陰茎骨の解剖、マイクロCTスキャンおよび形態計測分析

Summary

多くの生物学的構造は、それが困難な現代の形態計測法を適用すること、容易に定義可能なランドマークを欠いています。ここでは、大きさや形状変化を定量化するために使用されている半ランドマークを定義するために、計算方法に続いて解剖し、マイクロCTスキャンを含むマウス陰茎骨（陰茎骨）を、勉強する方法を説明します。

Abstract

近代的な形態計測のサイズと形状変化を定量化するための強力な方法を提供します。基本的な要件は、ランドマークを定義する座標のリストです。しかし、このような座標は、標本全体の相同構造を表している必要があります。多くの生物学的オブジェクトは、相同性の仮定を満たすために容易に特定のランドマークで構成されているが、多くはそのような構造を欠いています。一つの潜在的解決策は、標本間で同じ形態学的地域を表すオブジェクト上の場所半ランドマークを数学的にすることです。ここでは、数学的にマウス陰茎骨（陰茎骨）から半ランドマークを定義するために最近開発パイプラインを示しています。私たちの方法は、オブジェクトの広い範囲に適用可能であるべきです。

Introduction

形態計測の分野は、寸法的および生物学的形状の形状、科学的な照会^{1、2、3、4、5、6}の基本的なステップを定量化するための方法の多様性を含みます。伝統的に、サイズと形状の統計分析は、生物学的構造のランドマークを識別し、そして次に、多変量のフレームワークで分析することができる直線距離、角度及び比率を測定することによって始まります。ランドマークベースの幾何学的形態計測解析と可視化⁵を介してデータ収集から幾何学的な情報を保存、ランドマークの空間的な位置を保持しているアプローチです。一般化プロクラステス分析（GPA）は、M標本との間のアラインメントを生成する場所、規模、およびランドマークの回転変動を除去するために適用することができますその差の二乗をinimizes -形状の相違度⁷さ残るもの。

いずれの形態計測分析の重要な概念は、相同性、または1つは確実に検体または構造の間に対応し、生物学的に意味のある個別の特徴を表す目印を識別することができるという考えです。例えば、人間の頭蓋骨は、形態学的分析を有効にすることができ、相同プロセス、孔を、縫合糸、およびダクトを持っています。残念ながら、対応するランドマークの識別は、滑らかな表面または曲線^{8、 図9、図 10}には特にものは、多くの生物学的構造を横切ることは困難です。

私たちは、計算幾何学を用いて、以下に、この問題にアプローチ。一般的なワークフローは、すべてのSようにその点群の点の雲のように表すことができる物体の三次元スキャンを生成し、次いで、回転し変換することですpecimensは、共通の座標系に配向されています。その後、我々は数学的オブジェクトの特定の領域から半ランドマークを定義します。このような領域に配置された離散半ランドマークは¹¹生物学的に任意です。任意に配置されたランドマークは、生物学的に相同ではないかもしれないので、GPAとその後の統計分析を行うことは望ましくないアーティファクト^8、12を生成することができ^ます 。したがって、我々はこれらの半ランドマークが数学的に「スライド」することを可能にします。この手順では、構造体との間の電位差を最小にします。他の箇所で論じたように、ここで使用される摺動アルゴリズムは容易に識別される対応するランドマーク^{3、6、8、10、11、12を}欠く類似の解剖学的領域を定量化することが適切です。これらの方法は、彼らの李を持っていますmitations ¹³が、異なるサイズや形状のオブジェクトに適応する必要があります。

ここでは、この方法は、マウスの陰茎骨^14、獲得し、哺乳類の進化の¹⁵の間に複数の独立した回失われた陰茎骨の最近の研究に適用された方法を示しています。私たちは、解剖し、特定の骨の準備、陰茎骨（プロトコル1）、マイクロCT画像の生成（プロトコル2）、およびすべての下流の計算幾何学を可能にする形式にこれらのイメージの変換について議論（プロトコル3および4）。これらのステップの後、各試料を〜100K XYZ座標で表されています。私たちは、その後、効果的に共通の向き（プロトコル5）に全ての検体を揃え、一連の変換を歩く、その後整列標本（プロトコル6）から半ランドマークを定義します。プロトコル1-4にかかわらず、分析されているオブジェクトの類似していなければなりません。議定書5とプロトコル6は、SPEですcifically陰茎骨のために設計されていますが、これらのステップを詳細にすることにより、研究者は興味のあるオブジェクトに関連するであろう修正を想像することができることを私たちの希望です。例えば、これらの方法の修飾は、鯨骨盤の骨及び肋骨の骨^16を研究するために適用しました。

