Disseksjon, MicroCT skanning og Morfometriske Analyser av baculum

Summary

Mange biologiske strukturer mangler lett definerbare landemerker, noe som gjør det vanskelig å anvende moderne morfometriske metoder. Her illustrerer vi metoder for å studere mus baculum (et ben i penis), inkludert disseksjon og microCT skanning, etterfulgt av beregningsmetoder for å definere semilandemerker som brukes til å kvantifisere størrelse og form variasjon.

Abstract

Moderne morphometrics gir kraftige metoder for å kvantifisere størrelse og form variasjon. En grunnleggende kravet er en liste over koordinater som definerer landemerker; Men slike koordinater må representere homologe strukturer på tvers av prøver. Mens mange biologiske objekter består av lett identifiseres landemerker for å tilfredsstille den forutsetningen av homologi, mange mangler slike strukturer. En mulig løsning er å matematisk sted semilandemerker på et objekt som representerer samme morfologiske region på tvers av prøver. Her illustrerer vi en nylig utviklet rørledning til matematisk definere semilandemerker fra mus baculum (penis bein). Våre metoder bør være knyttet til et bredt spekter av stedene.

Introduction

Feltet av morphometrics omfatter et mangfold av fremgangsmåter for å kvantifisere størrelsen og formen av den biologiske form, en grunnleggende trinn i vitenskapelige undersøkelser ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Tradisjonelt har statistisk analyse av størrelsen og formen begynner ved å identifisere landemerker på en biologisk struktur, og deretter måling av lineære avstander, vinkler og forhold, som kan bli analysert i en multivariat rammeverk. Landmark-baserte geometriske Morphometrics er en tilnærming som beholder den romlige plasseringen av landemerker, bevare geometrisk informasjon fra datainnsamling gjennom analyse og visualisering ^5. Generalisert Procrustes Analysis (GPA) kan brukes til å fjerne variasjon i plasseringen, målestokk, og rotasjon av landemerker for å fremstille en innretting mellom prøver som minimizes sine squared forskjeller - det som gjenstår er formen ulikhet ^7.

Et viktig konsept i alle morfometrisk analyse er homologi, eller ideen om at man med sikkerhet kan identifisere landemerker som representerer biologisk betydningsfulle og diskrete funksjoner som tilsvarer mellom prøver eller strukturer. For eksempel, hodeskaller har homologe prosesser, foramina, sting, og kanaler som kan gjøre morfometriske analyser. Dessverre, er identifiseringen av tilsvarende landemerker vanskelig i mange biologiske strukturer, særlig de med glatte flater eller kurver ^{8, 9, 10.}

Vi nærmer oss dette problemet nedenfor ved hjelp av beregnings geometri. Den generelle arbeidsflyten er å generere en tredimensjonal skanning av objekt som kan representeres som en sky av punkter, og deretter rotere og forvandle det punktsky slik at alle specimens er orientert i et felles koordinatsystem. Da vi matematisk definerer semilandemerker fra bestemte områder av gjenstanden. Diskret semilandemerker plasseres på slike områder er biologisk vilkårlig ^11. Gjennomføring GPA og påfølgende statistiske analyser kan gi uønskede gjenstander ^{8, 12} fordi vilkårlig plassert landemerker ikke kan være biologisk homolog. Derfor lar vi disse semilandemerker matematisk "slide". Denne fremgangsmåten reduserer den potensielle forskjell mellom strukturer. Som hevdet andre steder skyve algoritmen som brukes her er hensiktsmessig å kvantifisere lignende anatomiske regioner som mangler lett identifiseres tilsvarende landemerker ^{3, 6, 8, 10, 11, 12.} Disse metodene har sine limitations ^13, men bør kunne tilpasses til gjenstander av forskjellig størrelse og form.

Her viser vi hvordan denne metoden ble brukt i en fersk studie av mus baculum ^14, et bein i penis som har blitt vunnet og tapt flere uavhengige ganger i løpet av pattedyr evolusjonen ^15. Vi diskuterer disseksjon og utarbeidelse av en bestemt bein, den baculum (protokoll 1), generering av microCT bilder (protokoll 2), og konvertering av disse bildene til et format som gjør at alle nedstrøms beregnings geometri (Protokoller 3 og 4). Etter disse trinnene, er hver prøve representert ved ~ 100K xyz-koordinater. Vi deretter gå gjennom en rekke transformasjoner som effektivt justere alle prøvene i en felles orientering (protokoll 5), deretter definere semilandemerker fra justert prøver (Protocol 6). Protokoller 1-4 bør være like, uavhengig av objektet som blir analysert. Protokoll 5 og protokoll 6 er specifically designet for en baculum, men det er vårt håp at ved detaljering disse trinnene, kan etterforskerne tenke modifikasjoner som vil være relevant for deres objekt av interesse. For eksempel ble modifikasjoner av disse metodene brukes til å studere hvalbekkenbein og ribbein bein ^16.

Protocol

Alle prosedyrer og personell ble godkjent av University of Southern California Institute for Animal Care og bruk Committee (IACUC), protokoll # 11394.

1. baculum Dissection og klargjøring

1. Avlive en kjønnsmoden hann mus via karbondioksidovereksponering, i henhold til protokoller fastsatt av relevant Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).
2. Lå dyret i liggende stilling, og protract penis ved å legge press med tommelen lateralt for den dele seg åpningen.
3. Når penis er langvarig, strekker vevet gjennom forhuden så langt som mulig.
4. Med saks, klippe penile kroppen proksimale til glans penis der baculum bor.
5. Overfør dissekert penis til en 1,7 ml tube og tilsett 200 mL vann fra springen. Vær sikker på at penis er helt nedsenket i væsken.
6. Inkuber vev i vann ved ~ 50 ° C i 3-5 dager.
7. Plasser dissekert baculum inn i et nytt mikrosentrifugerør med lokket åpent. Legg igjen lokket åpent O / N for å tørke ut beinet.

2. MicroCT Skanning

1. Trykk på en microCT scan sylindrisk holder inn i en murstein av blomsterhandler skum for å skape en sylinder av blomsterhandler skum.
2. Pakk ut sylinder av blomsterhandler skum og skjære skiver ~ 2-5 cm tykk.
3. Push tørket Bacula inn i blomsterhandler skum, rundt omkretsen av en enkelt skive for å minimalisere interferens under skanning. Den nøyaktige orientering av bein bør bemerkes at for riktig identifisering av enkelteksemplarer i protokoll 4.
4. Forsiktig stykket med den innebygde bein inn i microCT holderen.
5. Acquire microCT skanninger. I tilfelle av mus Bacula ¹⁴

3. MicroCT Processing: Konvertere en .DCM Stack til en enkelt .xyz fil

MERK: Hver microCT scan produserer en bunke med .DCM, eller "DICOM", filer som representerer bildesnitt tatt gjennom objektet. All nedstrøms beregnings geometri krever flate .xyz filer, som er ganske enkelt en tekstfil som inneholder fire kolonner - x, y og z koordinatene for hver piksel, og intensiteten av piksler, som strekker seg fra -5000 (svart) til 5000 (hvit). En piksel terskel over 3000 vanligvis fungerer godt som en terskel for å definere bein.

1. Installer Python (www.python.org) og Python moduler kommandoer, DICOM, PYLAB, SYS, og NUMPY.
2. Open "01_process_dicom.py "{Figshare} med et tekstredigeringsprogram. Under avsnittet Variabler, endre bane, pixel terskler, og katalognavn som nødvendig.
3. Kjør "python 01_process_dicom.py". Progress blir skrevet til skjermen. Innenfor hver katalog med navnet i trinn 3.2, er en ny fil gjort kalt; for eksempel, directory_name.PT3000.xyz, hvor PT3000 indikerer pikselen terskel som er angitt i trinn 3.2.

4. MicroCT behandling: Segmentering ut individuelle prøven .xyz filer

1. Installer R (https://www.r-project.org/) med biblioteket RGL.
2. Åpne filen '02_segment_dicoms.r' {Figshare} med tekst editor. Under variabler, endre banenavnet til å peke på .xyz fil opprettet i protokoll 3 ovenfor.
3. Fra i R, kjøre kommandoen "source ( '02_segment_dicoms.r')" (uten anførselstegn).
4. Etter tredimensjonalt bilde av .xyz fil opprettet i protokoll 3 vises, skriver number av prøver i den samlede .xyz filen. Deretter merke og velg poeng fra hver prøve ved hjelp av rulle og zoom-funksjoner.
   MERK: I bakgrunnen, vil separate .xyz filer gjøres for hver prøve. Disse vises i en katalog med navnet, for eksempel, XYZ_FILES_PT3000, hvor PT3000 indikerer pixel terskelen brukt.

5. "Justere" Prøve .xyz filer til felles koordinater.

1. Åpne Python script "03_transform.py" {Figshare}, noe som krever ekstra modul mattdean_modules.py {Figshare}, samt to selvstående programmer: "rotate_translate_cylindrical" (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) og "qconvex" (www.qhull.org/html/qconvex.htm) som brukes av dette skriptet.
2. Under variabler, identifisere de fullstendige banenavn til mattdean_modules.py, rotate_path og qconvex_dir. I tillegg identifiserer den fullstendige banen til katalogen som inneholder den enkelte .xyz filer som er opprettet i trinn 4.
3. Kjør 03_transform.py, noe som skaper en ny fil per eksemplar med suffikset .TRANSFORMED.xyz.

6. "kutting" innrettet Prøve .xyz filer å identifisere Semilandemerker.

1. Åpne og kjøre Python script "04_identify_landmarks.py" {Figshare}. I variabler, identifisere fulle banenavn til katalogen som inneholder .TRANSFORMED.xyz filer. Dette skriptet identifiserer 802 semilandemerker som kan brukes til å kvantifisere størrelsen og formen av strukturen.

Representative Results

Xyz koordinater semilandemerker som produseres i protokoll 6 kan importeres direkte inn i en landemerke-baserte geometriske morphometrics analyse ^17. Beregnings rørledningen ovenfor har blitt brukt til å studere mus Bacula ^14, samt hval bekken og ribbein bein ^16. Flere detaljer om beregnings definisjonen av semi-landemerker er presentert her, i et forsøk på å hjelpe forskere å visualisere tiltak som kan endres for å imøtekomme deres spesielle objekt av interesse. Den baculum inneholder flere unike funksjoner som ble utnyttet til å automatisere visse transformasjoner. For eksempel, etter beregnings skjæring benet i to halvdeler langs en proksimal distal-aksen, identifiserte vi den proksimale halvdel simpelthen ved å sammenligne det totale antall punkter (det proksimale har mer). Så lenge det finnes unike funksjoner som dette, bør våre metoder kunne tilpasses allegjenstand. I tillegg bør det understrekes at vi empirisk bestemt visse terskler, for eksempel "10% proksimale" at gode resultater i våre baculum studier, men absolutt må vurderes på nytt for andre objekter.

Starten i protokoll 5, er den første beregningstrinn for å beregne det konvekse skrog (den minste sett av punkter som inneholder alle andre punkter i en prøve) for å identifisere de to punkter som er lengst fra hverandre. Disse to punkter (røde kuler, Figur 1C) begynner å definere en ny z-aksen (rød linje, figur 1C) som løper proksimale-distale gjennom benet. I tilfellet med den baculum, blir halvparten av punktskyen som inneholder flere punkter definert som den proksimale enden.

For det andre er hele punktskyen omformet slik at den proksimale punktet tar på x, y, z-koordinater for 0,0,0 og den fjerntliggende punkt tAKES på x, y, z koordinatene til 0,0, + z, hvor z + er noen positiv verdi avhengig av størrelsen av benet. Ved slutten av dette trinn, passerer en z-aksen gjennom lengden av benet. For fremgangsmåten nedenfor, vil lengden fra minimum til maksimum z-koordinater bli referert til som Zlength.

For det tredje, for å korrigere for avvik i forbindelse med den nøyaktige plassering av de proksimale og distale punkter som er identifisert ovenfor, har 10% mest proksimale og 10% mest distale punkter blir samplet hver for seg (figur 1 D), deres respektive centroids identifisert (røde kuler, figur 1E) og punktskyen transformert slik at den proksimale Tyngdepunktet er 0,0,0, og den distale Tyngdepunktet er 0,0, + z, med en ny z-aksen som passerer gjennom senteret av prøven (rød linje, figur 1E) .

For det fjerde er det punktskyen roteres rundt z-aksen ved først å ta et SLICe av punktene i den proksimale 15 til 15,25% Zlength av strukturen (blå punkter, figur 1E). Denne bit av punktene er flat i z dimensjon (dvs. z-koordinatene er rett og slett ignorert), den konvekse skroget tatt, og minimum markerings rektangel (den minste rektangel som inneholder alle andre punkter) beregnet. Tenk deg en linje som forbinder midtpunktene av de to kortsidene av denne minimumsmarkerings rektangel. Vi rotere punktskyen til disse to midtpunkt blir -x, 0, + z og + x, 0, + z, henholdsvis, og dermed denne linje blir en ny X-aksen. Etter transformasjon, blir avstanden mellom de maksimale og minimale x-verdier referert til som Xlength. En ny fil opprettes fra specimen.xyz til specimen.TRANSFORMED.xyz.

Femte, påpeker innen 1% Xlength av z-aksen er skiver ut (blå punkter, figur 1F), og den mest proksimale og mest distale punktet som ble identifisert fra dette sentrale slis og merket fjerne og nære, respektivt. Dette er de to første semilandemerker identifisert.

Sjette, er 50 jevnt fordelt skiver av punktene samplet langs z-aksen (røde punkter, figur 1G). Hver skive er en tykkelse på 1% Zlength. Hver skive deretter flatet i z dimensjon, og delt likt med 7 vertikale linjer (røde linjer, Figur 1 H). Punkter innenfor 2% Xlength av hver linje holdes (røde punkter, Figur 1 H), da poengene med maksimum og minimum y-koordinat holdes, projisert på hver sin linje, og merket henholdsvis ventral og DORSAL,. I tillegg etiketter inneholder stykket nummeret og linjenummer, for eksempel P15_VENTRAL4 er ventral punktet samplet fra ^4. vertikal linje med ^15. skive. Viktigere, hvert punkt merket, for eksempel P15_VENTRAL4 skjer en gang og bare én gang på tvers av alle prøvene, bevare tilsvpondence. I tillegg til de ventral og dorsal poeng i hver av de 7 linjer (14 semilandemerker totalt), blir poengene med maksimum og minimum x-verdi samplet og merket henholdsvis venstre og høyre,. Y og z-koordinatene til venstre og høyre er glattet ved hjelp av lowess funksjon i R. For baculum er totalt 16 semilandemerker definert per skive (røde kuler, figur 1 H); med 50 skiver samt de proksimale og distale semilandemerker som er definert ovenfor, er 802 semilandemerker samples per prøve (grønne kuler, figur 1i). Alle andre punkter fra den opprinnelige microCT skanningen blir forkastet.

Det skal bemerkes at selv om ventral / dorsale og proksimale / distale polaritet ble bestemt matematisk, ble alle prøve justeringer visuelt klare, og manuelt justert etter behov. I vår prøve av 369 Bacula, omtrent 10 måtte justeres manuelt.

Figur 1: visuell representasjon av Computational Workflow (Protocol 4-6). (A) En skjermdump fra 02_segment_dicoms.r script (protokoll 4), som viser tildeling av forskjellige punktskyer til individuelle prøver. (B) Forstørret visning av en baculum, representert ved en sky av ~ 100K xyz poeng. (C) Identifisering av de to punktene lengst bort fra hverandre (røde kuler), som brukes for å definere en ny z-aksen som går proksimale-distale gjennom benet (rød linje). (D) Prøvetaking den proksimale-høyst 10%, og mest distale 10% av punkter (røde punkter) tilveiebringer et middel for å justere for liten variasjon i den nøyaktige plassering av z-aksen. (E) De centroids av de proksimale-høyst 10% og mest distale 10% (røde kuler) brukes for å definere en ny z-aksen (rød linje). Så, en bit av punktene faller mellom en5,00 til 15,25% av denne nye z-aksen (blå punkter) er tatt for å beregne minimum avgrensende rektangelet. Punktskyen blir rotert inntil langsiden av den minimale avgrensende rektangel er parallell med en ny x-aksen. F) et stykke av punkter som løper langs midtlinjen (blå punkter) blir samplet og den proksimale-distale mest og rste punkt som er definert som en semi-fjell. G) 50 jevnt fordelt skiver av punktene er samplet (røde punkter), med H) som viser en slik skive. 16 poeng (røde sirkler) er definert til å fange omrisset av hver skive. I) Når gjentatt på tvers av alle skiver, totalt 802 semi-landemerker (grønne kuler) definerer strukturen og brukes i alle nedstrøms morfometriske applikasjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

De kritiske trinn i ovennevnte protokoll er 1) dissekere Bacula, 2) samle microCT bilder, 3) konvertere microCT utgang til en flat fil av xyz koordinater, 4) segmentere ut hver prøve sin punktsky, 5) trans hver prøve til et standardisert koordinatsystem, og 6) som avgrenser semi-landemerker. Disse trinnene er enkelt endres for å imøtekomme ulike stedene.

Disse metodene kan sannsynligvis anvendes på hvilket som helst objekt som er i det vesentlige "stavformet", eller i det minste ikke for buet. Objekter som kurven tilbake på seg selv for å bli "U-formet" kan derfor ikke analysert, fordi kutting (figur 1G) vil returnere poeng fra forskjellige deler av objektet. Slike gjenstander kan bli innkvartert i fremtiden ved beregningsmessig å rette objektet før slicing.

Vi har presentert en generell metode for matematisk definersemilandemerker fra figurer som mangler sOlid landemerker. Disse generelle metoder har blitt modifisert for å studere utviklingen av hval bekken og ribbebein ^16, som har svært forskjellige former. Våre beregningsmetoder for å definere landemerker bør være aktuelt for noen serier av xyz koordinater. Vi ansatt microCT scanning her, gitt den lille størrelsen på muse Bacula ^14. For større bein, slik som hval bekken og ribbebein, ansatt vi en laserskanner som rekonstruerte overflaten av bein ^16. Det er viktig å visuelt inspisere alle sett av semi-landemerker for å kontrollere kvaliteten av fremgangsmåten. Den største fordelen med våre beregningsmetoder er at de nøyaktig kvantifisere størrelsen og formen variasjon, og bevare korrespondansen mellom forskjellige regioner av objektet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting scissors	VWR	470106-338	Most sizes should work
Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved	VWR	82027-406
1.7 mL microcentrifuge tube	VWR	87003-294
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	CAS 64-17-5	To be diluted to 70% for dissections
Floral Foam	Wholesale Floral	6002-48-07
uCT50 scanner	Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland