Dissektion MicroCT Scanning og morfometrisk Analyser af Baculum

Summary

Mange biologiske strukturer mangler let definerbare vartegn, hvilket gør det vanskeligt at anvende moderne morfometriske metoder. Her illustrerer vi metoder til at studere muse baculum (en knogle i penis), herunder dissektion og microCT scanning efterfulgt af beregningsmæssige metoder til at definere semi-landmærker, der bruges til at kvantificere størrelse og form variation.

Abstract

Moderne morphometrics giver effektive metoder til at kvantificere variation størrelse og form. Et grundlæggende krav er en liste over koordinater, der definerer vartegn; dog sådanne koordinater skal repræsentere homologe strukturer på tværs prøver. Mens mange biologiske objekter består af let identificerede vartegn for at tilfredsstille antagelsen om homologi, mange mangler sådanne strukturer. En mulig løsning er at matematisk sted semi-vartegn på et objekt, der repræsenterer den samme morfologiske region tværs prøver. Her vil vi illustrere en nylig udviklet rørledning til matematisk definere semi-vartegn fra muse baculum (penis knogle). Vores metoder bør gælde for en bred vifte af genstande.

Introduction

Feltet af morphometrics omfatter en mangfoldighed af metoder til at kvantificere størrelsen og formen af den biologiske form et afgørende skridt i videnskabelig undersøgelse ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Traditionelt den statistiske analyse af størrelse og form begynder ved at identificere vartegn på en biologisk struktur, og derefter måle lineære afstande, vinkler og forhold, som kunne analyseres i en multivariat rammer. Landmark-baserede Geometric Morphometrics er en tilgang, der bevarer den rumlige placering af vartegn, bevare geometriske informationer fra dataindsamling gennem analyser og visualisering ^5. Generaliseret Procrustes Analysis (GPA) kan anvendes til at fjerne variation i placeringen, skala, og rotation af lokaliteter til frembringelse en orientering mellem enheder, minimizes deres kvadrerede forskelle - hvad der er tilbage, er formen forskellighed ^7.

Et vigtigt begreb enhver morfometriske analyse er homologi, eller tanken om, at man pålideligt kan identificere vartegn repræsenterer biologisk meningsfulde og diskrete funktioner, der svarer mellem prøver eller strukturer. For eksempel, menneskelige kranier har homologe processer, foramina, suturer, og kanaler, der kan aktivere morfometriske analyser. Desværre, identifikation af tilsvarende landmærker er vanskeligt på tværs af mange biologiske strukturer, især dem med glatte overflader eller kurver ^{8, 9, 10.}

Vi nærmer os dette problem under brug af beregningsmæssige geometri. Den overordnede arbejdsgang er at generere en tredimensional skanning af det objekt, der kan repræsenteres som en sky af punkter, og derefter rotere og omdanne dette punkt sky således at alle specimens er orienteret om en fælles koordinatsystem. Så vi matematisk definerer semi-vartegn fra specifikke regioner af objektet. Diskrete semi-vartegn placeret på sådanne områder er biologisk vilkårlige ^11. Gennemførelse GPA og efterfølgende statistiske analyser kan producere uønskede artefakter ^{8, 12} fordi vilkårligt placeret vartegn måske ikke biologisk homologe. Derfor tillader vi disse semi-lokaliteter til matematisk "slide". Denne procedure minimerer potentielle forskel mellem strukturer. Som argumenteret andetsteds glidende algoritme, der anvendes her, er hensigtsmæssigt at kvantificere lignende anatomiske regioner mangler let identificeres tilsvarende vartegn ^{3, 6, 8, 10, 11, 12.} Disse metoder har deres limitations ^13, men skal kunne tilpasses til objekter med forskellig størrelse og form.

Her vil vi illustrere, hvordan denne metode blev anvendt i en nylig undersøgelse af musen baculum ^14, en knogle i penis, der er blevet opnået, og mistede flere uafhængige gange i løbet af pattedyr evolution ^15. Vi diskuterer dissektion og fremstilling af en specifik knogle, den baculum (protokol 1), generering af microCT billeder (protokol 2), og omdannelsen af ​​disse billeder til et format, der gør det muligt for alle downstream beregningsmæssige geometri (Protokollerne 3 og 4). Efter disse trin, er hver prøve repræsenteret ved ~ 100K xyz koordinater. Vi går derefter gennem en række transformationer, der effektivt tilpasse alle enheder i en fælles indstilling (Protokol 5), bestemmes semi-vartegn fra afstemt prøver (Protokol 6). Protokoller 1-4 bør svare uanset den analyserede objekt. Protokol 5 og protokol 6 er specifikt designet til en baculum, men det er vores håb, at ved detaljering disse trin, kan efterforskerne forestille ændringer, der ville være relevante for deres objekt af interesse. For eksempel blev modifikationer af disse metoder anvendes til at studere hval bækken knogler og ribbenene ^16.

Protocol

Alle procedurer og personale blev godkendt af University of Southern California Institute for Animal Care og brug Udvalg (IACUC), protokol # 11394.

1. Baculum Dissektion og klargøring

1. Afliv en kønsmoden hanmus via kuldioxid overeksponering, i henhold til protokoller, der er fremsat af den relevante Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).
2. Læg dyret i liggende stilling, og forhale penis ved at anvende pres med tommelfingrene lateralt for forhudskirtlen åbning.
3. Når penis er langvarig, forlænge vævet gennem forhuden så vidt muligt.
4. Med en saks, klippe penis krop nærmest glans penis, hvor baculum bosat.
5. Overfør dissekerede penis til et 1,7 ml rør, og der tilsættes 200 pi ledningsvand. Sørg for at penis er fuldt nedsænket i væsken.
6. Inkuber vævet i vand ved -50 ° C i 3-5 dage.
7. Placer dissekeret baculum til et nyt mikrocentrifugerør med hætten åben. Efterlad cap åben O / N til at tørre ud knogle.

2. MicroCT Scanning

1. Tryk på en microCT scan cylindrisk holder i en mursten af ​​blomsterhandler skum for at skabe en cylinder af blomsterhandler skum.
2. Ekstraher cylinder af blomsterhandler skum og skære skiver ~ 2-5 cm tyk.
3. Skub tørret Bacula ind blomsterhandleren skum, omkring periferien af ​​en individuel skive for at minimere interferens under scanningen. Den præcise orientering af knogler skal bemærkes, der giver mulighed for korrekt identifikation af individuelle prøver i protokol 4.
4. Placer forsigtigt skive med de indlejrede knogler i holderen microCT.
5. Acquire microCT scanninger. I tilfælde af muse Bacula ¹⁴

3. MicroCT Behandler: Konvertering af en .DCM Stack for et fælles .xyz fil

BEMÆRK: Hver microCT scanning producerer en stak .DCM, eller "DICOM", filer, der repræsenterer billedudsnit taget gennem objektet. Alle nedstrøms beregningsmæssige geometri kræver flade .xyz filer, som simpelthen er en tekstfil, der indeholder fire kolonner - x-, y- og z-koordinaterne for hver pixel, og intensiteten af ​​pixel, der spænder fra -5000 (sort) til 5000 (hvid). En pixel tærskel 3000 fungerer generelt godt som en tærskel for at definere knogler.

1. Installer Python (www.python.org) og Python-moduler KOMMANDOER, DICOM, PYLAB, SYS, og numpy.
2. Åbn "01_process_dicom.py "{Figshare} med en teksteditor. Under sektionen Variabler, ændre stien, pixel tærskler, og mappenavne som nødvendigt.
3. Kør "python 01_process_dicom.py". Fremskridtene vil blive udskrevet til skærmen. Inden for hver mappe med navnet i trin 3.2, er en ny fil lavet med navnet; for eksempel directory_name.PT3000.xyz, hvor PT3000 angiver tærsklen pixel angivet i trin 3.2.

4. MicroCT behandling: Segmentering-out Individuel Prøve .xyz filer

1. Installer R (https://www.r-project.org/) med biblioteket RGL.
2. Åbn filen "02_segment_dicoms.r '{Figshare} med en teksteditor. Under afsnittet variabler, ændre stien navn til at pege på den .xyz fil oprettet i protokol 3 ovenfor.
3. Inde fra R, køre kommandoen "kilde (" 02_segment_dicoms.r «)" (uden anførselstegn).
4. Efter den tredimensionelle billede af .xyz fil oprettet i protokol 3 vises, skal du indtaste number af prøver i den samlede .xyz fil. Så mærke og vælge de punkter fra hver prøve ved hjælp af scroll og zoom-funktioner.
   BEMÆRK: I baggrunden, vil separate .xyz filer foretages for hver prøve. De vises i en mappe med navnet, for eksempel XYZ_FILES_PT3000, hvor PT3000 angiver pixel tærskel anvendes.

5. "Justering" Specimen .xyz filer til fælles koordinater.

1. Åbn Python scriptet "03_transform.py" {Figshare}, som kræver ekstra modul mattdean_modules.py {Figshare}, samt to selvstændige programmer: "rotate_translate_cylindrical" (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) og "qconvex" (www.qhull.org/html/qconvex.htm), der anvendes af dette script.
2. Under afsnittet Variabler, identificerer den fulde sti navne til mattdean_modules.py, rotate_path og qconvex_dir. Desuden anfører den fulde sti til den mappe, der indeholder den enkelte .xyz filer oprettet i trin 4.
3. Kør 03_transform.py, som skaber en ny fil per eksemplar med endelsen .TRANSFORMED.xyz.

6. "metoden" Aligned Model .xyz filer til at identificere Semi-vartegn.

1. Åbn og køre Python scriptet "04_identify_landmarks.py" {Figshare}. I afsnittet Variabler, identificere fulde stinavne til den mappe, der indeholder de .TRANSFORMED.xyz filer. Dette script identificerer 802 semi-landmærker, der kan anvendes til at kvantificere størrelsen og formen af ​​strukturen.

Representative Results

XYZ koordinater for semi-vartegn produceret i protokol 6 kan importeres direkte ind i enhver milepæl-baserede geometriske morphometrics analyse ^17. Den beregningsmæssige rørledning ovenfor, er blevet anvendt til at studere muse Bacula ^14, samt hval bækken og ribbenene ^16. Flere detaljer om den beregningsmæssige definition af semi-vartegn præsenteres her, i et forsøg på at hjælpe forskere visualisere skridt, der kan ændres til at rumme deres særlige genstand for interesse. Den baculum indeholder flere unikke funktioner, der blev udnyttet til at automatisere visse transformationer. For eksempel, efter beregningsmæssigt skære knoglen i to halvdele langs en proximal-distal akse, der er konstateret vi den proximale halvdel simpelthen ved at sammenligne det samlede antal point (den proximale har mere). Så længe der findes unikke funktioner som dette, bør vores metoder kunne tilpasses til enhverobjekt. Desuden bør det understreges, at vi empirisk visse tærskler, såsom "10% proksimal", der klarede sig godt i vore baculum undersøgelser, men helt sikkert skal revurderes for andre objekter.

Begyndende i protokol 5, den første beregningsmæssige trin er at beregne konvekse hylster (den mindste sæt af punkter, som indeholder alle andre punkter i en prøve) for at identificere de to punkter, som er længst fra hinanden. Disse to punkter (røde kugler, figur 1 C) begynder at definere et nyt z-aksen (rød linje, figur 1C), der kører proximal-distal gennem knoglen. I tilfælde af baculum anses halvdelen af ​​punktet sky, der indeholder flere point defineret som den proximale ende.

