Summary
يصف هذا البروتوكول إعادة تشكيل جسيم نووي يحتوي على تفاضلي الهستونات شقيقة المسمى النظير. وفي الوقت نفسه، جسيم نووي تعديل غير متماثلة بعد translationally يمكن أن تتولد بعد استخدام نسخة هيستون premodified. هذه الاستعدادات يمكن استخدامها بسهولة لدراسة آليات التعديل المتبادل، في وقت واحد في كل من الهستونات الشقيقة، وذلك باستخدام عالية الدقة الرنين المغناطيسي الطيفي.
Abstract
جسيم نووي تعديل غير متماثلة يحتوي على نسختين من هيستون (الهستونات شقيقة) مزينة مجموعات متميزة من التعديلات بعد متعدية (PTMs). يتم التعرف عليهم حديثا أنواع وسائل غير معروفة من إنشاء والآثار الوظيفية. الأساليب التحليلية الحالية غير كافية للكشف عن حدوث-نسخة محددة من PTMs على الهستونات شقيقة nucleosomal. ويعرض هذا البروتوكول طريقة الكيمياء الحيوية لإعادة في المختبر من جسيم نووي يحتوي على تفاضلي الهستونات شقيقة المسمى النظير. مجمع الناتجة يمكن أن يكون أيضا تعديل غير متماثلة، بعد بما في ذلك حمام هيستون premodified خلال refolding من subcomplexes هيستون. ويمكن لهذه الاستعدادات جسيم نووي غير المتماثلة يكون بسهولة كان رد فعل مع إنزيمات تعديل هيستون لدراسة الآليات عبر الحديث التعديل الذي فرضته PTM غير متماثلة قبل إدراجها باستخدام التحليل الطيفي النووي بالرنين المغناطيسي (NMR). بشكل خاص، ردود فعل التعديل فيفي الوقت الحقيقي يمكن تعيين بشكل مستقل على اثنين من الهستونات الشقيقة عن طريق إجراء أنواع مختلفة من التجارب علاقة الرنين النووي المغناطيسي، مصممة خصيصا لنوع النظير منها. توفر هذه المنهجية وسيلة لدراسة آليات الحديث المتبادل التي تساهم في تشكيل وانتشار أنماط PTM غير المتماثلة على المجمعات nucleosomal.
Introduction
وتعبئتها الحمض النووي حقيقية النواة بإحكام داخل نواة الخلية إلى لونين. لبنة أساسية من لونين هو الجسيمات الأساسية جسيم نووي يحتوي على ~ 147 شركة بريتيش بتروليوم من الحمض النووي ملفوفة حول مجمع octameric تتكون من نسختين لكل من histones الأساسية الأربعة (H3، H4، H2A، H2B). البروتينات هيستون تؤوي مجموعة كبيرة من التعديلات بعد متعدية (PTMs). هذه التبديلات التساهمية تحفز تغييرات في هيكل الكروماتين، سواء بصورة مباشرة أو عن طريق التأثير على الكيمياء الفيزيائية للنظام وبشكل غير مباشر من خلال تجنيد أنشطة إعادة عرض لونين 1، 2، 3. من خلال هذه الوسائل، PTMs هيستون تسيطر الكروماتين الوصول، وبالتالي تنظيم جميع الوظائف الخلوية المعتمدة على الحمض النووي (4).
يتم تثبيت PTMs من قبل أنظمة انزيم تعديل هيستون أساسا على قطاعات N-الطرفية غير منظم (ذيول) من HISTO الأساسية أدرجت جسيم نوويالأخبار. بسبب العديد من مواقع تعديل على سلسلة قصيرة نسبيا من ذيول هيستون، PTMs التأثير على بعضهم البعض عن طريق حفز أو منع ردود الفعل تعديل لاحقة، وهو تأثير يعرف باسم تعديل عبر الحديث 5. بسبب بنية متماثلة العامة للجسيم نووي، ويعتقد أن ردود الفعل تعديل وآليات الحديث المتبادل أن يحدث بالمثل على نسختين من كل هيستون nucleosomal (الهستونات شقيقة). وقد تحدى هذا المفهوم مؤخرا ودحضت في وقت لاحق. بشكل خاص، أظهرت فحوصات في المختبر الأنزيمية على هيستون مجانا الببتيدات H3 الذيل وعلى جسيم نووي أن مجموعة من تحركات H3 قدم الفسفرة بطريقة غير المتماثلة 6. بالإضافة إلى ذلك، كشف التحليل LC-MS / MS أساس تقارب تنقية-وجود جسيم نووي غير متماثلة، ميثليته H3 في عدة أنواع من الخلايا حقيقية النواة 7. وهكذا، جسيم نووي تعديل غير متجانس تشكل الأنواع الجديدة، وهناك حاجة إلى أدوات للكشف عن الآليات التي تتحكم في تكوينها وتحليل الآثار الحديث المتبادل أن هذا التباين قد تمارس.
عادة، وقد استخدمت الغربية التنشيف (WB) والطيف الكتلي (MS) تحليل للكشف عن PTMs هيستون. وعلى الرغم من تطبيقه سهلا، WB يعاني من مشاكل في الخصوصية / عبر التفاعل. وعلاوة على ذلك، فإنه غير قادر على القيام بها احد تحليل متعدد PTM والمباشر لكمية ردود الفعل تعديل 8. من ناحية أخرى، تحليل MS يعمل الأجهزة المتطورة التي تتطلب تدريبا رفيع المستوى، ولكنها توفر خصوصية عالية، فضلا عن رسم الخرائط في وقت واحد وتقدير من PTMs متعددة 9. ومع ذلك، على حد سواء الأساليب التخريبية ونأت المجمعات nucleosomal قبل التحليل، مما أدى إلى خليط من الهستونات و / أو الببتيدات المستمدة هيستون. هذا التلاعب يزيل القدرة على التمييز مستقلةردود الفعل التعديل التي تحدث في كل من البلدين الشقيقين الهستونات وتقرير حالة تعديل نسخ معينة من الهستونات nucleosomal.
الرنين المغناطيسي (NMR) الطيفي النووي تطورت كطريقة بديلة لرسم خريطة ردود الفعل PTM. NMR غير nondisruptive وبالتالي يسمح للرصد الأحداث PTM بطريقة الوقت الحقيقي في خليط من تشكيلها، وحتى في خلايا سليمة 10 و 11. تطوير إجراءات للحصول على البيانات بسرعة وكذلك لرسم الخرائط عالية الدقة على أساس 2D طرق ارتباط-مغاير النووي من عينات المسمى النظير (15 N و / أو 13 C) 12 يسمح تعيين وقت واحد من أنواع مختلفة من PTMs، مثل كما سيرين / ثريونين / الفسفرة التيروزين، أستلة يسين / مثيلة، وأرجينين مثيلة 13. اعتمادا على PTM قيد التحقيق، 15 N- أو 13 C-وضع العلامات والعلاقات العامةيمكن استخدامها otocols للاحتفال مجموعة وظيفية البروتين الذي يعمل كمراسل تعديل. ونتيجة لذلك، ورسم الخرائط PTM لا يمكن أن يؤديها من خلال اتباع مميزة النزوح التحول الكيميائي للمجموعة وظيفية المقابلة "الاستشعار عن بعد" للتغيير في البيئة الكيميائية. في معظم الحالات، سواء NH والمجموعات الكيميائية CH يمكن استخدامها للإبلاغ عن تطور PTM من الفائدة.
يصف البروتوكول الحالي توليد جسيم نووي يحتوي على تفاضلي الهستونات شقيقة المسمى النظير. فهو يجمع بين المرونة في مطيافية الرنين النووي المغناطيسي لرسم خريطة PTMs باستخدام كل 1 ح 15 N و 1 ح 13 ج ارتباط الأطياف مع الاستفادة من مختلف العلامات البروتين تقارب لتنقية المجمعات هيستون المعاد المحدد. والجدير بالذكر أن يستخدم بروتوكول اثنين من تجمعات مختلفة من هيستون خاص لإعادة جسيم نووي. هذه المجمعات تفاضلي المسمى النظائر (واحد مع
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعادة تشكيل جسيم نووي مع تفاضلي النظائر المسمى (والتعديل غير متماثلة) الأخت الهستونات
ملاحظة: يصف البروتوكول الحالي إعادة تشكيل جسيم نووي مع تفاضلي المسمى النظير هيستون H3. ولهذه الغاية، تم استخدام اثنين من حمامات من H3 هيستون. كان واحدا 15 N-وصفت وتحتوي على 6xHis العلامة في N-محطة والثانية 13 C-وصفت والواردة الببتيد بكتيريا (WSHPQFEK) تنصهر في N-محطة. تم فصل كل من العلامات من تسلسل H3 الأصلي مع التبغ إحفر فيروس (TEV) الموقع الاعتراف البروتيني. لإعداد جسيم نووي إضافي تعديل غير متماثلة، واحد من اثنين من حمامات H3 يتم تضمينها في شكل premodified. Premodification بركة هيستون لا يمكن أن يؤديها بتفاعل هيستون المسمى النظير في المصالح مع انزيم تعديل هيستون المعنيين في وجود الضرورة لكل نوع من العوامل المساعدة رد فعل / PTM المانحين 16. وضع الفعال للPTM منها يمكن تقييمها من قبل مطيافية الرنين النووي المغناطيسي أو قياس الطيف الكتلي. مبالغ الهستونات / الحمض النووي المستخدمة هنا هي توصيات الخام للحصول على إعداد جسيم نووي مع تركيز تقريبي من 10 ميكرومتر (يقاس تركيز الحمض النووي في 260 نانومتر)، وهذا العائد النهائي كافية لتسجيل نوعية جيدة أطياف الرنين المغناطيسي النووي مع مدة التحصيل قصيرة نسبيا.
- إعادة تشكيل octamer هيستون مع (وتعديلها غير متماثلة) المسمى النظير تفاضلي هيستون H3
ملاحظة: المؤتلف البروتينات هيستون يمكن أن تنتج بكميات ملغ في BL21 (DE3) plysS خلايا 14. للحصول على الهستونات المسمى النظير، ويتبع نفس البروتوكول التعبير / تنقية باستثناء استخدام لنمو البكتيريا وسيلة الحد الأدنى الذي يحتوي على 15 NH 4 Cl و / أو 13 C-الجلوكوز كمصدر النيتروجين والكربون، لمدة 15 أو 13 N- C-وضع العلامات respectively. ومدال الهستونات النقاء على نطاق واسع مقابل 5 ملي β-المركابتويثانول وتخزينها مجفف بالتجميد قبل الاستخدام.- حل قسامات هيستون مجفف بالتجميد، التي تحتوي على ~ 5 ملغ من كل هيستون في 1 مل من تتكشف عازلة (7 M Guanidinium، حمض الهيدروكلوريك، و 20 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، 10 ملي DTT). تشمل كلا النوعين من H3 هيستون. مزيج من قبل pipetting ولا الدوامة. إبقاء الأنابيب على الجليد لمدة 30 دقيقة للسماح كاملة تتكشف.
