25％Zlength（蓝点， 图1E）点即分的这片在z方向是扁平的（ 即 z坐标被忽略），所采取的凸包，而最小外接矩形计算（包含所有其他点的最小矩形）。想象一下，这个连接最小外接矩形的两个短边的中点线。我们旋转点云直到这两个中点变得-x，0，+ z和+ X，0，+ Z，分别因而该行成为一个新的X轴。改造后的最大和最小的x值之间的距离被称为Xlength。一个新的文件是从specimen.xyz创建specimen.TRANSFORMED.xyz。

第五，内分1％z轴的Xlength被切出（蓝点， 图1F），和一个最近端和一个最远侧点从该中央SL识别冰和标记的远端和近端，分别。这些都是确定的前两个半地标。

第六，50均匀地间隔开的点片沿z轴（红点， 图1G）采样。每片是厚度为1％Zlength的。每个切片然后在z方向变平，和由7条垂直线（红线， 图1H）平分。每行的2％Xlength内的点被保持（红点， 图1H），再与最大值和点最小y坐标保持，投射到每个相应行，分别标有腹侧和背侧，。此外，标签包含片数和行数，例如P15_VENTRAL4是从^第 15片的^第 4垂直线取样腹侧点。重要的是，每点标记，例如，P15_VENTRAL4，发生一次且仅一次在所有试样，保留correspondence。除了各7行（14半标总数）的腹侧和背侧点，最大和最小的x值的点进行采样，并分别标有左，右，。左，右的Y和Z坐标采用了R中LOWESS功能对于阴茎骨平滑，共有16个半地标每片的定义（红球， 图1H）; 50片加近端和上面定义远端半地标，802半地标每个试样取样（绿球， 图1I）。从原来的显微扫描所有其它点都被丢弃。

应当指出的是，虽然腹侧/背和近端/远端极性数学确定的，所有检体比对用肉眼确认并根据需要手动调整。在我们的369的bacula的样品，大约10必须手动调整。

图 1： 计算工作流（协议4-6）的可视化表示。 （ 一 ）从02_segment_dicoms.r脚本（协议4），显示出明显的点云个别标本分配的屏幕截图。 （B）一种阴茎骨的放大图，由〜100K的xyz点云表示。的两个点（C）的鉴定从彼此（红球）相隔最远，用来定义运行近端-远端穿过骨（红线）一个新的z轴。 （D）的采样的最近侧10％，最远侧的10％点（红点）提供了在z轴的精确位置，以调整对轻度方差的装置。 （E） -基-至多10％和最远侧的10％（红色球）的质心被用来定义一个新的z轴（红线）。然后，分片之间1下降这种新的z轴（蓝点）5.00-15.25％是采取计算最小边界矩形。点云被旋转直到最小外接矩形的长边平行于一个新的X轴。 F），沿中线（蓝点运行点的切片）进行采样，而最近侧和最远侧点定义为一个半的地标。 G）50间隔均匀的点片进行采样（红点），用H）显示出一个这样的片。 16点（红圈）被定义为捕获每个切片的轮廓。 Ⅰ）当所有片重复，共802半标（绿球）定义的结构和在所有下游形态的应用程序被使用。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

在上述协议中的关键步骤是：1）解剖的bacula，2）收集显微图像，3）显微输出转换到XYZ的平面文件坐标，4）分割出各试样的点云，5）将每个试样标准化的坐标系，和6）限定的半标。这些步骤很容易被修改，以适应不同的对象。

这些方法可能可以被应用到实质上是“棒状”，或者至少不太弯曲的任何对象。对象曲线回自己成为“U形”不能被目前分析，因为切片（ 图1G）将来自对象的不同部分返回点。这样的对象可以通过切片之前计算矫直对象被容纳在将来。

我们已经提出了数学上定义半地标一般方法从缺乏小号形状奥利德地标。这些一般方法已被修改，以研究鲸盆腔及肋骨^16，它有非常不同形状的演变。我们的定义标计算方法应适用于任何系列的xyz坐标。我们采用显微扫描这里，给小鼠的bacula ¹⁴的小尺寸。对于较大的骨头，如鲸骨盆和肋骨，我们采用了重构的骨头¹⁶的表面的激光扫描仪。以目视检查半的地标所有集合以验证该方法的质量是很重要的。我们的计算方法的主要优点是，它们正是量化的大小和形状的变化，并保持该物体的不同区域之间的对应关系。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting scissors	VWR	470106-338	Most sizes should work
Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved	VWR	82027-406
1.7 mL microcentrifuge tube	VWR	87003-294
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	CAS 64-17-5	To be diluted to 70% for dissections
Floral Foam	Wholesale Floral	6002-48-07
uCT50 scanner	Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland