这里介绍的方法描述了一个可扩展性和良好生产规范(GMP)-ready分化系统生成的多能干细胞的人类肝细胞样细胞。它作为一个具有成本效益的和标准化的系统以产生用于基础和应用的人肝研究人肝细胞样细胞。
人类多能干细胞(hPSCs)具有对生物医学研究具有重要价值。 hPSCs可以缩放和分化为在人体中发现的所有类型的细胞。 hPSCs人类肝细胞样细胞(HLCS)的分化已被广泛研究,并有效的分化方法已经确立。细胞外基质和生物刺激,包括生长因子,细胞因子和小分子的组合使得有可能生成类似于原代人肝HLCS。然而,大多数的程序仍然使用不确定的成分,从而产生批与批变异。这作为一个显著障碍的技术的应用。为了解决这个问题,我们开发了一个定义系统,肝细胞分化用重组人层粘连蛋白的结合细胞外基质与无血清分化过程。高效的肝细胞规范是实现的,与去monstrated两个HLC功能和表型的改进。重要的是,这个系统易于扩展使用的研究和GMP级HPSC线基于细胞的造型和治疗有希望的进展。
原代人类组织和衍生物细胞类型是经常使用,都为基于细胞的筛选和在诊所。然而,进入这些细胞被严重限制,由于器官捐献和细胞表型后的隔离1的损失不足。 hPSCs代表一个有前途的替代主组织和促进遗传限定的和可再生的人类体细胞的产生。从hPSCs源性肝样细胞(HLCS)已显示出在这一领域的承诺。 HLCS像在各个方面的原代人肝细胞,包括细胞形态,肝细胞的基因表达,代谢功能,和敏感性药物和病毒2,3,4,5,6,7,8。此外,无限增殖和既research-和GMP级hPSCs的自我更新能力有助于其应用9,10。
以上研究的十年已经产生了一些有效的肝细胞分化程序2,3,5,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20。然而,大多数这些系统的使用不确定的成分和/或病毒转导来驱动肝细胞癌规范。为了改善在尺度该技术的可靠性,开发出强健肝细胞分化是重要这是真正定义的系统,无异物,以及GMP兼容。
层粘连蛋白(逻辑节点)是可以影响细胞粘附,增殖,迁移和分化的重要的细胞外基质蛋白。层粘连蛋白是一种α一β和一个γ链组成的异源糖蛋白。最近,重组人层粘连蛋白已经产生并在细胞生物学中使用。 LN-511已显示,以支持hPSCs 21的维护,而LN-521和E-cadherin的混合物允许克隆衍生和人胚胎干细胞22的扩张。 LN-111,在另一方面,支持从hPSCs 23衍生的肝细胞样细胞的维持。然而,我们的报告之前,层粘连蛋白521和111没有被用来从hPSCs 10产生与成熟特性HLCS。
在这里,我们对LN-521培养hPSCs详细过程和上区分他们要么LN-521或LN-521和LN-111(LN-521 / LN-111)的共混物。我们通过优化单细胞接种到产生HLCS的多种格式的14高度重复性和同质单层分化协议。我们相信,我们定义的分化系统是一个简单,经济有效的方法来制造HLCS积极申请,代表在该领域迈出了一步显著。
为了推进人类多能干细胞研究和转化医学,无异物系统,与所需电流的良好生产规范准则的规定。键任何分化过程是细胞外基质(ECM)。不仅ECM支持细胞附着,而且还提供了访问关键信号因子,影响细胞的决心和表现型25,26。
层粘连蛋白在体内的多功能细胞外基质蛋白。在肝脏中,层粘连蛋白分泌的局部切除27之后是用于肝脏再生的关键和所需的肝祖细胞维持28。在肝脏维持和再生层粘连蛋白的重要性是在我们的肝细胞分化的系统测试市售的重组人层粘连蛋白的基础。
他出众patocyte分化相比,基质胶时LN-521和LN-521 / LN-111基板实现。衍生HLCS显然极化和在盘组织,并与他们的凝胶状蛋白质混合物的对应时,他们的细胞功能被显著改善。标的这些改进是污染冒号的下调,fibroblast-和茎在层粘连蛋白细胞相关的基因,以及在细胞增殖和迁移相关基因表达10下降。
总之,这里描述的方案产生肝细胞样细胞是在自然界接近成人肝细胞。该工艺重现性好,易于自动化,并能经济高效地缩放应用程序可以。重要的是,批与批变异已经显著相比下降到使用基质胶,导致此领域内的研究人员的改进的分化系统的技术。 </p>
The authors have nothing to disclose.
这项工作是与来自英国的再生医学平台奖(MRC MR / L022974 / 1和MR / K026666 / 1)与中国国家留学基金支持。
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 |
Human Recombinant Laminin 111 | BioLamina | LN111-02 |
Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF |
Human Activin A | Peprotech | 120-14E |
Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 |
Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 |
Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 05850 |
RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 |
HepatoZYME | Life Technologies | 17705 |
B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 |
Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 |
GlutaMax | Life Technologies | 35050 |
Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 |
2-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 |
Accutase | Millipore | SCR005 |
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 |