Dissekering, microCT skanning och Morfometriska Analyser av Penisben

Summary

Många biologiska strukturer saknar lätt definierbara landmärken, vilket gör det svårt att tillämpa moderna morfometriska metoder. Här illustrerar vi metoder för att studera musen Penisben (ett ben i penis), inklusive dissekering och microCT scanning, följt av beräkningsmetoder för att definiera semilandmärken som används för att kvantifiera och storlek variation.

Abstract

Moderna Morfometri erbjuder kraftfulla metoder för att kvantifiera storlek och form variation. Ett grundläggande krav är en lista över koordinater som definierar landmärken; Men sådana koordinater måste representera homologa strukturer över prover. Medan många biologiska objekt består av lätt identifierade landmärken för att tillgodose antagandet av homologi, många saknar sådana strukturer. En möjlig lösning är att matematiskt plats semilandmärken på ett objekt som representerar samma morfologiska region över prover. Här visar vi en nyutvecklad pipeline till matematiskt definiera semilandmärken från mus Penisben (penis ben). Våra metoder bör vara tillämplig på ett brett spektrum av föremål.

Introduction

Området Morfometri omfattar en mångfald av metoder för att kvantifiera storleken och formen av den biologiska formen, ett viktigt steg i vetenskaplig undersökning ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Traditionellt, den statistiska analysen av storlek och form börjar med att identifiera landmärken på en biologisk struktur, och sedan mäta linjära avstånd, vinklar och nyckeltal, som kan analyseras i en multivariat ram. Landmärke baserade geometriska Morfometri är en metod som behåller den rumsliga positionen för landmärken, bevara geometrisk information från datainsamling via analys och visualisering ^5. (GPA) generaliserad Procrustes Analys kan tillämpas för att avlägsna variationer i läge, skala och rotation av landmärken för att producera en inriktning mellan exemplar som Minimizes deras kvadrat skillnader - det som återstår är formen olikhet ^7.

Ett viktigt begrepp i någon morfometrisk analys är homologi, eller tanken att en tillförlitligt kan identifiera landmärken som representerar biologiskt meningsfulla och diskreta funktioner som motsvarar mellan prover eller strukturer. Till exempel, mänskliga skallar har homologa processer, fora, suturer, och kanaler som kan göra det möjligt för morfometriska analyser. Olyckligtvis är det svårt i många biologiska strukturer identifiering av motsvarande landmärken, särskilt de med släta ytor eller kurvor ^{8, 9, 10.}

Vi närmar oss detta problem under användning av beräkningsgeometri. Det generella arbetsflödet är att generera en tredimensionell avsökning av föremål som kan betecknas som ett moln av punkter, och sedan rotera och omvandla det punktmoln så att alla ärpecimens är orienterade på ett gemensamt koordinatsystem. Då kan vi matematiskt definiera semilandmärken från specifika regioner av objektet. Diskreta semilandmärken placeras på sådana områden är biologiskt godtyckliga ^11. Genomföra GPA och efterföljande statistiska analyser kan ge oönskade artefakter ^{8, 12} eftersom godtyckligt placerade landmärken inte kan vara biologiskt homolog. Därför tillåter vi dessa semi-landmärken för att matematiskt "slide". Detta förfarande minimerar potentialskillnaden mellan strukturer. Såsom hävdats annorstädes glid algoritm som används här är lämpligt att kvantifiera liknande anatomiska regioner som saknar lätt identifieras motsvarande landmärken ^{3, 6, 8, 10, 11, 12.} Dessa metoder har sin limitations ^13, men bör vara anpassningsbar till föremål av olika storlek och form.

Här visar vi hur denna metod tillämpades i en nyligen genomförd studie av musen Penisben ^14, ett ben i penis som har fått och förlorade flera oberoende gånger under däggdjurs utveckling ^15. Vi diskuterar dissekering och framställning av en särskild ben, den Penisben (protokoll 1), generering av microCT bilder (protokoll 2), och omvandlingen av dessa bilder till ett format som gör det möjligt för alla nedströms beräkningsgeometri (protokoll 3 och 4). Efter dessa steg, varje prov representeras av ~ 100K xyz-koordinater. Vi går sedan genom en serie av transformationer som effektivt anpassa alla prover till en gemensam orientering (protokoll 5), sedan definiera semilandmärken från inriktade exemplar (protokoll 6). Protokollen 1-4 bör vara densamma oberoende av det objekt som analyseras. Protokoll 5 och protokoll 6 är specifically konstruerad för en Penisben, men det är vår förhoppning att genom att specificera dessa steg, kan utredarna tänka sig modifikationer som skulle vara relevanta för deras objekt av intresse. Till exempel har modifieringar av dessa metoder som används för att studera valar bäckenben och revbenen ^16.

Protocol

Alla förfaranden och personal godkändes av University of Southern California Institute for Animal Care och användning kommittén (IACUC), protokoll # 11394.

1. Penisben Dissection och förberedelse

1. Avliva en könsmogna hanmus via koldioxid överexponering, enligt protokoll som anges av den berörda Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC).
2. Låg djuret i ryggläge, och förhala penis genom applicering av tryck med tummen lateralt om preputial öppningen.
3. När penis utdragna förlänga vävnaden genom förhuden så långt som möjligt.
4. Med sax, klippa peniskroppens proximala till ollonet där Penisben bosatt.
5. Överför dissekerade penis till en 1,7 ml rör och tillsätt 200 mikroliter kranvatten. Se till att penis är helt nedsänkt i vätskan.
6. Inkubera vävnaden i vatten vid ~ 50 ° C under 3-5 dagar.
7. Placera dissekerade Penisben in i ett nytt mikrocentrifugrör med locket öppet. Lämna locket öppet O / N för att torka ut benet.

2. microCT Scanning

1. Tryck på en microCT scan cylindrisk hållare i en tegelsten av florist skum för att skapa en cylinder med florist skum.
2. Utdrag cylinder florist skum och skär skivor ~ 2-5 cm tjock.
3. Tryck torkade bacula i blomsterskum, runt periferin av en enskild skiva för att minimera störningar under skanning. Den exakta orientering ben bör noteras möjliggör korrekt identifiering av enskilda prover i protokoll 4.
4. Placera försiktigt skivan med de inbäddade ben in i microCT hållaren.
5. Förvärva microCT skannar. I fallet med mus bacula ¹⁴

3. microCT Bearbetning: Konvertera en .DCM Stack för ett gemensamt .xyz fil

OBS: Varje microCT Scan ger en bunt .DCM, eller "DICOM", filer som representerar bildskivor som tagits genom objektet. Alla nedströms beräkningsgeometri kräver platta .xyz filer, vilket är helt enkelt en textfil som innehåller fyra kolumner - X, Y och Z-koordinaterna för varje pixel, och intensiteten i pixel, som sträcker sig från -5000 (svart) till 5000 (vit). En tröskelpixel över 3000 fungerar i allmänhet väl som en tröskel för att definiera ben.

1. Installera Python (www.python.org) och Python modulerna STYRNING, DICOM, PYLAB, SYS och numpy.
2. Öppna "01_process_dicom.py "{Figshare} med valfri textredigerare. Under avsnittet Variabler, ändra bana, trösklar pixel och katalognamn som behövs.
3. Köra "python 01_process_dicom.py". Framstegen kommer att skrivas ut till skärmen. Inom varje katalog som heter i steg 3,2, är en ny fil gjort som heter; till exempel, directory_name.PT3000.xyz, där PT3000 anger tröskelpixel anges i steg 3,2.

4. microCT bearbetning: Segmente ut enskilt prov .xyz filer

1. Installera R (https://www.r-project.org/) med biblioteket RGL.
2. Öppna filen "02_segment_dicoms.r {Figshare} med valfri textredigerare. Under avsnittet Variabler, ändra sökvägen för att peka på .xyz fil som skapats i protokoll 3 ovan.
3. Inifrån R, köra kommandot "källa (02_segment_dicoms.r)" (utan citationstecken).
4. Efter den tredimensionella bilden av .xyz fil som skapas i protokoll 3 visas anger number av prover i den totala .xyz filen. märka sedan och välja punkter från varje prov med hjälp av rullnings och zoomfunktioner.
   OBS: I bakgrunden, kommer separata .xyz filer göras för varje prov. Dessa visas i en katalog med namnet, till exempel, XYZ_FILES_PT3000, där PT3000 anger tröskelpixel används.

5. "Justera" Specimen .xyz filer till gemensam koordinater.

1. Öppna Python script "03_transform.py" {Figshare}, vilket kräver tilläggsmodul mattdean_modules.py {Figshare}, samt två fristående program: "rotate_translate_cylindrical" (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) och "qconvex" (www.qhull.org/html/qconvex.htm) som används av skriptet.
2. Under avsnittet Variabler identifiera de fullständiga sökvägar till mattdean_modules.py, rotate_path och qconvex_dir. Dessutom identifiera den fullständiga sökvägen till den katalog som innehåller den enskilda .xyz filer skapade i steg 4.
3. Kör 03_transform.py, vilket skapar en ny fil per prov med suffixet .TRANSFORMED.xyz.

6. "Skär" Inriktade Specimen .xyz filer för att identifiera Semilandmärken.

1. Öppna och köra Python script "04_identify_landmarks.py" {Figshare}. I avsnittet Variabler, identifiera fullständiga sökvägar till den katalog som innehåller de .TRANSFORMED.xyz filer. Detta skript identifierar 802 semilandmärken som kan användas för att kvantifiera storleken och formen av strukturen.

Representative Results

XYZ koordinater halvlandmärken som produceras i protokoll 6 kan importeras direkt in i någon landmärke baserade geometriska Morfometri analys ^17. Beräknings rörledning ovan har tillämpats för att studera mus bacula ^14, liksom whale pelvic och revbenen ^16. Mer information om beräknings definition av semi-landmärken presenteras här, i ett försök att hjälpa forskare att visualisera åtgärder som kan behöva modifieras för att passa deras särskilda objekt av intresse. Den Penisben innehåller flera unika funktioner som utnyttjas för att automatisera vissa transformationer. Till exempel, efter beräknings skära benet i två halvor längs en proximal-distal axel, identifierade vi den proximala hälften helt enkelt genom att jämföra det totala antalet poäng (proximala har mer). Så länge det finns unika funktioner som detta, bör våra metoder kunna anpassas till varjeobjekt. Dessutom bör det understrykas att vi empiriskt vissa tröskelvärden, t.ex. "10% proximal" som utvecklades väl under våra Penisben studier, men mest att behöva omprövas för andra objekt.

Med början i protokoll 5, är den första beräkningssteg för att beräkna den konvexa skrov (den minsta rad punkter som innehåller alla andra punkter i ett prov) för att identifiera de två punkter som är längst från varandra. Dessa två punkter (röda sfärer, Figur 1C) börjar att definiera en ny z-axeln (röd linje, Figur 1C) som körs proximal-distal genom benet. I fallet med den Penisben, är hälften av punktmolnet som innehåller fler punkter definieras som den proximala änden.

För det andra är hela punktmoln transformerad så att den proximala punkten tar på x, y, z-koordinater av 0,0,0 och den distala punkten takes på x, y, z-koordinaterna för 0,0, + z, där + z är några positivt värde beroende på storleken på benet. Vid slutet av detta steg, passerar en z-axeln genom längden av benet. För procedurerna nedan, kommer längden från lägsta till högsta z-koordinater betecknas som Zlength.

För det tredje, för att korrigera för variationer i samband med den exakta placeringen av de proximala och distala punkter som anges ovan, den mest proximala 10% och 10% mest distala punkter samplas separat (Figur 1D), deras respektive tyngd identifieras (röda sfärer, figur 1E) och punktmolnet transformerad så att den proximala centroid är 0,0,0, och den distala centroid är 0,0, + z, med en ny z-axeln som passerar genom centrum av provet (röd linje, figur 1E) .

För det fjärde är punktmolnet roteras runt z-axeln genom att först ta en SLICe av poäng i den proximala 15-15,25% Zlength av strukturen (blå punkter, figur 1E). Denna skiva poäng plattas i z-dimensionen (dvs z-koordinater ignoreras helt enkelt), den konvexa skrovet tas, och den minsta avgränsande rektangeln (den minsta rektangel som innehåller alla andra punkter) beräknas. Föreställa sig en linje som förbinder mittpunkterna på de två kortsidorna av detta minsta avgränsande rektangeln. Vi roterar punktmolnet förrän dessa två mittpunkter blir -x, 0, + z och + x,, respektive, blir 0, + z sålunda denna linje en ny x-axeln. Efter transformation, är avståndet mellan de maximala och minimala x-värden kallas Xlength. En ny fil skapas från specimen.xyz till specimen.TRANSFORMED.xyz.

För det femte pekar inom 1% Xlength av z-axeln skärs ut (blå punkter, figur 1F), och den enskilt mest proximala och enskilt mest distala punkten identifierats från detta centrala slis och märkt distala och proximala, respektive. Dessa är de första två halvlandmärken identifieras.

Sjätte, är 50 jämnt fördelade skivor av punkter samplas längs z-axeln (röda punkter, Figur 1G). Varje skiva är en tjocklek på 1% Zlength. Varje skiva är sedan plattas i z-dimensionen, och delas lika med 7 vertikala linjer (röda linjer, Figur 1H). Punkter inom 2% Xlength av varje rad hålls (röda punkter, figur 1H), då de punkter med den högsta och lägsta y-koordinat hålls, projiceras på respektive linje och märkt ventrala och dorsala respektive. Dessutom etiketter innehåller segmentet nummer och linjenummer, till exempel P15_VENTRAL4 är den ventrala punkt samplade från ^{4: e} vertikala linjen av den 15: ^e skiva. Viktigt är varje punkt märkt, t ex P15_VENTRAL4 inträffar en gång och endast en gång för alla prover, bevara motsvpondence. Förutom de ventrala och dorsala punkter var och en av de 7 raderna (14 semilandmärken totalt), är punkter med den högsta och lägsta x-värde samplas och märkt vänster och höger, respektive. Y och z-koordinaterna för vänster och höger jämnas med hjälp av lowess funktionen i R. För Penisben är totalt 16 semilandmärken definieras per skiva (röda sfärer, Figur 1 H); med 50 skivor plus proximala och distala semilandmärken som definierats ovan, är 802 semi-landmärken samplas per prov (gröna sfärer, figur 1I). Alla andra punkter från den ursprungliga microCT scan kasseras.

Det bör noteras att även om ventrala / dorsala och den proximala / distala polaritet bestämdes matematiskt, var alla prov anpassningar bekräftas visuellt och manuellt justeras vid behov. I vårt urval av 369 bacula, ungefär 10 måste justeras manuellt.

Figur 1: visuell representation av beräknings Workflow (Protokoll 4-6). (A) En skärmbild från 02_segment_dicoms.r manus (protokoll 4), visar tilldelningen av olika punktmoln till enskilda exemplar. (B) Förstorad bild av en Penisben, som representeras av ett moln av ~ 100K xyz punkter. (C) Identifiering av de två punkterna längst från varandra (röda sfärer), som används för att definiera en ny z-axeln som löper proximal-distal genom benet (röd linje). (D) Provtagning den proximala-mest 10% och mest distala 10% av de poäng (röda punkter) ger en möjlighet att justera för liten avvikelse i den exakta placeringen av z-axeln. (E) De centroids av den proximala-mest 10% och mest distala 10% (röda sfärer) används för att definiera en ny z-axeln (röd linje). Då en del av punkter som faller mellan ett5,00-15,25% av denna nya z-axeln (blå punkter) tas för att beräkna det minsta avgränsande rektangeln. Punktmolnet roteras tills den långa sidan av den minsta avgränsande rektangeln är parallellt med en ny x-axeln. F) en skiva av punkter som löper längs mittlinjen (blå punkter) samplas och den proximala-de flesta och mest distala punkten definieras som en semi-landmärke. G) 50 jämnt fördelade skivor punkter samplas (röda punkter), med H) visar en sådan skiva. 16 poäng (röda cirklar) definieras för att fånga konturerna av varje skiva. I) När upprepas i alla segment, totalt 802 semi-landmärken (gröna sfärer) definierar strukturen och används i alla efterföljande morfometriska applikationer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

De kritiska stegen i ovanstående protokoll är en) dissekera bacula, 2) samla microCT bilder, 3) omvandlar microCT utgång till en platt fil av xyz-koordinater, 4) segmentera ut varje prov s punktmoln, 5) omvandla varje prov till ett standardiserat koordinatsystem, och 6) som definierar halvlandmärken. Dessa steg kan lätt modifieras för att rymma olika objekt.

Dessa metoder kan sannolikt tillämpas på alla objekt som är i huvudsak "stavformad", eller åtminstone inte alltför böjd. Objekt som kurva tillbaka på sig själva för att bli "u-formad" inte kan för närvarande analyseras, eftersom skivning (figur 1G) skulle återvända punkter från olika delar av föremålet. Sådana föremål kan rymmas i framtiden genom beräknings uträtning objektet före skivning.

Vi har presenterat en generell metod för matematiskt Definiera semilandmärken från former som saknar erOlid landmärken. Dessa allmänna metoder har modifierats för att studera utvecklingen av whale bäcken- och revbenen ^16, som har mycket olika former. Våra beräkningsmetoder för att definiera landmärken bör gälla någon serie av xyz-koordinater. Vi använde microCT skanning här, med tanke på den lilla storleken av mus bacula ^14. För större ben, såsom whale bäcken- och revbenen, använde vi en laserscanner som rekonstruerade ytan av benen ^16. Det är viktigt att visuellt inspektera alla olika typer av semilandmärken för att kontrollera kvaliteten på den metoden. Den största fördelen med våra beräkningsmetoder är att de exakt kvantifiera den form och storlek variation, och bevara överensstämmelsen mellan distinkta regioner av objektet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting scissors	VWR	470106-338	Most sizes should work
Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved	VWR	82027-406
1.7 mL microcentrifuge tube	VWR	87003-294
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	CAS 64-17-5	To be diluted to 70% for dissections
Floral Foam	Wholesale Floral	6002-48-07
uCT50 scanner	Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland