Summary
Denne protokollen beskriver tilberedning av nukleosomer inneholder differensielt isotop-merkede søster histoner. På samme tid, kan asymmetrisk post-translasjonelt modifisert nukleosomer bli generert etter bruk av en premodified histon kopi. Disse preparatene kan lett brukes til å studere modifikasjon krysstalemekanismer, samtidig på begge søster histoner, ved hjelp av høy-oppløsning NMR-spektroskopi.
Abstract
Asymmetrisk modifiserte nukleosomer inneholder to kopier av en histone (søster histoner) dekorert med forskjellige sett med posttranslasjonelle modifikasjoner (PTMs). De er nylig identifiserte arter med ukjent hjelp av etablering og funksjonelle implikasjoner. Nåværende analytiske metoder er utilstrekkelige for å oppdage kopien spesifikke forekomsten av PTMs på nukleosomale søster histoner. Denne protokollen gir en biokjemisk fremgangsmåte for in vitro rekonstituering av nukleosomer inneholdende differensielt isotopmerkede søster histoner. Den genererte komplekset kan også være asymmetrisk endret, etter blant annet en premodified histone bassenget under refolding av histone subcomplexes. Disse asymmetriske nucleosome preparater kan være lett omsettes med histon-modifiserende enzymer for å studere modifikasjonskrysstale mekanismer som pålegges av asymmetrisk forhånds innlemmet PTM ved hjelp av kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Spesielt, de modifikasjonsreaksjoner hossanntid kan kartlegges uavhengig på de to søster histoner ved å utføre ulike typer av NMR korrelasjons eksperimenter, skreddersydd for de respektive isotopen type. Denne metoden gir mulighet til å studere krysstale mekanismer som bidrar til dannelsen og utbredelsen av asymmetriske PTM mønstre på nukleosomale komplekser.
Introduction
Eukaryote DNA er tett pakket i cellekjerner i kromatin. Den grunnleggende byggesten av kromatin er nucleosome kjernepartikkel som inneholder ~ 147 bp DNA pakket rundt en octameric kompleks som består av to eksemplarer hver av de fire kjerne histoner (H3, H4, H2A, H2B). Histonproteinene havn en mengde posttranslasjonelle modifikasjoner (PTMs). Disse kovalente substitusjonene indusere endringer i kromatinstruktur, både direkte ved å påvirke den fysiske kjemien i systemet og indirekte ved å rekruttere kromatin-remodeling aktiviteter 1, 2, 3. Ved disse midler, histon PTMs tak kromatin tilgjengeligheten og dermed regulere alle DNA-baserte cellulære funksjoner 4.
PTMs installeres av histon-modifisering enzymsystemer i hovedsak på de ustrukturerte N-terminale segmenter (tails) av nucleosome-innlemmet kjerne histones. På grunn av de mange modifikasjons steder på relativt kort sekvens av histone haler, PTMs påvirker hverandre ved å indusere eller blokkere påfølgende modifikasjonsreaksjoner, en effekt som kalles modifisering krysstale fem. På grunn av den samlede symmetrisk arkitektur av nucleosome, ble modifikasjons reaksjoner og crosstalk mekanismer tenkt å skje på samme måte på de to eksemplarer av hver nukleosomale histone (søster histoner). Dette konseptet ble nylig utfordret og senere avkreftet. Spesielt in vitro enzymatiske analyser for fri histon H3 hale peptider og på nukleosomer vist at et sett av H3-kinaser innført fosforylering på en asymmetrisk måte seks. I tillegg affinitets-rensing basert på LC-MS / MS-analyse avslørte eksistensen av asymmetrisk H3-metylert nukleosomer i flere typer eukaryote celler 7. Dermed asymmetrisk modifiserte nukleosomer utgjør nye arter, ogverktøy er nødvendig for å avdekke mekanismene som styrer deres dannelse og for å analysere crosstalk effekter som denne asymmetrien kan utøve.
Vanligvis, Western blotting (WB) og massespektrometri (MS) -analyse er blitt anvendt for å detektere histon PTMs. Til tross for sin enkel applikasjon, lider WB fra spesifisitet / kryss-reaktivitet problemer. På toppen av det, er det ute av stand til å utføre samtidige multi-PTM analyse og direkte kvantifisering av modifikasjons reaksjoner 8. På den annen side, benytter MS-analyse avanserte instrumenter som krever høyt nivå trening, men gir høy spesifisitet, så vel som samtidig kartlegging og kvantifisering av flere PTMs 9. Men begge metoder er forstyrrende, og de nukleosomale kompleksene blir dissosiert før analysen, som gir opphav til en blanding av histoner og / eller histon-avledede peptider. Denne manipulasjon fjerner evnen til å skille uavhengigmodifikasjonsreaksjoner som forekommer på hver av de to søster histoner og for å rapportere kopierings-spesifikk modifisering status for nukleosomale histoner.
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spektroskopi utviklet seg som en alternativ metode for å kartlegge PTM reaksjoner. NMR er uavbrutt og således muliggjør overvåking av PTM begivenheter i sanntid måte rekonstituert blandinger, og selv i intakte celler 10, 11. Utviklingen av rutiner for hurtig datainnsamling og for høy oppløsning kartlegging basert på 2D-hetero-atomkorrelasjonsmetoder av isotop-merket (15 N og / eller 13 C) prøver 12 tillot samtidig kartlegging av forskjellige typer PTMs, f.eks som serin / treonin / tyrosinfosforylering, lysin acetylering / metylering, og arginin metylering 13. Avhengig av den PTM som undersøkes, 15 N- eller 13 C-merking protocols kan anvendes for å merke proteinet funksjonell gruppe som tjener som en modifikasjon reporter. Følgelig kan PTM kartlegging kan utføres ved å følge den karakteristiske kjemiske forskyvning forskyvning av den tilsvarende funksjonell gruppe "avføle" forandringen av den kjemiske miljøet. I de fleste tilfeller kan både NH og CH kjemiske grupper anvendes for å rapportere utviklingen av PTM av interesse.
Den nåværende protokollen beskriver generasjonen av nukleosomer inneholder differensielt isotop-merkede søster histoner. Den kombinerer fleksibiliteten til NMR-spektroskopi for å kartlegge PTMs ved anvendelse av både 1 H 15 N og en H-13 C-korrelasjonsspektra med utnyttelse av forskjellige protein affinitet koder for rensning av de valgte rekonstituert histon komplekser. Spesielt protokollen benytter to ulike bassenger av en bestemt histone for nucleosome tilberedning. Disse bassengene er forskjellig isotop-merket (ett med
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tilberedning av nukleosomer med Forskjellig Isotop-merket (og asymmetrisk modifisert) Sister Histoner
MERK: Den aktuelle protokollen beskriver tilberedning av nukleosomer med forskjellig isotop-merkede histon H3. For å oppnå dette, ble to bassenger av histon H3 som brukes; en var 15 N-merket og inneholdt en 6xHis-tag ved N-terminalen og den andre var 13 C-merket og inneholdt Strep peptid (WSHPQFEK) fusjonert ved N-terminus. Begge kodene ble skilt fra de innfødte H3 sekvens med en Tobacco Etch Virus (TEV) protease gjenkjenningssete. For å fremstille ytterligere asymmetrisk modifiserte nukleosomer, er en av de to bassengene H3 som inngår i en premodified form. Premodification av et histon basseng kan utføres ved omsetning av det isotop-merkede histon av interesse med de respektive histon-modifiserende enzym i nærvær av det som er nødvendig for hver type av reaksjons-kofaktorer / PTM givere 16. Den effektive plassering av de respektive PTM kan vurderes ved NMR-spektroskopi eller massespektrometri. Mengden av histoner / DNA som brukes her er grove anbefalinger for å få en nucleosome forberedelse med en omtrentlig konsentrasjon på 10 mikrometer (målt som DNA-konsentrasjon ved 260 nm) .Dette endelige utbyttet er tilstrekkelig til å ta god kvalitet NMR spektra med relativt korte innhentingstider.
- Tilberedning av en histone octamer med forskjellig isotop-merkede (og asymmetrisk modifisert) histon H3
MERK: Rekombinant histonproteinene kan fremstilles i mg mengder i BL21 (DE3) pLysS-celler 14. For å oppnå isotopmerkede histoner, er det samme uttrykk / renseprotokoll fulgt med den unntagelse at man anvendte for bakterievekst et minimalt medium inneholdende 15 NH4CI og / eller 13C-glukose som nitrogen- og karbonkilder, for 15 N- eller 13 C-merking respektivsvis. Rensede histoner er i utstrakt dialysert mot 5 mM β-merkaptoetanol og lagres frysetørket før bruk.- Oppløs lyofiliserte histon alikvoter inneholdende ~ 5 mg av hver histon i 1 ml utfolding buffer (7 M Guanidinium-HCl, 20 mM Tris pH 7,5, 10 mM DTT). Ta med begge typer histon H3. Bland ved pipettering og ikke vortex. Hold rørene på is i 30 min for å tillate full utfoldelse.
- Bestemme den nøyaktige konsentrasjonen av hver histon ved å måle absorbansen ved 280 nm mot utfolding buffer og ved å bruke ekstinksjonskoeffisienter beregnet med den ProtParam verktøyet i ExPASy portalen. 15
- Bland kjernen histoner til ekvimolare forhold, husk å ta med 50% hver av de to histone H3 bassenger. Start med å bruke hele innholdet i mindre konsentrert histone og legge til alle de andre tilsvarende.
- Juster endelig proteinkonsentrasjon ca. 1 mg / ml ved hjelp av utfoldelsen buffer.
- transfer av blandingen til en 6 kDa-cutoff dialysemembran og dialyser mot 1-2 L kjølt refolding buffer (10 mM Tris pH 7,5, 2 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT) ved 4 ° C. Forandre bufferen minst én gang etter dialyse har foregått i minst 3 timer. Utfør en endelig dialyse O / N ved 4 ° C.
- Samle dialyserte materiale og fjerne eventuelle bunnfall ved sentrifugering i en mikrosentrifuge i 5 minutter ved 4 ° C på maksimal hastighet (vanligvis noen utfelling bør observeres). Bestem octamer konsentrasjon ved å måle absorbansen ved 280 nm. I beregningene bruke den ekstra ekstinksjonskoeffisientene av histoner, husk å doble hver verdi.
- Konsentrer til et sluttvolum på ~ 2 ml ved anvendelse av en 10 kDa-cutoff sentrifugale filterenhet. Omberegne octamer konsentrasjon og estimat tap. På dette punktet, en octamer konsentrasjon på mellom 50 - skal oppnås 100 uM.
- Koble gelfilterkolonnen (oppgitt i tabellen of Materials) til enFPLC-system og i likevekt med 2 kolonnevolumer (CV) på 0,22 um-filtrert og avgasset refolding buffer ved en strømningshastighet på 1 ml / min og en trykkgrensen på 0,5 MPa.
MERK: gelfiltrering kjøring skal utføres i kjølerommet eller i en kald skap. - Injisere konsentrerte materiale under anvendelse av en strømningshastighet på 1 ml / min, og samle 1,0 - 1,5 ml fraksjoner.
- Følg kromatografiske profil og observere histon octamer eluering på ~ 65 - 68 ml.
MERK: En liten skulder av elueringstoppen og en topp på ~ 80 ml indikerer eksistensen av gratis H3-H4 tetramers og H2A-H2B dimerer, henholdsvis. - Kjør 20 ul av hver oppsamlet fraksjon på en 18% SDS-PAGE-gel.
MERK: Fortynn prøvene med en faktor på minst 2 med vann før å legge dem på gelen for å redusere den høye saltkonsentrasjon og dermed unngå forvrengninger. Det samme gjelder for de påfølgende SDS-PAGE-analyser av prøver i refolding buffer. - Pool relevant FRActions inneholder rene octamers vurdert av lik fordeling av de 4 histoner på farget gel og bestemme konsentrasjonen som før (trinn 1.1.7).
- Koble en 1 ml Ni-NTA-kolonne (Table of Materials) til et FPLC-system og i likevekt med 10 CV på 0,22 um-filtrert og avgasset refolding buffer ved en strømningshastighet på 1 ml / min.
MERK: Ni-NTA kromatografi skal utføres i kjølerommet eller i en kald skap. - Passere renset octamer gjennom Ni-NTA ved anvendelse av en strømningshastighet på 1 ml / min.
- Samle gjennomstrømnings og holde prøver for SDS-PAGE / WB-analyse (20 pl og 4 ul, henholdsvis). Deretter vaskes kolonnen med 10 CV av buffer refolding eller inntil et referansesignal er nådd.
- Elueres med 10 CV av refolding buffer inneholdende 250 mM imidazol ved hjelp av en strømningshastighet på 1 ml / min. Holde prøver for SDS-PAGE / WB-analyse (20 pl og 4 ul, henholdsvis).
- Ekvilibrere en 1 ml affinitetskolonne av acommercial streptavidin (Table of Materials) med 10 CV refolding buffer som inneholder 250 mM imidazol ved hjelp av en batch / tyngdekraft flyt oppsett.
MERK: Dette kromatografiske trinnet skal utføres i kjølerommet. - Pass Ni-NTA eluering gjennom kommersielle streptavidin affinitetskolonne.
- Samle strømningen gjennom og holde prøver for SDS-PAGE / WB-analyse (20 pl og 4 ul, henholdsvis). Deretter, vask med 10 CV av buffer refolding.
- Elueres med 10 CV av refolding buffer som inneholder 2,5 mM desthiobiotin. Hold prøver for SDS-PAGE / WB-analyse (20 og 4 mL henholdsvis).
- Mål octamer konsentrasjon, legge til 10 ganger mindre TEV protease og la reaksjonen forløpe over natten ved 4 ° C i en standard plast sentrifugerør.