- تحديد تركيز الدقيق لكل هيستون عن طريق قياس الامتصاصية في 280 نانومتر ضد تتكشف العازلة وباستخدام معاملات الانقراض المحسوبة مع أداة ProtParam البوابة إكسباسي. 15
- مزيج من histones الأساسية لنسب متساوي المولية، مع الأخذ في الاعتبار لتشمل 50٪ لكل منهما من اثنين من حمامات هيستون H3. البدء في استخدام المحتوى الكامل للهيستون أقل تركيزا وإضافة جميع الآخرين وفقا لذلك.
- ضبط تركيز البروتين النهائي إلى ما يقرب من 1 ملغ / مل باستخدام تتكشف العازلة.
- حوالةص الخليط إلى غشاء غسيل الكلى 6 كيلو دالتون-قطع وdialyze ضد 2/1 لتر من العازلة refolding المبردة (10 ملي تريس درجة الحموضة 7.5 و 2 M كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 2 ملي DTT) في 4 درجات مئوية. تغيير المخزن المؤقت مرة واحدة على الأقل بعد غسيل الكلى وقد سار مدة لا تقل عن 3 ساعات. إجراء غسيل الكلى النهائي O / N عند 4 درجات مئوية.
- جمع المواد مدال وإزالة أي رواسب بواسطة الطرد المركزي في microfuge لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية على أقصى سرعة (عادة لا هطول ينبغي أن تراعى). تحديد تركيز octamer عن طريق قياس الامتصاصية في 280 نانومتر. في الحسابات، استخدام معاملات الانقراض المضافة للالهستونات، مع الأخذ في الاعتبار أن يتضاعف كل قيمة.
- تركز على الحجم النهائي لل~ 2 مل باستخدام 10 كيلو دالتون-قطع فلتر الطرد المركزي وحدة. حساب octamer التركيز وفقدان تقدير. في هذه المرحلة، تركيز octamer بين 50 - يجب الحصول على 100 ميكرومتر.
- ربط العمود هلام الترشيح (ورد في جدول المواد) لنظام FPLC وتتوازن مع 2 مجلدات العمود (CV) من 0.22 ميكرون التي تم تصفيتها ونزع الغاز refolding العازلة بمعدل تدفق من 1 مل / دقيقة وحد ضغط 0.5 ميجا باسكال.
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ الترشيح المدى هلام في الغرفة الباردة أو في خزانة البارد. - حقن المواد المركزة باستخدام معدل التدفق من 1 مل / دقيقة وجمع 1،0-1،5 كسور مل.
- اتبع الشخصي الكروماتوغرافي ومراقبة هيستون octamer شطف في ~ 65-68 مل.
ملاحظة: كتف صغيرة من ذروة شطف وبلغت ذروتها في ~ 80 مل يدل على وجود tetramers H3-H4 حرة وdimers H2A-H2B، على التوالي. - تشغيل 20 ميكرولتر من كل جزء تم جمعها في 18٪ هلام SDS-PAGE.
ملاحظة: تمييع العينات بمعامل لا يقل عن 2 مع الماء قبل تحميلها على هلام للحد من تركيز الملح العالية، وبالتالي، وتجنب التشوهات. وينطبق الشيء نفسه بالنسبة التحليلات SDS-PAGE لاحقة من العينات في refolding العازلة. - تجمع FRA ذات الصلةctions تحتوي على octamers النقي الحكم عليها من خلال التوزيع العادل لل4 الهستونات على هلام ملون وتحديد تركيز كما كان من قبل (الخطوة 1.1.7).
- توصيل 1 مل ني NTA العمود (جدول المواد) إلى نظام FPLC وتتوازن مع 10 السيرة الذاتية من 0.22 ميكرون التي تم تصفيتها ونزع الغاز refolding العازلة بمعدل تدفق من 1 مل / دقيقة.
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ اللوني ني NTA في الغرفة الباردة أو في خزانة البارد. - تمرير octamer تنقيته من خلال ني NTA باستخدام معدل التدفق من 1 مل / دقيقة.
- جمع التدفق من خلال والاحتفاظ بعينات لSDS-PAGE تحليل / البنك الدولي (20 ميكرولتر و 4 ميكرولتر، على التوالي). وفي وقت لاحق، وغسل العمود مع 10 السيرة الذاتية لrefolding العازلة أو حتى يتم التوصل إلى إشارة خط الأساس.
- أزل مع 10 السيرة الذاتية لrefolding العازلة التي تحتوي على 250 ملي ايميدازول باستخدام معدل التدفق من 1 مل / دقيقة. الاحتفاظ بعينات لSDS-PAGE تحليل / البنك الدولي (20 ميكرولتر و 4 ميكرولتر، على التوالي).
- تتوازن عمود تقارب 1 مل من ميلانstreptavidin ommercial (جدول المواد) مع 10 CV refolding العازلة التي تحتوي على 250 ملي ايميدازول باستخدام الإعداد تدفق دفعة / الجاذبية.
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة الكروماتوغرافي في غرفة باردة. - تمرير ني NTA شطف من خلال العمود تقارب streptavidin التجاري.
- جمع التدفق من خلال والاحتفاظ بعينات لSDS-PAGE تحليل / البنك الدولي (20 ميكرولتر و 4 ميكرولتر، على التوالي). وفي وقت لاحق، ويغسل مع 10 السيرة الذاتية لrefolding العازلة.
- أزل مع 10 السيرة الذاتية لrefolding العازلة التي تحتوي على 2.5 ملي desthiobiotin. الاحتفاظ بعينات لتحليل SDS-PAGE / WB (20 و 4 ميكرولتر على التوالي).
- قياس تركيز octamer، إضافة 10 مرات أقل TEV البروتيني وترك رد فعل المضي قدما بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في أنبوب الطرد المركزي البلاستيك القياسية.
ملاحظة: المبلغ اللازم من TEV للحصول على الهضم الكامل (إزالة علامات تقارب) تعتمد على الأصل (بناء) وعلى النشاط (تقدم طازجة، TEV المؤتلف هو أكثرنشطة مقارنة مع واحد تخزينها لفترات طويلة في - 80 درجة مئوية). محاولة TEV أقل في البداية إضافة إلى 10 أضعاف مقارنة octamer (المقدر كما تركيزات البروتين)، وضبط وفقا لذلك. - تحقق من وجود عملية الهضم كفاءة عن طريق تشغيل 20 ميكرولتر من الخليط السابق وبعد TEV إضافة على 18٪ هلام SDS-PAGE. إذا الهضم ليست كاملة، إضافة المزيد من البروتيني TEV وتستمر الحضانة لمدة 3-4 ساعة أخرى.
- Dialyze عينة ضد refolding العازلة باستخدام غشاء غسيل الكلى 50 كيلو دالتون، قطع لإزالة TEV البروتيني وضبط تكوين العازلة.
- تركيز octamer غير المتماثلة تنقيته باستخدام وحدة 10 كيلو دالتون-قطع الطرد المركزي فلتر (نفس الوحدة مرشح من الخطوة 1.1.7 يمكن استخدامها أيضا) إلى وحدة تخزين من 1،0-2،0 مل. قياس تركيز النهائي. إما استخدام بعد فترة وجيزة لإعادة جسيم نووي أو التكيف مع 50٪ (ت / ت) الجلسرين لتخزين في -20 درجة مئوية لفترات أطول. في هذه النقطة، وتتوقع خسارة 70٪ على الأقل خلال الخطوات السابقة، الوينبغي أن يكون تركيز octamer الإلكترونية في نطاق 20-50 ميكرومتر.
- إعادة جسيم نووي
- إذا تم تخزينها octamer في 50٪ الجلسرين، dialyze بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية ضد refolding العازلة قبل الشروع في إعادة جسيم نووي.
- ضبط الحمض النووي (يحتوي على جسيم نووي لتحديد المواقع تسلسل) تركيز الملح إلى 2 M كلوريد الصوديوم باستخدام M كلوريد الصوديوم محلول المخزون 5.
ملاحظة: الحمض النووي المنقى إما معزولة بعد تنقية البلازميد التي تحتوي على نسخ متعددة من التسلسل المطلوب أو توليفها من قبل PCR التضخيم يجب أن يتم تخزين تركيزا إلى ~ 50 ميكرومتر في الماء أو منطقة عازلة تريس، EDTA القياسية. - مزيج octamer والحمض النووي باستخدام النسبة المثلى تحديدها من اختبار على نطاق صغير. استخدام عازلة refolding لضبط الحجم النهائي إلى ~ 3.0 مل. دائما إضافة octamer الماضي لمنع أي احتمال لخلط octamer والحمض النووي في <2 M تركيز الملح.
- أداء الأولي الشوري صغيرreconstitutions البيرة لتحديد octamer: نسبة الحمض النووي أن يؤدي إلى عوائد جسيم نووي المثلى. لهذا، تجميع ثلاثة ردود الفعل من 0.9: 1.0، 1.0: 1.0، و 1.1: 1.0 الحمض النووي: octamer النسب في وحدة بين 50-100 ميكرولتر. عادة، واستخدام تركيز الحمض النووي 5 ميكرومتر.
- المضي قدما في إعادة كما هو موضح أدناه (الخطوات 1.2.4-1.2.8) وفي النهاية، تقدير كمية قابلة للذوبان وذات نوعية جيدة جسيم نووي تشكيلها عن طريق قياس تركيز الحمض النووي في 260 نانومتر، وعن طريق تشغيل 6٪ الأصلي-PAGE هلام الحمض النووي ، ملطخة بروميد إيثيديوم، على التوالي (الشكل 5A).
- نقل المزيج إلى غشاء غسيل الكلى 6 كيلو دالتون-قطع وdialyze ضد 1 لتر من refolding العازلة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- والحد من تركيز الملح من المنطقة العازلة غسيل الكلى على نحو تدريجي من 2 إلى 0.85، 0.64، و 0.2 M كلوريد الصوديوم على التوالي. تبقي العينة في كل عازلة لمدة 3 ساعة على الأقل. أحيانا يعجل تتشكل بعد الانتقال الماضي. في هذه الحالة جontinue غسيل الكلى كما هو مخطط لها وإزالة الرواسب عن طريق الطرد المركزي microfuge في نهاية الخطوة التالية.
- نقل غشاء غسيل الكلى في كوب مع 1 لتر من العازلة الفحص (25 ملي ناه 2 ص 4 / نا 2 هبو 4 درجة الحموضة 6.8، 25 ملي كلوريد الصوديوم، 2 ملي DTT) ويستمر لغسيل الكلى O / N عند 4 درجات مئوية.
- جمع العينة، وإزالة أي يعجل شكلت في خطوة 1.2.5 بواسطة الطرد المركزي في microfuge لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية على أقصى قدر من السرعة والتركيز باستخدام 30 كيلو دالتون-قطع فلتر الطرد المركزي وحدة إلى وحدة تخزين النهائي من ~ 300 ميكرولتر.
- قياس تركيز الحمض النووي في 260 نانومتر، تشغيل هلام 18٪ من البروتين SDS-PAGE (4 ميكرولتر من العينة) والأم-PAGE هلام 6٪ الحمض النووي (0.2 ميكرولتر من العينة) وعينة تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة عدة أسابيع. وينبغي أن يكون التركيز النهائي في حدود 10-20 ميكرومتر.
2. تحليل NMR من ردود الفعل تعديل على الأخت الهستونات اثنين
ملاحظة: تعيين2D 1 ح 15 N ارتباط أطياف ذيول هيستون nucleosomal ويمكن الاطلاع على المراجع 16 و 17 و 18. بالإضافة إلى ذلك، إحالة CH اكس مجموعات من lysines، serines وthreonines على 2D يمكن العثور عليها 1 ح 13 ج ارتباط الأطياف في إشارة 16.
- الإعداد NMR وتسجيل الأطياف المرجعية
ملاحظة: تم إجراء فحوصات الأنزيمية باستخدام 140 ميكرولتر من العينة جسيم نووي في المخزن فحص في أنبوب NMR 3 ملم في 300 ك أنابيب الرنين المغناطيسي النووي المختلفة مع أحجام عينة أخرى يمكن أن تستخدم أيضا. درجة الحرارة المذكورة أعلاه هي مناسبة للحصول على نوعية جيدة 1 ح 15 N ارتباط أطياف ذيول هيستون nucleosomal والأنشطة الإنزيمية جيدة. سجلت 2D-SOFAST-HMQC 1 ح 15 N و 2D-HSQC 1 ح 13 C الأطياف على التوالي مع تي الإعدادقبعة تمنح مدة التحصيل مماثلة. المعلمات الاستحواذ النموذجية هي 128 العابرين مع 1.024 (1 H) × 128 (15 N) نقاط معقدة و32 العابرين مع 1.024 (1 H) × 64 (13 C) نقطة معقدة لمدة أنواع مختلفة من أطياف الارتباط. لكل أطياف 2D، كانت المرة الاستحواذ ~ 30 دقيقة.- تعيين 300 K كما درجة حرارة العينة في مطياف. إضافة 10٪ D 2 O (ت / ت) لعينة لاستخدامها لقفل تردد الطيف.
- وضع العينة في مطياف وأداء العمليات الأساسية (قفل و ضبط و الملئ). بالإضافة إلى ذلك، تحديد أطوال نبض الأمثل والمعلمات اكتساب العامة.
- سجل 1D و 2D 1 ح 15 N و 1 ح 13 ج إشارة الأطياف.
- عملية الأطياف المرجعية وضمان أن الإشارات التي سيتم استخدامها لرسم خرائط ردود الفعل تعديل يتم حلها بشكل جيد ويكون شدة جيدة.
- استعادة عينة ونقل طر إلى أنبوب microfuge.
- الإعداد من رد الفعل الأنزيمية، ورصد NMR والتحليل الكمي
- نسخة وترتيب سلسلة من 2D معشق 1 ح 15 N و 1 ح 13 C الأطياف. تهدف لمجموع اكتساب الوقت لعدة ساعات وضبط وفقا لذلك في المدى جديد يستند إلى معدلات الأنزيمية تم الحصول عليها من رد الفعل الأول.
- إضافة إلى عينة من العوامل المساعدة اللازمة لنوع منها من رد فعل التعديل (1 ملم ATP / 2 ملي MgCl 2 لالفسفرة، 1 ملم أسيتيل التميم لأستلة، 1 ملم SAM للمثيلة، الخ.).
- إضافة انزيم من الفائدة، ومزيج من قبل pipetting، ونقل العينة مرة أخرى في أنبوب الرنين المغناطيسي النووي وبعد ذلك في مطياف (تنفيذ هذه العمليات بسرعة).
ملاحظة: إذا كان هناك أية بيانات عن النشاط الأنزيمي المتوقع، وضبط الركيزة للانزيم نسبة المولي إلى 10: 1. إجراء أول التشغيل التجريبي وضبط وفقا لعلى المدى الحقيقي. - إجراء الملئ التلقائي السريع واستخدام ما تبقى من المعلمات من الأطياف المرجعية.
- بدء سلسلة من 2D معشق 1 ح 15 N و 1 ح 13 C الأطياف.
- اتبع التقدم من رد فعل في الوقت الحقيقي، ووقف شراء عندما يصل رد فعل إنجاز أو المستوى المطلوب.
- أطياف العملية كما كان من قبل مع نفس المعلمات بالضبط.
- كرر على المدى كله باستخدام نظام اكتساب مختلف لهذين النوعين من أطياف الارتباط. إذا كان 1 ح 15 N ارتباط في التجربة الأولى للمرة الأولى في هذه السلسلة، تبدأ الآن مع 1 ح 13 ج الارتباط. قبل هذا، وبعد اكتساب الوقت نفسه لكل الأطياف، فمن الممكن للتخطيط ومقارنة ردود الفعل PTM على حد سواء الهستونات المسمى النظير تفاضلي على نفس النطاق الزمني. بالإضافة إلى ذلك، فمن الممكن لحساب المتوسطات وأشرطة الخطأ المؤامرة.
ملاحظة: thorougوصف ح منهجيات لتحليل الإشارات NMR النوعي والكمي لاحق من التفاعلات الإنزيمية يمكن العثور عليها هنا 19. - تحديد إشارات الرنين المغناطيسي النووي NMR من كل الطيف الوقت طبعا أن يقدم تقريرا عن التقدم من رد فعل وحساب شدة إشارة النسبية باستخدام التصور والتحليل البرنامج لNMR الأطياف. هل هذه علامات تدل على تقرير معدلة وكذلك الدولة التي تم تعديلها. استخراج مستويات تعديل.
- رسم القيم المحسوبة من مستويات تعديل على وقت رد الفعل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم عزل الأنواع octameric refolded بشكل صحيح بعد سلسلة من الخليط إعادة من خلال عمود هلام الترشيح (الشكل 2). يتعرض تجمع أعيد octameric تحتوي على ثلاثة أنواع مختلفة من octamers إلى مخطط جنبا إلى جنب تنقية تقارب. يتم جمع عينات من جميع الخطوات وتحليلها بواسطة SDS-PAGE، وبعد ذلك البنك الدولي. ويتحقق التحقق من تنفيذ الصحيح من البروتوكول الذي يؤدي إلى العزلة من الأنواع غير المتماثلة باتباع وجود علامات تقارب اثنين (أصول أمريكية لاتينية وStrep-) في عينات مختلفة (الشكل 3). وفي وقت لاحق، تتم إزالة العلامات تقارب بعد TEV البروتيني الهضم (الشكل 4). تستخدم octamers غير المتماثلة التخلص من علامات تقارب لإعادة جسيم نووي غير المتماثلة. في البداية، يتم استخدام صغيرة إعادة اختبار النطاق لتحديد نسبة المولي المثلى من الحمض النووي: octamer أن يؤدي إلى ارتفاعتسفر عن تشكيل مجمع monodisperse. وفي وقت لاحق، يعمل فيها نسبة خلط الأمثل لإعادة جسيم نووي في نطاق واسع. ويتم تحليل reconstitutions جسيم نووي من البروتين / المواد الهلامية الحمض النووي والرنين المغناطيسي الطيفي للجمعية السليم وبحضور الهستونات H3 شقيقة المسمى النظير تفاضلي على التوالي (الشكل 5). ويصور مثال التطبيق في الشكل (6). وكان رد فعل على وجه الخصوص، المسمى النظير تفاضلي وفسفرته غير متماثلة على H3S10 جسيم نووي مع Gcn5 أسيتيل، ويتبع أستلة H3K14 على حد سواء نسخ H3 في الوقت الحقيقي من خلال الرنين المغناطيسي الطيفي. ويكشف التحليل أن H3S10 الفسفرة يحفز H3K14 أستلة من Gcn5 في رابطة الدول المستقلة مقارنة في العابرة.
الشكل 1: مخطط انسيابي لإعداد تفاضلي النظائر-Labeled (وغير متماثلة التعديل) جسيم نووي. (أ) إعادة إعماره وتقارب جنبا إلى جنب تنقية تفاضلي (وغير متماثلة المعدلة) المسمى النظير octamers هيستون. (ب) إعادة جسيم نووي من خلال الجمع بين octamers غير المتماثلة النقي وتسلسل الحمض النووي جسيم نووي لتحديد المواقع. (C) NMR رصد في رابطة الدول المستقلة وفي عبر الحديث المتبادل التعديل بعد خلط جسيم نووي المسمى النظير تعديل غير متماثلة وبشكل مختلف مع إنزيمات تعديل هيستون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعادة تشكيل هيستون Octamers. لمحة شطف هلام الترشيح من خليط هيستون refolded. ذروة الرئيسية في ~ 70 مل يتوافق مع octamers هيستون. و14 - التدرج هلام SDS-PAGE 20٪ (Coomassie الأزرق تلطيخ) من كسور مزال الموافق ذروة octamer يظهر رياضيات الكيمياء هيستون الصحيح. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): تنقية المتناظر هيستون Octamers. 14-20٪ هلام التدرج SDS-PAGE (Coomassie تلطيخ) والبنك الدولي على أصول أمريكية لاتينية وStrep- علامات تقارب عينات من المراحل المختلفة للمشروع جنبا إلى جنب تنقية تقارب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: إزالة للتقارب الكلمات. 18٪ هلام SDS-PAGE (Coomassie تلطيخ) من octamers هيستون غير المتماثلة تنقيته قبل وبعد الاختلاط مع البروتيني TEV. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: البيوكيميائية وNMR توصيف جسيم نووي المسمى النظائر-تفاضلي. (أ) 6٪ الأصلي-PAGE هلام الحمض النووي (إيثيديوم بروميد تلطيخ) لإعادة جسيم نووي صغير نطاق تجريبي باستخدام نسب المولي مختلفة من الحمض النووي: octamer (يسار). 6٪ هلام الأم-PAGE الحمض النووي (إيثيديوم بروميد تلطيخ) لإعادة جسيم نووي على نطاق واسع باستخدام الحمض النووي الأمثل: octamer نسبة المولي (يمين). (ب) 18٪ SDS-PAGE هلام بروتين (Coomassie تلطيخ) من جسيم نووي أعيد تشكيلها ويبين رياضيات الكيمياء الصحيح من histones الأساسية الأربعة. (C) 1 ح 15 N SOFAST-HMQC الطيف للنسخة H3 15 N المسمى من جسيم نووي المسمى النظير تفاضلي (H3 فقط بقايا الذيل مرئية - جوهر بروتين غير مرئي بسبب معدل تراجع بطيء). (D) 1 ح 13 ج HSQC الطيف للالمسمى C نسخة 13 H3 من جسيم نووي المسمى النظير تفاضلي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: رصد NMR من في رابطة الدول المستقلة وفي العابرة تعديل الصليب الحديث المفروضة من قبل غير المتماثلة الفسفرة من H3S10 على H3K14 أستلة آخر من Gcn5 أسيتيل. (أ) تمثيل تخطيطي بشكل مختلف وغير متماثلة فسفرته على H3S10 جسيم نووي كان رد فعل مع Gcn5 أسيتيل ورسم الخرائط أستلة H3K14، في رابطة الدول المستقلة وعبر المسمى النظير. (ب) 1 ح 15 N SOFAST-HMQC و 1 ح 13 ج HSQC الأطياف (مناطق مختارة) من جسيم نووي غير المتماثلة قبل وبعد رد فعل مع Gcn5. (C)، حل وقت الرصد NMR من H3K14 أستلة من Gcn5 على جسيم نووي غير متماثلة H3S10 فسفرته. وأظهرت المتوسطات والاختلاف (أشرطة الخطأ) من تجربتين مستقلة. مستنسخة بإذن 16. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر منهذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لإعادة جسيم نووي، البروتوكول الحالي يستخدم 165 نقطة أساس القالب الحمض النووي طويلة تحتوي على 601 ويدوم المواقع جسيم نووي تسلسل 20، ولكن من المتوقع أداء مماثل باستخدام أطوال مختلفة من قوالب الحمض النووي. تم تصميم بروتوكول ويعمل باستخدام أنواع غير المتماثلة من H3 هيستون. مع المبدأ نفسه، يمكن تطبيق الطريقة أيضا لhistones الأساسية الأخرى، وبالإضافة إلى ذلك يمكن استخدامها لإعادة بناء مجمعات تقل اثنين من histones الأساسية متميزة مع العلامات النظائر المختلفة. بروتوكول يمكن أيضا تعديل طفيف لإعادة البداية هيستون المجمعات الفرعية وليس هيستون مباشرة octamers. وبعد هذا التعديل، غير المتماثلة tetramers-H4 H3 يمكن أعاد عن طريق استخدام نفس نظام تنقية جنبا إلى جنب. يتم خلط هذا الأخير مع تشكيلها بشكل منفصل dimers H2A-H2B والحمض النووي لتجميع جسيم نووي 16. عائدات النهائية والأداء العام للprotoc تعديلرأ مماثلة لنسخة أصلية واحدة.
بروتوكول يعتمد بشدة على قدرة العمودين تقارب ربط بكفاءة الأنواع ذات الصلة، وبالتالي أن تسفر في نهاية المجمعات غير المتماثلة نقية للغاية. ذلك هو مرهق أن يقدم دليلا مباشرا وملموسا على أن مجمع النقي النهائي هو في الواقع وغير المتماثلة فقط. ومع ذلك، تحليل البنك الدولى لعينات من جميع الخطوات تنقية مع الأجسام المضادة ذات الصلة يعطي مؤشرات موثوقة لنجاح مخطط تنقية جنبا إلى جنب (الشكل 3). نفس النتائج، وبالتالي الطمأنينة إضافي، تم الحصول عليها عن طريق تحليل نفس عينات لوجود علامات تقارب بالطرق NMR 16. ومع ذلك، إذا يشير تحليل البنك الدولي تلوث الأنواع غير متكافئة مع تلك متماثل، يمكن اعتمادها اختلاف ضئيل في خطوة تنقية الأولى (ني NTA) التي يمكن أن تحسن النتائج. بشكل خاص، بدلا من شطف isocratic، وهو gradien ايميدازول ر شطف (10-250 ملم) ويمكن استخدام وبعد ذلك، الكسور شطف الأولى التي يتم التخصيب في الأنواع غير المتماثلة يتم تجميع فقط والبعيد من خلال عمود النسب. ويمكن تقييم ذلك من خلال تحليل البنك الدولي من الكسور شطف من وجود علامة بكتيريا تقارب.
اختيار النظائر التسمية فيما يتعلق PTM من الفائدة مرنة إلى حد ما لأن معظم الحالات، NMR غير قادرة على رسم نفس PTM باستخدام كل 1 ح 15 N و 1 ح 13 Ccorrelation الأطياف. ومع ذلك، لبعض الأحماض الأمينية، مثل lysines، وتشتت التحول الكيميائي لل1 ح 13 الأصداء جنب سلسلة C محدود نوعا ما. بالإضافة إلى ذلك، عندما المواقع المستهدفة من انزيم تعديل يسين غير معروفة، للقراءة خارج مواقع محددة من ليسين PTMs ليست واضحة. في هذه الحالات، وطرق بديلة تستخدم انتقائية الموقع 13 C-وضع العلامات، جنبا إلى جنب مع إنتاج هيستون شبه الاصطناعية"> 21 أو استخدام تسلسل نبض الرنين المغناطيسي التي أنشئت حديثا التي تمكن الكشف محدد من الدول التعديل من خلال الإثارة الانتقائية الروتينات 22. مطيافية الرنين النووي المغناطيسي يمنح حساسية منخفضة نوعا ما. وفي هذا الصدد، هناك حاجة إلى كميات عالية نسبيا من جسيم نووي (المدى ميكرومتر) لأداء التفاعلات الأنزيمية، وهذا يمنع تطور طريقة لإعداد الإنتاجية العالية.
وفي الوقت نفسه، تم إدخال طريقة كيميائية جديدة لتركيب جسيم نووي نقي كيماويا أو تعديل غير متماثلة، مع عوائد عالية، تحمل تعريف PTMs 23. وقد استخدم هذا النهج، إلى جانب تصوير تألقي، لدراسة آليات الحديث المتبادل PTM. ويرجع ذلك إلى قدرة منخفضة الدقة من أساليب فلورجربهي في الكشف عن PTMs، وقد استمدت الاستنتاجات بشكل غير مباشر عن طريق مقارنة الأنشطة الإنزيمية الشاملة على مجموعة من جسيم نووي تحمل مجموعات مختلفة من PTMs المتماثلة وغير المتماثلة، بدلامن خلال الملاحظة المباشرة من ردود الفعل PTM على المواقع المقابلة من كل هيستون الشقيقة. ومع ذلك، يمكن دمج الهستونات المسمى isotopically واستخدام الرنين المغناطيسي الطيفي لPTM قراءات تشكل طريقة المذكور أداة إضافية لتحليل PTM عالية الدقة من جسيم نووي تعديل غير متماثلة.
في اتصال مع تحديد أنواع جديدة من جسيم نووي تعديل غير متماثلة في المستقبل، ويهدف الطريقة الحالية تشكل أداة عالية الدقة لتحليل في رابطة الدول المستقلة وفي المتحولة ردود الفعل المتبادل PTM على ركائز nucleosomal. بشكل خاص، من أهمية كبيرة هو فك آليات الحديث المتبادل التي تؤدي إلى جسيم نووي ثنائي التكافؤ 24 التي تحتوي على غير متماثلة، سواء PTMs النشطة transcriptionally والقمعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
بفضل مؤلف الدكتور فيليب Selenko (FMP-برلين) لتوفير مساحة الرطب مختبر والبنية التحتية لإجراء تجارب والألمانية للبحوث (DFG) لتمويل العمل من خلال منحة بحثية (LI 2402 / 2-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidinium HCl | Applichem | A14199 | Use high quality Gu-HCl |
| Tris | Roth | 4855.2 | |
| DTT | Applichem | A1101 | |
| NaCl | VWR chemicals | 27810.364 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Na2H2PO4 | Applichem | A1046 | |
| NaH2PO4 | Applichem | A3902 | |
| Imidazole | Applichem | A1073 | |
| d-Desthiobiotin | Sigma | D1411 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 1034557 | |
| Strep-Tactin Superflow | IBA | 2-1207-001 | |
| His-probe antibody | Santa Cruz | sc-8036 | |
| Strep-tactin conjugated HRP | IBA | 2-1502-001 | |
| Hi-Load 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28-9893-35 | |
| 6 - 8 kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 1, 132650 | |
| 50 kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 7, 132129 | |
| 10 kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC901024 | |
| 30 kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC903024 | |
| Solution-state NMR spectrometer | at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe | ||
| Buffer name | Component | ||
| Unfolding Buffer | 7 M Guanidinium HCl | ||
| 20 mM Tris, pH 7.5 | |||
| 10 mM DTT | |||
| Refolding Buffer | 10 mM Tris, pH 7.5 | ||
| 2 M NaCl | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 2 mM DTT | |||
| Assay Buffer | 25 mM Na2H2PO4, pH 6.8 | ||
| 25 mM NaCl | |||
| 2 mM DTT |
References
- Hansen, J. C. Conformational Dynamics of the Chromatin Fiber in Solution: Determinants, Mechanisms, and Functions. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31, 361-392 (2002).
- Clapier, C. R., Cairns, B. R.
- Musselman, C. A., Lalonde, M., Cote, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and Combinatorial Functions of Histone Modifications. Annu. Rev. Biochem. 80, 473-499 (2011).
- Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A.
- Liokatis, S., et al. Phosphorylation of histone H3 Ser10 establishes a hierarchy for subsequent intramolecular modification events. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (8), 819-823 (2012).
- Voigt, P., et al. Asymmetrically Modified Nucleosomes. Cell. 151 (1), 181-193 (2012).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat. Struct. Mol. Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative Proteomic Analysis of Histone Modifications. Chem. Rev. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Liokatis, S., Dose, A., Schwarzer, D., Selenko, P. Simultaneous Detection, of Protein Phosphorylation and Acetylation by High-Resolution NMR Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 132 (42), 14704-14705 (2010).
- Binolfi, A., et al. Intracellular repair of oxidation-damaged α-synuclein fails to target C-terminal modification sites. Nat. Commun. 7, 10251 (2016).
- Schanda, P., Kupce, E., Brutscher, B. SOFAST-HMQC experiments for recording two-dimensional heteronuclear correlation spectra of proteins within a few seconds. J. Biomol. NMR. 33 (4), 199-211 (2005).
- Theillet, F. X., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of Nucleosome Core Particles from Recombinant Histones and DNA. Methods Enzymol. 375, 23-43 (2004).
- Artimo, P., et al. ExPASy :SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40 (W1), 597-603 (2012).
- Liokatis, S., klingberg, R., Tan, S., Schwarzer, D. Differentially Isotope-Labeled Nucleosomes to Study Asymmetric Histone Modification Crosstalk by Time-Resolved NMR Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (29), 8262-8265 (2016).
- Stützer, A., et al. Modulations of DNA Contacts by Linker Histones and Post-translational Modifications Determine the Mobility and Modifiability of Nucleosomal H3 Tails. Mol. Cell. 61 (2), 247-259 (2016).
- Zhou, B. R., et al. Histone H4 K16Q Mutation, an Acetylation Mimic, Causes Structural Disorder of Its N-terminal Basic Patch in the Nucleosome. J. Mol. Biol. 421 (1), 30-37 (2012).
- Theillet, F. X., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), 19-42 (1998).
- Hackenberger, C. P., Schwarzer, D. Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (52), 10030-10074 (2008).
- Theillet, F. X., et al. Site-specific mapping and time-resolved monitoring of lysine methylation by high-resolution NMR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7616-7619 (2012).
- Lechner, C. C., Agashe, N. D., Fierz, B. Traceless Synthesis of Asymmetrically Modified Bivalent Nucleosomes. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (8), 2903-2906 (2016).
- Bernstein, B. E., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125 (2), 315-326 (2006).