For det andet er hele punktsky transformeret således, at den proximale punkt tager på x, y, z koordinater 0,0,0 og det fjerneste punkt takes på x, y, z-koordinaterne for 0,0, + z, hvor + z er nogle positiv værdi afhængig af størrelsen af ​​knoglen. Ved afslutningen af ​​dette trin, en z-akse passerer gennem længden af ​​knoglen. For nedenstående procedurer, vil længden fra minimum til maksimum z-koordinaterne blive omtalt som Zlength.

For det tredje, for at korrigere for varians i forbindelse med den nøjagtige placering af de proksimale og distale punkter identificeret ovenfor, de 10% mest proximale og 10% mest distale punkter udtages separat (figur 1 D), der er konstateret deres respektive geometriske tyngdepunkter (røde kugler, fig 1E) og det punkt sky transformeret således, at den proximale centroid er 0,0,0, og den distale centroid er 0,0, + z, med en ny z-akse, der passerer gennem centrum af prøven (rød linje, figur 1E) .

For det fjerde er det punkt sky roteres omkring z-aksen ved først at tage en SKIVEe punkter i den proksimale 15-15,25% Zlength af strukturen (blå punkter, figur 1E). Denne skive punkter er fladtrykt i z dimension (dvs. z-koordinater simpelthen ignoreret), den konvekse skrog taget, og den mindste omgivende rektangel (den mindste rektangel, der indeholder alle andre punkter) beregnet. Forestil dig en linje, der forbinder midtpunkterne af de to korte sider af dette minimum afgrænsende rektangel. Vi rotere punkt sky indtil disse to midtpunkter bliver -x, 0, + z og + x, 0, + z, henholdsvis således denne linie bliver en ny x-aksen. Efter transformation, er afstanden mellem de maksimale og minimale x-værdier benævnt Xlength. En ny fil oprettes fra specimen.xyz til specimen.TRANSFORMED.xyz.

Femte, peger inden for 1% Xlength af z-aksen er skåret ud (blå punkter, figur 1F), og den mest proksimale og mest distale punkt identificeret fra denne centrale slis og mærket distale og proksimale hhv. Det er de to første semi-vartegn identificeret.

For det sjette er 50 jævnt fordelt skiver af målepunkterne langs z-aksen (røde punkter, figur 1G). Hver skive er en tykkelse på 1% Zlength. Hver skive derefter fladtrykt i z dimension, og delt ligeligt af 7 lodrette linier (røde linjer, figur 1 H). Punkter inden 2% Xlength af hver linje holdes (røde punkter, figur 1 H), så de punkter med den maksimale og minimale y-koordinat holdes, projiceres hver respektive linie, og mærket ventrale og DORSAL hhv. Desuden etiketter indeholder udsnittet nummer og linienummer, f.eks P15_VENTRAL4 er den ventrale punkt samplet fra 4 ^th lodrette linie 15 ^th skive. Vigtigt er det, hvert punkt mærket, fx P15_VENTRAL4, forekommer en gang og kun én gang på tværs af alle prøver, bevare korrespondence. Ud over de ventrale og dorsale punkter i hver af de 7 linier (14 semi-vartegn i alt), er de punkter med den maksimale og minimale x-værdien samplet og mærket LEFT og RIGHT hhv. Y og z-koordinaterne for VENSTRE og HØJRE udglattes ved hjælp af lowess funktion i R. For baculum, er i alt 16 semi-vartegn defineret pr skive (røde kugler, figur 1 H); med 50 skiver plus proksimale og distale semi-vartegn defineret ovenfor, samples 802 semi-vartegn pr eksemplar (grønne kugler, figur 1 i). Alle andre punkter fra den oprindelige microCT scanning kasseres.

Det skal bemærkes, at selv om ventral / dorsal og proximal / distal polaritet blev bestemt matematisk blev alle specimen alignments visuelt bekræftet og manuelt justeret efter behov. I vores stikprøve på 369 Bacula, ca. 10 måtte justeres manuelt.

Figur 1: Visuel repræsentation Computational Workflow (Protokol 4-6). (A) Et skærmbillede fra 02_segment_dicoms.r script (protokol 4), som viser tildelingen af distinkte punkt skyer til individuelle prøver. (B) forstørret billede af en baculum, repræsenteret af en sky af ~ 100K xyz point. (C) Identifikation af de to punkter, der er længst fra hinanden (røde kugler), anvendes til at definere en ny z-aksen, der løber proximal-distal gennem knoglen (rød linje). (D) Prøveudtagning den proximale-højst 10% og mest distale 10% af punkter (røde punkter) tilvejebringer et middel til at korrigere for mindre varians i den nøjagtige placering af z-aksen. (E) De geometriske tyngdepunkter af de mest proksimal 10% og mest distale 10% (røde kugler) anvendes til at definere en ny z-aksen (rød linje). Så, et udsnit af punkter falder mellem 15,00-15,25% af denne nye z-aksen (blå punkter) tages til at beregne den minimale omgivende rektangel. cloud Pointen roteres indtil den lange side af den minimale omgivende rektangel er parallel med en ny x-aksen. F) et udsnit af punkter, der kører langs midterlinien (blå punkter) samples og mest proksimal og mest distale punkt defineres som et halvfast milepæl. G) 50 jævnt fordelte skiver af punkter samples (røde punkter), med H), der viser en sådan skive. 16 point (røde cirkler) er defineret til at fange omridset af hver skive. I) Når gentages på tværs af alle skiver, i alt 802 semi-landmarks (grønne kugler) fastlægge strukturen og anvendes i alle efterfølgende morfometriske applikationer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

De kritiske trin i ovennævnte protokol er 1) dissekere Bacula, 2) at indsamle microCT billeder, 3) at omdanne microCT output til en flad fil af xyz koordinater, 4) segmentering ud hver prøve pointe sky, 5) at omdanne hver prøve til et standardiseret koordinatsystem, og 6), der definerer semi-landmærker. Disse trin let modificeres til at rumme forskellige objekter.

Disse fremgangsmåder kan sandsynligvis anvendes på ethvert objekt, der er i det væsentlige "stang-formet", eller i hvert fald ikke for buet. Objekter, kurve tilbage på sig selv for at blive "U-formet" ikke kan analyseres i øjeblikket, fordi udskæring (figur 1G) ville returnere point fra forskellige dele af objektet. Sådanne genstande kunne indpasses i fremtiden ved beregningsmæssigt glatning objektet før udskæring.

Vi har præsenteret en generel metode til matematisk definerende semi-vartegn fra figurer, der mangler sOlid vartegn. Disse generelle metoder er blevet modificeret for at studere udviklingen af hval bækken og ribben knogler ^16, som har meget forskellige former. Vores beregningsmetoder for definering vartegn bør gælde for enhver serie af xyz koordinater. Vi ansat microCT scanning her på grund af den lille størrelse af mus Bacula ^14. For større knogler, såsom hval bækken og ribben knogler, vi ansat en laserscanner, der rekonstrueret overfladen af knoglerne ^16. Det er vigtigt, visuelt inspicere alle sæt semi-vartegn at kontrollere kvaliteten af ​​metoden. Den største fordel ved vores beregningsmetoder er, at de nøjagtigt at fastlægge størrelse og form variation, og bevare overensstemmelsen mellem distinkte områder af objektet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting scissors	VWR	470106-338	Most sizes should work
Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved	VWR	82027-406
1.7 mL microcentrifuge tube	VWR	87003-294
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	CAS 64-17-5	To be diluted to 70% for dissections
Floral Foam	Wholesale Floral	6002-48-07
uCT50 scanner	Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland