Summary
原油的低能量水容纳部分（LEWAF）是一个具有挑战性的系统来分析，因为随着时间的推移，这种复杂的混合物发生化学转变。这个协议说明了LEWAF样品的准备和用于通过俘获离子迁移谱-FT-ICR质谱进行光照射和化学分析方法。
Abstract
多种化学过程控制石油原油是如何被纳入到海水中，也发生加班的化学反应。研究这种系统需要的样本，以准确的复制出现在自然界的水容纳部分的自然形成的精心准备。低能量水容纳部分（LEWAF）都是严格在设定的比例混合原油和水配制。然后抽吸瓶照射，并在设定的时间点，水进行采样，并使用标准技术提取。第二个挑战是样本，必须考虑到，随时间发生的化学变化的代表特性。可以使用耦合到定制的俘获离子迁移谱傅立叶变换离子回旋共振质谱（TIMS-FT常压激光电离源来执行LEWAF的芳烃馏分的目标分析-ICR MS）。所述TIMS-FT-ICR质谱分析提供的高分辨率离子迁移和超高分辨率MS分析，其中，还允许同分异构组分的鉴定可以通过碰撞截面（CCS）和化学式。结果表明，随着油 - 水混合物被暴露于光，有表面油的显著光溶解到水中。随着时间的推移，溶解的分子的化学转变发生时，在含氮和含硫物种的标识的数量有利于那些具有更大的氧含量比在基础油中典型地观察到的降低。
Introduction
有环境暴露原油的来源众多，无论是从自然原因和人为风险。在释放到环境中，特别是在海洋中，原油可经历分区，与浮油的表面上的形成，挥发性组分到大气中的损失，和沉积。然而，难溶油和确实发生的水，并将该混合物，这是不经典溶解，低能量混合形成什么作为低能量的水容纳部分（LEWAF）简称。在水中的油组分的增溶的油 - 水界面的暴露于太阳辐射中，通常提高。在海洋中的原油的照片增溶可以因此暴露于太阳辐射和/或由于酶促降解1,2经历显著化学变化。理解这些化学变化和他们是如何发生在散装矩阵（ 即，原油）的存在是为了减轻这种曝光，对环境的影响的基础。
以前的研究已经表明，原油经受氧化，特别是多环芳香烃（PAHs），这代表污染一个危害生物，经过生物积累的剧毒源，并且是生物活性3，5，6。因为它们只发生在本体基体的存在理解不同的氧合过程的产物是具有挑战性的。因此，一个单一的标准分析可能不具有代表性的天然存在的变化。该LEWAF的编制必须复制了发生在一个环境背景自然过程。特别感兴趣的是多环芳烃的充氧，发生由于太阳辐射。
T“>在水容纳部分的研究的第二个挑战是在样品中的不同的化学成分的分子鉴定。由于样品的复杂性，所造成的高的质量和氧气的程度，氧化产物是通常不适合于传统的分析用气相色谱法与质谱分析7,8结合进行。另一种方法是通过利用超高质量分辨率质谱技术（ 例如，FT-ICR质谱来表征样品的化学式中的变化），通过耦合TIMS到FT-ICR质谱，除了在MS域中的同量异序的分离，离子迁移光谱（IMS）的尺寸为存在于样品9，10，11中的不同的异构体的分离和特征信息。与大气压力激光组合电离（APLI）源，分析可以是选择性的样品中发现的共轭分子，允许改变该多环芳烃经受是准确特征12,13。在这项工作中，我们描述了为了研究油成分的变换处理暴露于光照射LEWAFs的制备的协议。我们还说明了在光照射时发生的变化，以及对样品提取的过程。我们也将呈现使用APLI与耦合用FT-ICR质谱表征在LEWAF多环芳烃作为曝光于光的功能TIMS。
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Protocol
1.低能量水容纳馏分的准备（LEWAF）
- 通过漂洗用二氯甲烷瓶子以除去任何潜在的污染物干净的2升抽吸瓶。
- 灌装瓶用50ml二氯甲烷，将其关闭，并搅拌30秒。沥干他们到合适的废物容器。重复总共洗涤三次。
- 使用一个抽吸瓶照射曝光而另一个瓶作为对照样品（使用重复组，每组如果可能的）。
- 每用于33份每千最后盐度1升的水混合35克海盐混合物准备人工海水。过滤下小的溶液或无负压防止用装有0.45微米或更小的细孔过滤器的过滤装置的挥发性化合物的损失。
- 装满人工海水抽吸瓶，剩下约20％，或400毫升，顶空的。 原油添加到使用气密注射器以1g油/ L的标称浓度预定量的海水。
注：更多的粘性油应该重量递送。 - 在加入油后，在黑暗中（或通过覆盖有铝箔抽吸瓶）利用在低速操作的搅拌盘无涡流（约100rpm）下的产生，以允许混合24小时的解所有的水溶性成分进入溶液，并避免微粒油的包容。
2. LEWAF光照射，样品采集和处理
- 准备两套瓶的每个光照射实验。
- 盖一组用铝箔抽吸瓶;这将是暗控制。
- 放置抽吸瓶在温度控制的水浴集以保持太阳能照射配备无线的内部，在25℃的温度下的抽吸瓶在765瓦/米2的光强度第一个1500瓦氙弧灯。
- 连续照射的样本的所需时间（在此实验持续115 H）;没有最长时间。
- 后设定的时间，（在此实验15，24，48，和115高）由拔去塞子吸气瓶并打开排水阀收集150毫升水从玻璃抽吸器的底部。
- 利用分液漏斗通过添加二氯甲烷50毫升等分试样，振摇2分钟定期排空漏斗，以避免从吹离塞子的样品进行与二氯甲烷液 - 液萃取。
- 使各相分离，并通过从漏斗除去塞子除去底部的有机相和缓慢打开排水阀。沥干样品到装有填充用100克Na 2 SO 4的漏斗的平底烧瓶中。冲洗用另外的二氯甲烷漏斗为了执行提取3次人口增加Ë提取效率。
注意：多个提取是为了提高该过程的提取效率进行。 - 取下漏斗，添加一个斯奈德列和放置的平坦底部烧瓶在设定为58℃的热水浴中。蒸发直至样品的15毫升保持。
- 将样品转移到集中管使用氮气小心飞溅，避免样品损失吹干干燥样品。
3.分析试样的制备
注意：用于分析样品制备是关键，必须小心，以避免引入外来杂质，特别是通过使用的任何塑料，这将导致浸出进入样品。
- 制备的1的混合物：利用LC-MS最优级溶剂甲苯：1体积：体积甲醇。
- 使用正位移微量，添加溶剂的玻璃小瓶中，然后以1:1的比例添加样品：100，先加入的溶剂990微升，然后通过添加样品的10μL的。
注：玻璃微量移是为了避免榨取使用，由于二氯甲烷或甲苯。 - 可选：使用混合调谐校准离子迁移。
注：一个API源往往会浸出如果经常作为校准标准使用。 1000稀释：如果校准离子中不存在的光谱，然后混合物可以通过加入一些以1标准溶液到样品的制备。
4.傅立叶变换离子回旋共振质谱（FT-ICR MS）分析
- 通过点击操作按钮，仪器设置到“操作”模式。
- 加载样品到样品注射器中。
- 根据API源选项卡，设置在200微升/ h的速度输液速度。
- 设置喷雾器压力为1巴，蒸发器温度到300℃。
- 将干气率1.2升/分钟，温度为220℃。
注：此过程同时适用于APPI和APCI。 - 通过单击调按钮设置仪器“调”模式。频谱应该出现在屏幕上。
注意：如果需要，仪器可在顺序通过改变仪器参数，如电压，RF频率，和幅度提高分析物的m / z范围的离子传输和检测进行优化。需要注意的是质谱仪将需要重新校准。 - 通过点击停止按钮停止“调”模式。
- 设定的扫描次数为每质谱20-200扫描之间平均，典型地，按获取按钮获取的质谱。
注：平均多个光谱提高通过降低噪声和增加对低丰度品种14的信号的总体信噪比。
5.囚禁离子迁移SPECTRometry（TIMS）分析
- 启用了FT-ICR的收购计划“色谱”模式。
- 通过在外部断路器TIMS接通开关使能“TIMS”模式。
注：在TIMS使用的电压从仪器外部控制。第二软件将控制来执行的IMS分析仪器的入口漏斗。 - 打开补充粗抽泵，并使用TIMS的控制阀，调节所述入口和出口压力，以期望的范围（在该实验中，P1被设定为2.8毫巴和P2至1.4毫巴）。
注：外部泵应在几个小时分析之前被接通，以确保所述泵是温暖和性能是IMS分析期间均匀，因为在气体速率的变化会引起光谱的错误。 - 首先确定需要执行所述IMS分析的电压范围;这是一个快速，粗略在宽电压范围（250 V）在搜索完成IMS低解析度（1 V /帧）。
- 如果所用的电压是足以分析整个频谱，然后重复实验，调整TIMS为更高分辨率的分析。这样做，减小V /帧为0.1V和改变帧的数目，以涵盖所有的ΔV 坡道 。
注意：用户可能需要优化的被累加到之前对FT-ICR质谱分析碰撞单元TIMS实验次数。
6.数据分析
- 在数据分析软件打开MS数据。
- 设置峰值采集标准来选择与上述6的信号与噪声和使用“查找峰”功能。
注意：得到的光谱是使用存在于溶液中的标准内部重新校准。这被用来确定化学系列，然后，为了提高对宽范围的元素分配的准确性再次重新校准。 - 使用公式分配进行元素赋值换货工具或软件。
注：H 1-100ñØ0-2 0-7 0-2小号，奇数和偶数的电子配置，允许的Ç1-100公式的限制，并为0.5ppm M +的质量宽容和[M + H] +离子的形式 - 在IMS-MS数据导入到数据分析软件，并为整个分析范围的平均质谱。
- 上述6的信号 - 噪声选择峰。使用在所述超高分辨率MS分析，鉴定系列，在内部重新校准光谱
- 从FT-ICR MS分析使用公式标识，生成所有目标M / Z的名单，并在数据文件夹本另存为“Flist.txt”。该列表将在数据处理的第一步骤中使用
- 加载并以提取列表中的每个目标M / Z的提取离子色谱（EIC）运行所提供的脚本。
- 修改python脚本输入文件主任y，则启动电压，步长，并在该目标分析11个步骤的数量。
- 运行IMS反褶积脚本。
注意：这将打开每个EIC和迭代高斯拟合确定的峰值。结果将在Excel文件格式输出13。
注：嵌合后，低于一定标准的峰被排除在外，通常基于高度，宽度和峰的面积（一定宽度以下的峰通常从分析中排除，因为随机噪声尖峰的）。 - 利用调谐峰，从电压校准离子迁移率的离子11的流动性。这可以转换为使用梅森 - Schamp方程碰撞截面。
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Representative Results
通过TIMS-FT-ICR MS结果中基于M / Z和TIMS捕获电压的二维频谱LEWAF分析。各样品，在不同时间点拍摄，因此，可以根据特征的改变的化学成分，由化学式的分布和由IMS（ 见图1）所确定的异构体的贡献所观察到的。通常情况下，M / Z信息可以用来为元素式分配给分析峰。使用APLI的允许与芳香双键分子与更高的灵敏度15分析，电离广泛的分子类型（如 HC，澳1-4，0-4号和0-4 SO）13。这个信息被组织成图，显示点作为该式中，碳原子数在杂原子含量的函数的分布，和DBE公式。这使得能够观察到的差异的化学式中的变化，作为碳原子数的分子（参见图2）中的函数和环的数量和双键。
样品的二维表征允许样品由M / Z，离子式中，并为每个分子碰撞截面来表征。这被示为碳原子数相对于流动性，其中，在彩色尺度，该分子的DBE可以表示的曲线图。这允许分子大小的特定化学家庭相关（相同的杂原子和DBE，参见图3）。 CCS的信息允许对异构体含量的分析，显示出分析之间的变化，以及关于在分子潜在结构提供信息。
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LEWAFs图1. 2D-TIMS-FT-ICR MS。这表示从TIMS-FT-ICR MS在24小时后收集到的级分获得的典型的2D光谱。注意一个趋势是如何在数据中观察到;在此数据信号来自高度芳香化学结构，这是非常冷凝。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. DBE与碳原子数。一个典型的情节显示分配六种不同的化学类（HC，N，O，O 2，O 3，和OS）的分布情况。 x轴是碳在结构的数目，而y轴是双键等价，通过描述52 / eq1.jpg“/>，颜色为每个点是强的日志。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3移动与碳原子数。该图显示在逆流动性的变化，这是与尺寸的直链，和碳原子数图，其中颜色尺度是DBE。在这六个杂类显示单独（HC，N，O，O 2，O 3，和OS）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
该议定书中的关键步骤
LEWAFs的化学复杂性需要，以便使实验室实验来准确反映自然发生准确制剂。数据的有效评估取决于三个标准：尽量减少引进的文物在整个样品处理（ 例如，准备LEWAF，取样，提取，并准备样品进行分析的），验证实验方案（ 即使用暗控制对于光照射试验），并验证该仪器的性能（ 即，验证MS和IMS性能通过使用标准）。
数据处理和解释也可以提出一个挑战。第一个挑战是分子式为观察到的峰的分配。这需要以避免潜在的数据不正确分配高质量精度。 IMS解释也复杂，需要验证。当前系统表征数据作为实验光谱的5％的偏差范围内的一系列的高斯峰，然后数据被过滤以除去不符合峰宽，面积和信噪比的标准峰。
修改和故障排除
制备的LEWAF可用于一系列不同的实验和分析技术，探索了光氧化，微生物降解，或二者的组合的潜力。这些然后可以在不同的条件，如得到的毒性，摄取的速率到生物体，和分子特性进行评估，以尝试识别用于退化的油新的分子签名。
进行高IMS分辨率分析时的另一个挑战可能是较低的灵敏度;这可以通过增加在碰撞单元累计的数目，increasi加以解决纳克样品的总体信噪比。一种替代的解决方案是降低的压力差在TIMS分析器的入口和出口处，典型地增加灵敏度。
这种技术的局限性
TIMS-FT-ICR MS能够在LEWAF分子量区域施加（M / Z = 100-900）。然而，电离源（APLI）可以限制被引入到TIMS-FT-ICR质谱分子离子的类型。因此，电离一步都需要以考虑到分子级目标的利益进行调整。这个特定的实验集中于氧合的芳香族产物。其它离子源，例如电喷雾电离，大气压光致电离，大气压化学电离，或激光解吸电离，可以使用靶向LEWAF互补分子类。因为时间尺度的TIMS-FT-ICR质谱分析的，在线chromatographic分离是不可能的;然而，离线分馏策略是可能的。
对于以其他方法这项技术的意义
使用APLI-TIMS-FT-ICR质谱允许杂原子多环芳烃的表征，评价化学分布以及分子的异构体的贡献。通常情况下，这已被限制为多环芳烃和无其降解产物。然而，典型的结果表明，随着时间的推移，有在分子的分布显著变化，纯的烃类，而观察到含氧分子的更大数量随时间减小。因此，传统的PAH分析可能不充分表征样品。不像其他色谱方法，存在由于波动的要求，如GC分子大小没有限制。此外，在IMS测量提供关于分子结构，这是普遍的特征信息，与LC方法。
这种技术的进一步应用
这种技术不限于LEWAFs的研究，并且它也可以适用于复杂的混合物，特别是那些需要超高质量分辨率和那些需要被解析异构体的干扰高同量异序干扰的无针对性的分析。这可以适用于环境样品，无论污染物的针对性的分析和溶解的有机物，石油的宽范围的分析，甚至生物材料。
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Disclosures
作者宣称没有竞争经济利益。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院（批准号：R00GM106414到FFL）的支持。我们要感谢佛罗里达国际大学的高级质谱设备的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| methylene chloride, Optima | Fisher Scientific | DS-151-4 | Used as received |
| methanol, Optima LC/MS | Fisher Scientific | A456-4 | Used as received |
| toluene, Optima | Fisher Scientific | T291-4 | Used as received |
| Na2SO4, Granular, Anhydrous | Fisher Scientific | S415-212 | Combusted at 450 °C/Stored at 105 °C |
| Crude oil | Various sources | ||
| Instant Ocean® | Aquarium Systems | SS1200 | 33 ppt salinity with 0.45 μm pore filtration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Suntext XLS+ | Atlas Chicalo Ill, USA | 1,500 W xeon arc lamp, light intensity of 765 W/m2 | |
| Atmospheric Pressure Laser Ionization | Bruker Daltonics Inc, MA | Note a 266 nm laser is used | |
| TIMS-FT-ICR MS Instrument | Bruker Daltonics Inc, MA | The set up we had consisted of a 7 T magnet with an infinity cell | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| DataAnalysis 4.2 | Bruker Daltonics Inc, MA | ||
| Python 2.7 | Requires Numpy, Scipy, Pandas, glob, oct2py, and os | ||
| Octave 4.0 |
References
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