MERK: Den nødvendige mengden av TEV å få fullstendig fordøyelse (fjerning av affinitet tags) avhenger av opprinnelse (konstruere) og på aktiviteten (rykende fersk, er mer rekombinant TEVaktiv sammenlignet med den som er lagret i lengre perioder ved - 80 ° C). Prøv i første omgang å legge til 10 ganger mindre TEV forhold til octamer (beregnet som proteinkonsentrasjoner) og justere deretter. - Sjekk for effektiv fordøyelse ved å kjøre 20 ul av blandingen før og etter tilsetning TEV på en 18% SDS-PAGE-gel. Hvis fordøyelsen er ikke komplett, legger mer TEV protease og fortsette inkubasjon i en annen 3-4 timer.
- Dialyser mot prøvebuffer refolding ved hjelp av et 50 kDa-cutoff dialysemembran for å fjerne TEV protease og justere bufferblanding.
- Konsentrer den rensede asymmetriske octamer ved hjelp av et 10 kDa-cutoff sentrifugale filterenhet (det samme filterenheten fra trinn 1.1.7 kan også brukes) til et volum på 1,0-2,0 ml. Mål sluttkonsentrasjon. Enten brukes kort tid etter for nucleosome rekonstituering eller justeres til 50% (v / v) glycerol for å lagre ved -20 ° C i lengre perioder. På dette punktet, og ventet minst 70% tap i løpet av de foregående trinnene, the octamer konsentrasjon bør være i området fra 20 - 50 uM.
- nucleosome tilberedning
- Hvis octamer ble lagret i 50% glycerol, dialyser over natten ved 4 ° C mot buffer før refolding fortsetter med nucleosome rekonstituering.
- Juster DNA (inneholdende et nukleosom-posisjonerings sekvens) saltkonsentrasjonen til 2 M NaCl ved anvendelse av en 5 M NaCl lageroppløsning.
NB: Det rensede DNA enten isolert etter rensing av et plasmid som inneholder flere kopier av den ønskede sekvensen, eller syntetisert ved hjelp av PCR-amplifikasjon bør lagres konsentrert til ~ 50 uM i vann eller en standard Tris-EDTA-buffer. - Bland octamer og DNA ved å bruke det optimale forhold bestemmes ut fra en liten-skala test. Bruk refolding buffer for å justere det endelige volum til ~ 3,0 ml. Alltid legge octamer siste for å hindre enhver mulighet for å blande octamer og DNA på <2 M saltkonsentrasjoner.
- Utføre innledende liten-scale reconstitutions å bestemme octamer: DNA-forhold som fører til optimale nucleosome avkastning. For dette, montere tre reaksjoner på 0,9: 1,0, 1,0: 1,0, og 1,1: 1,0 DNA: octamer forhold i et volum mellom 50-100 mL. Vanligvis bruker en konsentrasjon på 5 pM DNA.
- Fortsett med rekonstituering, som beskrevet nedenfor (trinn 1.2.4-1.2.8) og ved enden, beregne mengden av oppløselig og god kvalitet rekonstituert nucleosome ved å måle DNA-konsentrasjon på 260 nm og ved å kjøre en 6% innfødt-PAGE-gel DNA , beiset med etidiumbromid, henholdsvis (figur 5A).
- Overfør blandingen til en 6 kDa-cutoff dialysemembran og dialyser mot 1 liter refolding buffer over natten ved 4 ° C.
- Redusere saltkonsentrasjonen av dialysebufferen i en trinnvis måte fra 2 til 0,85, 0,64 og 0,2 M NaCl hhv. Holde prøven i hver buffer i minst 3 timer. Noen ganger presipitat er dannet etter den siste overgang. I dette tilfellet c, rediger dialyse som planlagt og fjerne bunnfallet ved sentrifugering mikrosentrifuge ved slutten av neste trinn.
- Overføring dialysemembran i et begerglass med 1 liter av analysebuffer (25 mM NaH 2PO 4 / Na2 HPO 4 pH 6.8, 25 mM NaCl, 2 mM DTT) og fortsett dialyse O / N ved 4 ° C.
- Samle prøven, fjerne eventuelt bunnfall som dannes i trinn 1.2.5 ved sentrifugering i en mikrosentrifuge i 5 minutter ved 4 ° C på maksimal hastighet og konsentrer ved hjelp av et 30 kDa-cutoff sentrifugale filterenheten til et endelig volum på ~ 300 ul.
- Mål-DNA-konsentrasjon på 260 nm, kjøres en 18% SDS-PAGE-gel protein (4 ul av prøven), og en 6% nativ PAGE-DNA-gel (0,2 ul av prøven) og lagre prøven ved 4 ° C i flere uker. Sluttkonsentrasjonen bør være i området fra 10 til 20 uM.
2. NMR analyse av Modifikasjon reaksjoner på de to søster Histoner
MERK: Tildeling av2D 1 H-15 N korrelasjon spek nukleosomale histone haler kan bli funnet på referanser 16, 17, 18. I tillegg oppdrag av CH x grupper av lysines, seriner og treoniner på 2D 1 H-13 C korrelasjon spektra kan bli funnet på referanse 16.
- NMR oppsett og innspilling av referansen spektra
MERK: Enzymatiske analyser ble utført ved bruk av 140 mL av nucleosome prøven i analysebuffer til en 3 mm NMR-rør ved 300 K. forskjellige NMR-rør med andre prøvevolumer kan også anvendes. Den forannevnte temperatur er passende for å oppnå god kvalitet 1 H 15 N korrelasjonsspek nukleosomale histon haler og gode enzymatiske aktiviteter. 2D-SOFAST-HMQC en H- 15 N og 2D-HSQC en H- 13C spektra ble registrert henholdsvis med et oppsett that overfører tilsvarinnhentingstider. Typiske innhentingsparametere er 128 transienter med 1,024 (1H) x 128 (15 N) komplekse poeng og 32 transienter med 1,024 (1 H) x 64 (13 C) kompleks punkter for de to ulike typer av korrelasjonsspektra. For både 2D spektra, oppkjøpet gang var ~ 30 min.- Satt 300 K som prøvetemperaturen i spektrometeret. Tilsett 10% D 2 O (v / v) til prøven som skal brukes for spektrometeret frekvens låsen.
- Plasser prøven i spektrometeret og utføre grunnleggende operasjoner (låsing, tuning, mellomlegg). I tillegg bestemme optimale pulslengder og generelle oppkjøp parametre.
- Record 1D og 2D 1 H-15 N og en H-13 C referanse spektra.
- Fremgangsmåte referanse-spektra og sikre at signalene som skal brukes for å kartlegge modifikasjons reaksjoner er godt oppløst og har god intensitet.
- Gjenopprette prøve og overføre jegt til et mikrosentrifugerør.
- Oppsett av den enzymatiske reaksjon, NMR overvåking og kvantitativ analyse
- Kopier og arrangere en serie innfelte 2D 1 H-15 N og en H-13 C spektra. Målet for en total innsamlingstiden på flere timer og justere deretter i en ny kjøring basert på den enzymatiske prisene som oppnås fra den første reaksjonen.
- Legg til prøven nødvendige kofaktorer for den respektive type modifikasjon reaksjon (1 mM ATP / 2 mM MgCl2 for fosforylering, 1 mM acetyl-CoA for acetylering, 1 mM SAM for metylering, osv.).
- Legg enzymet av interesse, bland ved pipettering, overfør prøven tilbake i NMR-røret, og deretter i spektrometeret (utføre disse operasjonene raskt).
MERK: Hvis det ikke er data om forventet enzymatisk aktivitet, justere underlaget til enzymet molarforhold til 10: 1. Utfør en første prøvetur og justere deretter forden virkelige løp. - Utfør en rask automatisk shimsingen og bruke resten av parametrene fra referansespektra.
- Initiere rekken av de innfelte 2D-1 H-15 N og en H-13 C-spektra.
- Følge progresjonen av reaksjonen i sann tid og stoppe anskaffelse når reaksjonen har nådd fullfør eller et ønsket nivå.
- Prosess spektra som før med nøyaktig de samme parametrene.
- Gjenta hele ballen ved hjelp av en annen anskaffelse For at de to typer av korrelasjonsspektra. Hvis det i det første eksperimentet en 1 H-15 N korrelasjon var første i rekken, starter nå med en 1 H-13 C korrelasjon. Ved denne og har samme innsamlingstiden for begge spektra, er det mulig å plotte og sammenligne PTM reaksjoner på begge differensielt isotopmerkede histoner for den samme tidsskala. I tillegg er det mulig å beregne gjennomsnitt og plottet feilfelt.
MERK: En thorough beskrivelse av metoder for NMR-signalanalyse og påfølgende kvantifisering av enzymatiske reaksjoner finner du her 19. - Velge NMR-signalene fra hver tidsforløpet NMR-spektrum som rapporterer progresjonen av reaksjonen og beregne deres relative signalintensiteter ved hjelp av en visualisering og analyse programvare for NMR-spektra. Gjør dette for signaler som rapporterer den umodifiserte samt modifiserte tilstand. Pakk endringsnivåer.
- Plotte de beregnede verdier av modifikasjonsnivåer mot reaksjonstiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Riktig refoldede octameric arter er isolert etter en kjøre av tilberedning blandingen gjennom en gelfiltreringskolonne (figur 2). Det rekonstituerte octameric basseng inneholdende de tre forskjellige typer av octamers underkastes den tandem affinitetsrensing ordningen. Prøver samles fra alle trinnene og analysert ved hjelp av SDS-PAGE og deretter WB. Verifisering av den korrekte utførelse av den protokoll som resulterer i isolering av asymmetriske art oppnås ved å følge nærværet av de to affinitet koder (his- og Strep-) i de forskjellige prøver (figur 3). Deretter blir affinitet tags fjernet etter TEV protease fordøyelsen (figur 4). Asymmetriske octamers avhendes affinitet kodene brukes til å rekonstituere asymmetriske nucleosomes. Først blir en liten prøve-skala rekonstituering anvendes for å bestemme det optimale molare forhold mellom DNA: octamer som resulterer i en høyutbytte dannelse av en monodisperse kompleks. Deretter blir optimalisert blandingsforholdet ansatt for å rekonstituere nukleosomer i en storstilt. Nucleosome reconstitutions analyseres ved hjelp av protein / DNA-geler og NMR-spektroskopi for riktig montering og nærværet av de differensielt isotopmerkede beslektede H3 histoner henholdsvis (figur 5). Et anvendelseseksempel er vist i figur 6. Spesielt forskjellig isotop-merkede og asymmetrisk fosforylert på H3S10 nukleosomer omsettes med Gcn5 acetyltransferase, og acetylering av H3K14 på begge H3 kopier følges i sanntid ved NMR-spektroskopi. Analysen viser at H3S10 fosforylering stimulerer H3K14 acetylering av Gcn5 i cis i forhold til i trans.
Figur 1: Flytskjema for utarbeiding av Forskjellig Isotop-labeled (og asymmetrisk modifisert) nucleosomes. (A) Tilberedning og tandem affinitet rensing av differensielt isotop-merkede (og asymmetrisk modifisert) histone octamers. (B) nucleosome tilberedning ved å kombinere de rensede asymmetriske octamers og en DNA nucleosome-posisjonering sekvens. (C) NMR-overvåking av i-cis og trans-modifikasjonen krysstale etter blanding av de asymmetrisk modifiserte og differensielt isotopmerkede nukleosomer med histon-modifiserende enzymer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Tilberedning av histon Octamers. En gelfiltrering elueringsprofilen til refoldet histon blanding. Den store topp ved ~ 70 ml tilsvarer histon octamers. En 14 - 20% gradient SDS-PAGE-gel (Coomassie-blått-farging) av eluerte fraksjoner som svarer til den octamer toppen viser riktig histon støkiometri. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Rensing av Asymmetriske histone Octamers. 14-20% gradient SDS-PAGE gel (Coomassie farging) og WB mot historisk og Strep- tilhørighet tags av prøver fra de ulike stadiene i tandem affinitet rensing ordningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Fjerning av Affinity tagger. 18% SDS-PAGE-gel (Coomassie-farging) av rensede asymmetrisk histon octamers før og etter blanding med TEV protease. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Biokjemisk og NMR karakterisering av Forskjellig Isotop-merket nucleosomes. (A) til 6% nativ PAGE-DNA-gel (etidiumbromidfarging) av en liten prøve-skala nucleosome rekonstituering ved hjelp av ulike molare forhold av DNA: octamer (til venstre). 6% nativ PAGE-DNA-gel (etidiumbromidfarging) av en stor-skala nucleosome rekonstituering ved hjelp av optimalisert DNA: octamer molforhold (høyre). (B) 18% SDS-PAGE-gel protein (Coomassie-farging) av rekonstituert nukleosomer viser den korrekte støkiometri av de fire kjerne histoner. (C) 1 H 15 N SOFAST-HMQC spektrum av den 15 N-merket H3 kopi av differensielt isotopmerkede nukleosomer (bare H3 hale rester er synlige - proteinet kjernen er usynlig på grunn av langsom risting rate). (D) en H-13 C HSQC spekteret til 13 C-merket H3 kopi av differensielt isotopmerkede nucleosomes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: NMR Overvåking av I cis og trans Modifisering Cross-talk ilagt av Asymmetric Fosforylering av H3S10 på H3K14 acetvlering aktivitet av Gcn5 acetyltransferase. (A) Skjematisk fremstilling av forskjellig isotop-merkede og asymmetrisk fosforylert på H3S10 nukleosomer reagert med Gcn5 acetyltransferase og H3K14 acetylering kartlegging, i cis og trans. (B) en H- 15 N SOFAST-HMQC og en H-13 C HSQC spektra (utvalgte regioner) av de asymmetriske nukleosomer før og etter reaksjon med Gcn5. (C) Time-løst NMR overvåking av H3K14 acetylering av Gcn5 på asymmetrisk H3S10 fosforylerte nucleosomes. Gjennomsnitt og variasjons (feilfelt) fra to uavhengige eksperimenter er vist. Gjengitt med tillatelse 16. Klikk her for å se en større versjon avdette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For nucleosome tilberedning, utnytter dagens protokollen en 165 bp lang DNA-templat som inneholder 601-Widom nucleosome posisjonering sekvens 20, men tilsvarende ytelse er forventet ved hjelp av ulike lengder av DNA-maler. Protokollen ble designet og ansatt ved hjelp av asymmetriske typer histon H3. Med det samme prinsipp kan fremgangsmåten anvendes også for andre kjerne histoner og i tillegg kan brukes til blanding av komplekser som bærer to adskilte kjerne histoner med forskjellige isotoper etiketter. Protokollen kan også litt modifisert til utgangspunktet rekonstituere histone under komplekser og ikke direkte histon octamers. Etter denne endringen, kan asymmetriske H3-H4 tetramers rekonstitueres ved å bruke den samme tandem rensing ordningen. Sistnevnte er blandet med separat rekonstituerte H2A-H2B dimerer og DNA for å montere nucleosomes 16. De endelige avkastning og den generelle ytelsen til den modifiserte protocol er lik den opprinnelige.
Protokollen er sterkt avhengig av evnen av de to affinitetskolonner for effektivt å binde de aktuelle arter, og dermed for å gi ved utgangen høyrene asymmetriske komplekser. Det er tungvint å gi direkte og konkret bevis på at den endelige rensede komplekset er faktisk og bare asymmetrisk. Men WB analyse av prøver fra alle rensetrinn med de aktuelle antistoffene gir pålitelige indikasjoner for å lykkes i tandem rensing ordningen (figur 3). De samme resultatene, og dermed ekstra sikkerhet, ble oppnådd ved å analysere de samme prøvene for tilstedeværelse av affinitet kodene ved NMR-metoder 16. Likevel, hvis WB analyse indikerer forurensning av asymmetriske arter med symmetriske seg, en liten variasjon kan bli vedtatt på det første rensetrinnet (Ni-NTA) som kan forbedre utfallet. Spesielt, i stedet for en isokratisk eluering, et imidazol gradien t eluering (10-250 mM) kan anvendes, og da, bare de første elueringsfraksjonene som er sterkt anriket i de asymmetriske artene er slått sammen og kjørt gjennom affinitetskolonne. Dette kan vurderes ved WB analyse av elueringsfraksjonene for tilstedeværelsen av den strep affinitetsmerkelapp.
Utvelgelsen av det isotop-merket i forhold til PTM av interesse er ganske fleksibel fordi for de fleste tilfeller, er NMR i stand til å kartlegge den samme PTM ved hjelp av både en H-N 15 og en H-13 Ccorrelation spektra. Imidlertid, for visse aminosyrer, som lysin, er den kjemiske forskyvning dispersjonen for sidekjede-1 H- 13 C resonanser ganske begrenset. I tillegg, når målse av en lysin-modifiserende enzym er ukjent, er stedsspesifikke avlesing av lysin PTMs ikke enkelt. I disse tilfellene alternative metoder anvende sete-selektiv 13 C-merking, kombinert med halvsyntetisk histon produksjons"> 21 eller ved bruk av nylig etablerte NMR-pulssekvenser som muliggjør spesifikk påvisning av modifikasjons tilstander ved selektiv eksitasjon rutiner 22. NMR-spektroskopi overfører heller lav følsomhet. I dette henseende, er forholdsvis høye mengder av nukleosomer (pM området) er nødvendig for å utføre enzymatiske reaksjoner. Dette hindrer utviklingen av metoden til en høy gjennomstrømming oppsett.
Samtidig er det innført en ny kjemisk metode for syntese av kjemisk rene, asymmetrisk modifiserte nukleosomer, med høye utbytter, bærer definert PTMs 23. Denne tilnærmingen har vært brukt i kombinasjon med fluorografi, for å studere PTM krysstalemekanismer. På grunn av den lave oppløsningsevne av fluorografi metoder i å detektere PTMs, konklusjoner ble utledet indirekte ved å sammenligne totale enzymatiske aktiviteter på et sett av nukleosomer som bærer forskjellige kombinasjoner av symmetriske og asymmetriske PTMs, hellerenn ved direkte observasjon av PTM reaksjoner på de tilsvarende områder av hver søster histone. Imidlertid inkorporering av isotopisk merkede histoner og bruk av NMR-spektroskopi for PTM utlesning vil kunne utgjøre den ovenfor nevnte fremgangsmåten et tilleggsverktøy for høy oppløsning PTM analyse av asymmetrisk modifiserte nucleosomes.
I forbindelse med identifisering av nye typer asymmetrisk modifiserte nukleosomer i fremtiden, sikter den nåværende metoden for å utgjøre en høy oppløsning verktøy for å analysere i cis- og trans-PTM i krysstale reaksjoner på nukleosomale substrater. Spesielt, av høy viktighet er dekodingen av krysstale mekanismene som gir opphav til toverdige nukleosomer 24 som inneholder asymmetrisk, både transkripsjonelt aktive og undertrykkende PTMs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatteren takket Dr. Philipp Selenko (FMP-Berlin) for å gi wet-lab plass og infrastruktur for å utføre eksperimenter og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) for å finansiere arbeidet gjennom et forskningsstipend (LI 2402 / 2-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidinium HCl | Applichem | A14199 | Use high quality Gu-HCl |
| Tris | Roth | 4855.2 | |
| DTT | Applichem | A1101 | |
| NaCl | VWR chemicals | 27810.364 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Na2H2PO4 | Applichem | A1046 | |
| NaH2PO4 | Applichem | A3902 | |
| Imidazole | Applichem | A1073 | |
| d-Desthiobiotin | Sigma | D1411 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 1034557 | |
| Strep-Tactin Superflow | IBA | 2-1207-001 | |
| His-probe antibody | Santa Cruz | sc-8036 | |
| Strep-tactin conjugated HRP | IBA | 2-1502-001 | |
| Hi-Load 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28-9893-35 | |
| 6 - 8 kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 1, 132650 | |
| 50 kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 7, 132129 | |
| 10 kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC901024 | |
| 30 kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC903024 | |
| Solution-state NMR spectrometer | at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe | ||
| Buffer name | Component | ||
| Unfolding Buffer | 7 M Guanidinium HCl | ||
| 20 mM Tris, pH 7.5 | |||
| 10 mM DTT | |||
| Refolding Buffer | 10 mM Tris, pH 7.5 | ||
| 2 M NaCl | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 2 mM DTT | |||
| Assay Buffer | 25 mM Na2H2PO4, pH 6.8 | ||
| 25 mM NaCl | |||
| 2 mM DTT |
References
- Hansen, J. C. Conformational Dynamics of the Chromatin Fiber in Solution: Determinants, Mechanisms, and Functions. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31, 361-392 (2002).
- Clapier, C. R., Cairns, B. R.
- Musselman, C. A., Lalonde, M., Cote, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and Combinatorial Functions of Histone Modifications. Annu. Rev. Biochem. 80, 473-499 (2011).
- Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A.
- Liokatis, S., et al. Phosphorylation of histone H3 Ser10 establishes a hierarchy for subsequent intramolecular modification events. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (8), 819-823 (2012).
- Voigt, P., et al. Asymmetrically Modified Nucleosomes. Cell. 151 (1), 181-193 (2012).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat. Struct. Mol. Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative Proteomic Analysis of Histone Modifications. Chem. Rev. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Liokatis, S., Dose, A., Schwarzer, D., Selenko, P. Simultaneous Detection, of Protein Phosphorylation and Acetylation by High-Resolution NMR Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 132 (42), 14704-14705 (2010).
- Binolfi, A., et al. Intracellular repair of oxidation-damaged α-synuclein fails to target C-terminal modification sites. Nat. Commun. 7, 10251 (2016).
- Schanda, P., Kupce, E., Brutscher, B. SOFAST-HMQC experiments for recording two-dimensional heteronuclear correlation spectra of proteins within a few seconds. J. Biomol. NMR. 33 (4), 199-211 (2005).
- Theillet, F. X., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of Nucleosome Core Particles from Recombinant Histones and DNA. Methods Enzymol. 375, 23-43 (2004).
- Artimo, P., et al. ExPASy :SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40 (W1), 597-603 (2012).
- Liokatis, S., klingberg, R., Tan, S., Schwarzer, D. Differentially Isotope-Labeled Nucleosomes to Study Asymmetric Histone Modification Crosstalk by Time-Resolved NMR Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (29), 8262-8265 (2016).
- Stützer, A., et al. Modulations of DNA Contacts by Linker Histones and Post-translational Modifications Determine the Mobility and Modifiability of Nucleosomal H3 Tails. Mol. Cell. 61 (2), 247-259 (2016).
- Zhou, B. R., et al. Histone H4 K16Q Mutation, an Acetylation Mimic, Causes Structural Disorder of Its N-terminal Basic Patch in the Nucleosome. J. Mol. Biol. 421 (1), 30-37 (2012).
- Theillet, F. X., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), 19-42 (1998).
- Hackenberger, C. P., Schwarzer, D. Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (52), 10030-10074 (2008).
- Theillet, F. X., et al. Site-specific mapping and time-resolved monitoring of lysine methylation by high-resolution NMR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7616-7619 (2012).
- Lechner, C. C., Agashe, N. D., Fierz, B. Traceless Synthesis of Asymmetrically Modified Bivalent Nucleosomes. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (8), 2903-2906 (2016).
- Bernstein, B. E., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125 (2), 315-326 (2006).