Protocol

すべての手順と人が動物実験委員会（IACUC）のための南カリフォルニアの研究所、プロトコル＃11394の大学によって承認されました。

1.陰茎骨解剖と準備

1. 関連する制度動物実験委員会（IACUC）が定めたプロトコルに従って、露出オーバー二酸化炭素を経由して性的に成熟した雄マウスを安楽死させます。
2. 仰臥位で動物を置き、そして包皮開口部に横方向の親指で圧力を加えることによってペニスを長引かせます。
3. ペニスが長引くされたら、できるだけ包皮を通じて組織を拡張します。
4. はさみで、陰茎骨が常駐亀頭に陰茎体の近位をカット。
5. 1.7 mLのチューブに解剖ペニスを転送し、200μLの水道水を追加します。ペニスが完全に液体中に浸漬されていることを確認してください。
6. 3〜5日間〜50℃の水で組織をインキュベートします。
7. キャップオープンで新しいマイクロチューブに解剖陰茎骨を置きます。骨を乾燥するために開いたO / Nキャップを残します。

2.マイクロCTスキャン

1. 花屋の泡のシリンダーを作成する花屋フォームのレンガにマイクロCTスキャン円筒状のホルダーを押してください。
2. 花屋の泡のシリンダーを抽出し、2〜5センチメートル厚い〜スライスを切ります。
3. スキャン中の干渉を最小限に抑えるために、個々のスライスの周囲に、花屋の泡の中に乾燥のbaculaを押してください。骨の正確な方向は、プロトコル4で個々の試験片の適切な識別を可能に留意すべきです。
4. そっとマイクロCTホルダーに埋め込まれた骨でスライスを配置します。
5. マイクロCTスキャンを取得します。マウスのbacula ¹⁴の場合

3.マイクロCT処理：シングル.xyzというファイルへの.DCMスタックの変換

注：各マイクロCTスキャンが.DCMのスタック、または「DICOM」、オブジェクトを介して撮影した画像スライスを表すファイルを生成します。 -5000（黒）から5000までの範囲は、各画素のx、y、z座標、およびピクセルの強度 - すべての下流の計算幾何学は、単に4つの列を含むテキストファイルですフラット.xyzというファイルを必要とし、 （白）。 3000上記画素閾値は、一般的に骨を定義するための閾値として適しています。

1. パイソン（www.python.org）とPythonモジュールコマンド、DICOM、PYLAB、SYS、およびnumpyのをインストールします。
2. オープン "01_pr任意のテキストエディタでocess_dicom.py「{Figshare}。変数セクション、変更パス、ピクセルのしきい値、および必要に応じてディレクトリ名の下に。
3. 「Pythonの01_process_dicom.py」を実行します。進捗状況は、画面に出力されます。ステップ3.2で指定された各ディレクトリ内に、新しいファイルの名前は作られて、例えば、PT3000は、画素閾値を示しdirectory_name.PT3000.xyzは、ステップ3.2に示されています。

4.マイクロCT処理：セグメント化アウト個々の標本.xyzというファイル

1. ライブラリRGLとR（https://www.r-project.org/）をインストールします。
2. 任意のテキストエディタでファイル '02_segment_dicoms.r' {Figshare}を開きます。変数セクションの下で、上記プロトコル3で作成した.xyzというファイルを指すようにパス名を変更します。
3. Rの中から、（二重引用符なし）コマンド "ソース（ '02_segment_dicoms.rを'）"を実行します。
4. プロトコル3で作成した.xyzというファイルの3次元画像の後に表示され、numbeを入力します。全体的な.xyzというファイル内の標本のR。そして、スクロールやズーム機能を使用して、各試料からのポイントにラベルを付け、選択します。
   注：背景には、別々の.xyzというファイルが各試験片について説明します。これらは、例えば、というディレクトリにPT3000は、画素閾値が使用示しXYZ_FILES_PT3000、表示されます。

5.共通の座標に試料.xyzというファイルを「整列」。

1. 「rotate_translate_cylindrical」（https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform）：追加のモジュールmattdean_modules.py {Figshare}、ならびに2自立のアプリケーションを必要とするPythonスクリプト「03_transform.py "{Figshare}を開きそして「qconvex」（www.qhull.org/html/qconvex.htm）このスクリプトによって使用されています。
2. 変数セクションの下で、rotate_pathとqconvex_dirをmattdean_modules.pyするフルパス名を識別します。また、個々の.xyという形式を含むディレクトリへのフルパスを識別ステップ4で作成したzのファイル。
3. 03_transform.pyを実行し、サフィックス.TRANSFORMED.xyzで試料ごとに新しいファイルを作成します。

6.「スライス」は、セミのランドマークを特定するためにファイル.xyzという試験片を整列します。

1. オープンとPythonスクリプト「04_identify_landmarks.py "{Figshare}を実行します。変数セクションでは、.TRANSFORMED.xyzファイルを含むディレクトリへのフルパス名を識別します。このスクリプトは、構造のサイズおよび形状を定量化するために使用することができる802半ランドマークを識別する。

Representative Results

議定書6で製造した半ランドマークのxyzの座標が直接、任意のランドマークベースの幾何学的形態計測解析¹⁷にインポートすることができます。上記の計算のパイプラインは、マウスのbacula ¹⁴と同様に、クジラ骨盤や肋骨の骨^16を研究するために適用されています。半ランドマークの計算定義についての詳細は、研究者が興味のある特定のオブジェクトに対応するために修正されるかもしれません手順を視覚化する試みで、ここに提示されています。陰茎骨は、特定の変換を自動化するために悪用されたいくつかのユニークな機能が含まれています。例えば、計算近位 - 遠位軸に沿って半分に骨を切断した後、我々は単にポイントの合計数（近位以上を有する）を比較することにより、近位の半分を同定しました。限りこのようなユニークな特徴が存在するとして、私たちの方法は、任意に適応すべきですオブジェクト。また、我々が経験的に、そのような私たちの陰茎骨の研究でよく実行される「10％の近位」などの特定の閾値を決定することを強調したが、最も確かに他のオブジェクトのために再評価する必要がありますする必要があります。

議定書5に始まり、最初の計算ステップは遠い離れている2つの点を識別するために、凸包（サンプル内の他のすべての点を含む点の最小セット）を計算することです。この2点（赤球、 図1C）は 、骨を介して近位-遠位を実行し、新しいz軸（赤線、 図1C）を定義し始めます。陰茎骨の場合には、より多くのポイントを含むポイントクラウドの半分は、近位端と定義されます。

第二に、全体のポイントクラウドは、近位点が0,0,0のZ座標と遠位点t、X、Yを取るように変換され、+ zは骨の大きさに依存し、いくつかの正の値である0,0、+ zの、のx、y、z座標上のakes。このステップの最後で、z軸は、骨の長さを通過します。以下の手順については、最大のz座標までの最小からの長さはZlengthと呼ぶことにします。

第三に、上記で特定近位および遠位点の正確な配置、10％、最も近位と最も遠位のポイントが別々にサンプリングされた10％に関連する分散を補正するために（ 図1D）は 、それぞれの重心を特定（赤球を、 図1E）ポイントクラウドは、近位重心は0,0,0であり、および遠位重心は、試料（赤線、 図1E）の中心を通る新たなZ軸と、0,0、+ Zであるように、形質転換します。

第四に、点群は、第SLICをとることによって、z軸の周りに回転させます構造の近位15 15.25％のZlength（青点、 図1E）の点の電子。ポイントのこのスライスは、z寸法（ すなわち z座標が単に無視される）、撮影した凸包、および計算された最小外接長方形（他のすべての点を含む最小の矩形）で平坦化されます。この最小境界矩形の二つの短辺の中点を結ぶ線を想像してみてください。これら二つの中点は-x、0になり、+ zおよび+ X、0、+ zは、それぞれ、このように、この行は、新しいx軸になるまで、私たちは、点群を回転させます。形質転換後、最大及び最小のxの値との間の距離をXlengthと呼ばれます。新しいファイルがspecimen.xyzからspecimen.TRANSFORMED.xyzに作成されます。

第五に、z軸の1％Xlength内のポイントは（青点、 図1F）を切り出し、この中央SLから識別された単一の最も近位および単一の最も遠位のポイントされていますそれぞれ氷とラベルされた遠位端と近位、。これらは、同定された最初の2つの半目印です。

第六に、ポイントの50の等間隔のスライスは、z軸（赤点、 図1G）に沿ってサンプリングされています。各スライスは、1％Zlengthの厚さです。各スライスは、その後、z次元で平らにし、7本の縦線（赤線、 図1H）によって均等に分割されています。各行の2％Xlength内のポイントは、最大と最小のy座標を持つ点が、それぞれ、保た各ライン上に投影し、腹側と背側のラベルが付いています、（赤点、 図1H）に保持されています。また、ラベルは、スライス番号と行番号を含む、例えばP15_VENTRAL4 15 ^番目のスライスの4 ^番目の垂直ラインからサンプリング腹点です。重要なのは、標識されたすべてのポイントは、例えば、P15_VENTRAL4は、corresを維持し、全ての検体全体で一度だけ発生しますpondence。 7行（14半ランドマーク合計）のそれぞれの腹側と背側のポイントに加えて、最大値と最小x値を持つ点は、それぞれ、サンプリングされ、左右のラベルが付いています。左右のyおよびz座標が16半ランドマークの合計は、スライス（赤球、 図1H）ごとに定義され、陰茎骨のためにRのLOWESS関数を用いて平滑化されています。 50スライスを加えた上で定義された近位および遠位半のランドマークで、802半のランドマークは、試料（緑の球、 図1I）ごとにサンプリングされます。オリジナルのマイクロCTスキャンから他のすべての点は破棄されます。

腹側/背側と近位/遠位の極性を数学的に決定されたが、すべての試験片のアラインメントは、目視で確認し、必要に応じて手動で調整することがなお。 369のBaculaの私たちのサンプルでは、​​約10手動で調整する必要がありました。

図1： 計算ワークフロー（プロトコル4-6）を視覚的に表現したもの。 （A）は、個々の試験片に明確な点群の割り当てを示す02_segment_dicoms.rスクリプト（プロトコル4）からのスクリーンショット、。 〜100K xyzのポイントの雲によって表される（B）1陰茎骨の拡大図、。遠く離間（赤い球）から（C）は、2つの点の同定、骨（赤線）を介して近位-遠位実行新しいz軸を定義するために使用されます。 （D）最も近位の10％をサンプリングし、点（赤点）の最も遠位の10％が、z軸の正確な配置のわずかな差異を調整するための手段を提供します。 （E）最も近位の10％と最も遠位の10％（赤球）の重心は、新しいz軸（赤線）を定義するために使用されます。そして、ポイントのスライスが1の間に入りますこの新たなZ軸（青い点）5.00〜15.25％の外接矩形を算出するために取られます。ポイントクラウドは、外接矩形の長辺は、新しいx軸に平行になるまで回転されます。 F）正中線（青点に沿って走る点のスライス）がサンプリングされ、最も近位と最も遠位のポイントは半ランドマークとして定義されました。 G）のポイントの50等間隔のスライスは、そのようなスライスを示すHと（赤点）、）サンプリングされます。 16点（赤丸）は、各スライスの輪郭を捕捉するために定義されています。 I）の構造を定義し、すべての下流の形態計測用途に使用されている）、すべてのスライスにわたって802半ランドマーク（緑の球の合計を繰り返します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

上記のプロトコルにおける重要なステップ1である）のbaculaを解剖、2）マイクロCT画像を収集し、3）5）に各検体を変換する、4）各標本のポイントクラウドをセグメント化、XYZ座標のフラットファイルにマイクロCTの出力を変換します標準化された座標系、及び6）半ランドマークを規定します。これらの手順は、容易に別のオブジェクトを収容するように変更されます。

これらの方法は、可能性が本質的に「棒状」、又は少なくともあまりにも湾曲している任意のオブジェクトに適用することができます。バック自体上の曲線は（ 図1G）スライスすると、オブジェクトの異なる部分から点を返しますので、「U字型」は現在、分析することはできませんになるためのオブジェクト。このようなオブジェクトは、計算前のスライスにオブジェクトを矯正することにより、将来的に収容することができました。

私たちは、数学のを欠いた形状から半ランドマークを定義するための一般的な方法を提示していますランドマークオリッ。これらの一般的な方法は非常に異なる形状を有しクジラ骨盤や肋骨の骨¹⁶の進化を研究するために変更されました。ランドマークを定義するための我々の計算方法がxyz座標のいずれかのシリーズに適用可能であるべきです。我々は、マウスのbacula ¹⁴の小型与えられ、ここではマイクロCTスキャンを採用しました。このようなクジラ骨盤や肋骨の骨のようなより大きな骨、のために、私たちは骨¹⁶の表面を再構築し、レーザースキャナを採用しました。視覚的方法の品質を確認するために、半ランドマークのすべてのセットを検査することが重要です。我々の計算方法の主な利点は、それらが正確にサイズおよび形状変化を定量化し、物体の異なる領域との対応関係を維持することです。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting scissors	VWR	470106-338	Most sizes should work
Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved	VWR	82027-406
1.7 mL microcentrifuge tube	VWR	87003-294
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	CAS 64-17-5	To be diluted to 70% for dissections
Floral Foam	Wholesale Floral	6002-48-07
uCT50 scanner	Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland