Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

الخلايا العصبية التصوير داخل أقسام الدماغ سميكة باستخدام أسلوب جولجي كوكس

Published: April 18, 2017 doi: 10.3791/55358
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph

Summary

نقدم بروتوكول باستخدام طريقة تلوين جولجي كوكس في أقسام الدماغ سميكة، من أجل رؤية الخلايا العصبية مع أشجار شجيري طويلة الواردة في عينات الأنسجة واحدة. يتم عرض نوعين مختلفين من هذا البروتوكول أيضا التي تنطوي على الكريزيل البنفسجي counterstaining، وتجميد العقول غير المجهزة لتخزين على المدى الطويل.

Abstract

وقد استخدمت طريقة جولجي كوكس من تلطيخ الخلايا العصبية لأكثر من مائتي عام لتعزيز فهمنا للمورفولوجيا الخلايا العصبية داخل الدماغ العينات النسيجية. في حين أنه من الأفضل من الناحية العملية لإعداد أقسام الدماغ في أكبر سمك ممكن، من أجل زيادة احتمال تحديد الخلايا العصبية الملون التي ترد بشكل كامل داخل الأقسام واحدة، وهذا النهج هو محدود من منظور تقني من العمل لمسافات عالية ، تكبير أهداف المجهر. ونحن هنا التقرير بروتوكول لصبغ الخلايا العصبية باستخدام طريقة جولجي كوكس في أقسام مخ الفأر أن يتم قطع في 500 سمك ميكرون، وتصور الخلايا العصبية في جميع أنحاء عمق هذه المقاطع باستخدام المجهر تستقيم مزودة عالية الدقة 30X 1.05 NA سيليكون هدف النفط الغمر يحتوي على مسافة العمل 800 ميكرون. نحن أيضا الإبلاغ عن الخيارين مفيدة من هذا البروتوكول التي يمكن استخدامها لمباين سطحشنت أقسام الدماغ مع نيسل وصمة عار الكريزيل البنفسجي، أو لتجميد العقول كلها للتخزين طويل الأجل قبل باجتزاء والتجهيز النهائي. بروتوكول الرئيسي ومشتقاته اثنين تنتج أقسام الدماغ سميكة الملون، في جميع أنحاء الذي الكاملة أشجار الخلايا العصبية شجيري والعمود الفقري تغصناته يمكن تصور موثوق وكميا.

Introduction

التصور من الخلايا العصبية الفردية داخل عينات الأنسجة يسمح للفي الموقع تحليل الخصائص المورفولوجية الخلايا العصبية، التي تقدمت بشكل كبير من فهمنا للدماغ وكيف يمكن أن يتأثر بها المرض الذاتية أو العوامل البيئية الخارجية. طريقة تلوين جولجي كوكس هو، وسيلة فعالة من حيث التكلفة بسيطة نسبيا من تلطيخ عينة عشوائية من الخلايا العصبية في الدماغ. أول من وضعه جولجي 1 وتعديلها من قبل كوكس 2 في 1800s، ومزيد من الصقل الباحثون هذه التقنية على مر السنين لإنتاج واضحة، والخلايا العصبية الملون بشكل جيد والتي يمكن استخدامها لتصور وتحديد كلا مورفولوجيا الشجرة شجيري وكثافة العمود الفقري 3، 4، 5، 6، 7، 8، 9.

وهناك اعتبار تقني رئيسي لتصور الخلايا العصبية الملون داخل أقسام الدماغ هو الحد الأقصى للسمك شريحة، والذي يحد من مسافة العمل من الأهداف المتاحة عالية التكبير / عالية الدقة المجهر. الأهداف النفط الغمر المشتركة في 60 - 100X مجموعة توفر قرار ممتاز، ولكن تقتصر مسافات عملهم التي عادة ما لا يزيد عن 200 ميكرون. أقسام الدماغ قطع في ميكرون مجموعة 200 قد تكون كافية لتصور أنواع الخلايا العصبية معينة التي يمكن الواردة في هذا شريحة سمك، على سبيل المثال العصبونات الهرمية في طبقات عميقة من القشرة المخية 10، 11، 12، الخلايا العصبية الهرمية في المنطقة CA1 من الحصين 13 و 14، والخلايا الحبيبية في التلفيف المسنن من الحصين (15). الخلايا العصبية مع أطول نسبياأشجار الجذعية، مثل الخلايا العصبية الهرمية داخل الطبقات العميقة من القشرة الدماغية التي فأرة الحاسوب يمكن أن تمتد أكثر من 800 ميكرون من خلايا الجسم 16، وتوفير تحديا أكبر لأنه لن تحتاج إلى مقطوع في زاوية مثالية العقول لاحتواء شجرة تغصناته كامل في حدود 200 ميكرون شرائح. قد لا يكون هذا ممكنا إذا كان التغصنات أو أي من فروعها تمتد في اتجاه منقاري أو الذيلية. في حين أنه من الممكن معالجة هذا القيد عن طريق تتبع الخلايا العصبية عبر عدة أقسام الدماغ المجاورة، ويدخل هذا النهج تحديا تقنيا كبيرا في التوفيق بين الأقسام بدقة للبحث عن المفقودين (17). ومن شأن اتباع نهج أكثر واقعية يكون لتصور الخلايا العصبية كلها الواردة في أقسام الدماغ التي قطعت في سمك أكبر.

نفيدكم هنا تقنية وصمة عار الخلايا العصبية داخل 400-500 ميكرون أقسام الدماغ سميكة من الفئران باستخدام طريقة جولجي كوكس، وتصور لهم موrphology باستخدام عالية الدقة السيليكون هدف النفط الغمر يحتوي على مسافة العمل 800 ميكرون. يتم تعديل التشريب وتجهيز بروتوكول جولجي كوكس التي وصفنا من أحد البروتوكولات الحديثة الأكثر ذكرا في الأدب 6. نهجنا مع أقسام الدماغ سميكة يوفر ميزة زيادة احتمال تحديد الخلايا العصبية من أي نوع أن ترد بشكل كامل داخل القسم. وبالإضافة إلى البروتوكول الرئيسي، ونحن أيضا موجودة شكلان التي توفر مزايا فريدة من نوعها: (1) جولجي كوكس تلطيخ مع مباين الكريزيل البنفسجي على سطح أقسام المركبة، من أجل تحديد حدود مناطق الدماغ وتحديد طبقات قشرة الدماغ، و (2) جولجي كوكس تلطيخ مع خطوة تجميد المتوسطة للتخزين على المدى الطويل من العقول كلها مشربة قبل باجتزاء والتجهيز النهائي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم استخدام الكبار للإناث الفئران CD1 سلالة في هذه الدراسة. تلطيخ مماثل يمكن تحقيق ذلك باستخدام كلا الجنسين في مختلف الأعمار. ويهتم حيوانات التجارب لوفقا لمبادئ وتوجيهات من المجلس الكندي لرعاية الحيوان، وتمت الموافقة على بروتوكول تجريبي من قبل الجامعة لجنة رعاية الحيوان جويلف.

1. جولجي كوكس تلطيخ

  1. جولجي كوكس إشباع العقول
    1. جعل الحل جولجي كوكس 1٪ (ث / ت) ثاني كرومات البوتاسيوم، و 0.8٪ (ث / ت) كرومات البوتاسيوم و 1٪ (ث / ت) كلوريد الزئبق عن طريق إذابة ثاني كرومات البوتاسيوم وكرومات البوتاسيوم في الماء عالية الجودة بشكل منفصل . مزيج من الحلول، إضافة كلوريد الزئبق وتصفية الحل النهائي باستخدام الصف 1 ورق الترشيح. تخزين الحل في الظلام لمدة شهر واحد.
    2. تخدير الماوس باستخدام 5٪ الأيزوفلورين.
    3. الموت ببطء الماوس عن طريق قطع الرأس وإزالة بسرعة الدماغ.
    4. وضع الدماغ في قارورة التلألؤ 20 مل غلاس التي تحتوي على 17 مل من محلول جولجي كوكس واحتضان في الظلام في RT لمدة 25 د.
    5. Cryoprotect الدماغ عن طريق وضعها في أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 40 مل من السكروز cryoprotectant (30٪ (ث / ت) السكروز في 0.1 M الفوسفات العازلة، ودرجة الحموضة 7.4) في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
      ملاحظة: قد تكون عاملة وفيما يلي ثلاث خطوات اختيارية كبديل للبروتوكول الرئيسي، من أجل تجميد الدماغ في هذه المرحلة للتخزين على المدى الطويل.
    6. تجميد الدماغ كله تخبط في 200 مل نظير البنتان التي تم precooled على الثلج الجاف.
    7. وضع الدماغ المجمدة في أنبوب 50 مل المخروطية وتخزينها في الظلام في -80 ° C.
    8. عندما تصبح جاهزة للشروع، ذوبان الجليد الدماغ عن طريق وضعها في أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 40 مل من cryoprotectant السكروز في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  2. الدماغ باجتزاء
    1. إزالة الدماغ من السكروز والكتلةك ذلك لباجتزاء بقطع المخيخ باستخدام شفرة حلاقة وترك حافة مسطحة في نهاية الذيلية المتبقية من الدماغ.
    2. أجار الحرارة (3٪ (ث / ت) في الماء) حتى ذاب والسماح لتبرد حتى يصبح أعلى قليلا من نقطة انصهاره.
    3. وضع الدماغ في صغير المتاح وزن الطبق مع نهايته الذيلية وجها لأسفل وإضافة كمية كافية من أجار ذاب لتغطي الدماغ.
    4. مرة واحدة وقد عززت أجار، وتقليم أجار الزائد وترك ما يقرب من 2-4 ملم المحيطة بالدماغ والغراء الدماغ إلى مرحلة من مراحل vibratome مع نهايته الذيلية وجها لأسفل باستخدام كمية صغيرة من الغراء إيثيل غراء سريع.
    5. ملء المنطقة مرحلة من مراحل vibratome مع كمية كافية من cryoprotectant السكروز لتغطي الدماغ، وقسم الدماغ في سمك شريحة من 400-500 ميكرون (اعتمادا على المنطقة من المخ لفحصها) باستخدام تردد الاهتزاز من 86 هرتز و سرعة شفرة النهوض 0.125 ملم / ثانية.
    6. باستخدام فرشاة الدهان الصغيرة، أقسام الدماغ مكان في بئر من لوحة 6 جيدا زراعة الأنسجة التي تحتوي على إدراج-شبكة السفلية المتاحة تجاريا وقبل مليئة 10 مل من 6٪ (ث / ت) السكروز في 0.1 M الفوسفات العازلة، ودرجة الحموضة 7.4.
    7. احتضان المقاطع في الظلام في 4 درجات CO / N.
  3. تطوير أقسام الدماغ
    1. عن طريق إدراج-شبكة القاع، ونقل أقسام الدماغ في عالم جديد يحتوي بشكل جيد 5 مل من 2٪ (ث / ت) لامتصاص العرق (PBD) في 0.1 M الفوسفات العازلة، ودرجة الحموضة 7.4. احتضان على الكرسي الهزاز يتحرك بسرعة بطيئة في الظلام في RT لمدة 15 دقيقة.
    2. غسل أقسام مرتين من قبل نقلهم إلى آبار جديدة تحتوي على 5 مل من الماء. يغسل على الكرسي الهزاز تتحرك بسرعة معتدلة في الظلام في RT لمدة 5 دقائق.
    3. نقل المقاطع إلى بئر جديدة تحتوي على 5 مل من 2.7٪ (ت / ت) هيدروكسيد الأمونيوم. احتضان على الكرسي الهزاز يتحرك بسرعة بطيئة في الظلام في RT لمدة 15 دقيقة.
    4. غسل أقسام مرتين من قبل نقلهم إلى آبار جديدة تحتوي على 5 مل من الماء. غسل سغ الروك تتحرك بسرعة معتدلة في الظلام في RT لمدة 5 دقائق.
    5. نقل المقاطع إلى جديد يحتوي بشكل جيد 5 مل من تثبيتي A (انظر الجدول المواد) التي تم مخففة في 10X المياه من التركيز الأصلي شراؤها. احتضان على الكرسي الهزاز يتحرك بسرعة بطيئة في الظلام في RT لمدة 25 دقيقة.
    6. غسل أقسام مرتين من قبل نقلهم إلى آبار جديدة تحتوي على 5 مل من الماء. يغسل على الكرسي الهزاز تتحرك بسرعة معتدلة في الظلام في RT لمدة 5 دقائق.
  4. تصاعد أقسام الدماغ
    1. باستخدام فرشاة الدهان الصغيرة، جبل أقسام على الشرائح المجهر. إزالة المياه الزائدة وأجار باستخدام الملقط والأنسجة الصغيرة. ضمان أن تتم إزالة جميع أجار قبل الشروع في الجفاف.
    2. السماح أقسام للهواء الجاف في RT لمدة 45 دقيقة (400 ميكرون أقسام) أو 90 دقيقة (500 ميكرون أقسام).
      ملاحظة: مستوى توقيت والسليم للجفاف أمر بالغ الأهمية، وربما تحتاج إلى أن تحدد في كلمختبر اعتمادا على درجة الحرارة المحيطة ومستوى الرطوبة. قصيرة جدا وقت التجفيف يؤدي إلى أقسام تسقط من الشرائح خلال الخطوات اللاحقة الجفاف، وطويل جدا وقت التجفيف يؤدي إلى أقسام تكسير. سوف أقسام تزال تبدو لامعة على المستوى المناسب من جفاف.
    3. أقسام صمة عار مع البنفسجي الكريزيل عن طريق وضع شرائح في الجرار تلطيخ Coplin كما هو محدد.
      ملاحظة: يمكن استعمال هذه خطوة اختيارية لالمقاطع التي لم يتم تجميدها، من أجل وصمة عار نوى الخلايا العصبية مع البنفسجي الكريزيل. لقد وجدنا أن المقاصة والمضادة للجفاف أقسام قبل الحضانة في البنفسجي الكريزيل يؤدي حتى إلى تلطيخ وخلفية منخفضة عبر المقاطع.
      1. ضع في تطهير وكيل لمدة 5 دقائق. التكرار مرة واحدة.
      2. ضع في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق. التكرار مرة واحدة.
      3. ضع في 95٪ من الإيثانول في الماء، ثم 75٪ من الإيثانول في الماء، ثم الايثانول 50٪ في الماء لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
      4. وضع في الماء لمدة 5 دقائق.
      5. ضع في 0.5٪ (ث / ت) لجنة المساواة العرقيةالبنفسجي SYL في الماء لمدة 7 دقائق.
      6. وضع في الماء لمدة 2 دقيقة. التكرار مرة واحدة.
    4. يذوى المقاطع عن طريق وضع شرائح في الجرار تلطيخ Coplin كما هو محدد.
      1. ضع في 50٪ من الإيثانول في الماء، ثم 75٪ من الإيثانول في الماء، ثم الايثانول 95٪ في الماء لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
      2. ضع في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق. التكرار مرة واحدة.
      3. ضع في تطهير وكيل لمدة 5 دقائق. التكرار مرة واحدة.
        ملاحظة: هذه الجفاف والمقاصة مرات كافية لمعالجة أدمغة فئران كما هو موضح في هذه المخطوطة. ومع ذلك، لاحظنا بالنسبة للأنواع الأخرى بما في ذلك الفئران وشحارير البقر، أن الخطوة المقاصة النهائية قد تحتاج إلى أن تمتد ما يصل الى 15 مجموعه دقيقة.
    5. أقسام ساترة باستخدام المتوسطة المتزايدة اللامائية.
    6. تسمح الشرائح لتجف أفقيا في الظلام في RT لا يقل عن 5 د.

2. التصوير الملون الخلايا العصبية داخل الدماغ أقسام سميكة

  1. التقاط صورة الأكوام
  2. تشغيل لمبة ضوء المجهر، والكاميرا، وجهاز تحكم المرحلة.
  3. فتح البرنامج المجهر (على سبيل المثال، Neurolucida).
  4. وضع شريحة على المسرح المجهر.
  5. التقاط صورة على نطاق عرض 2D من قسم المخ باستخدام هدف تضخم منخفض مثل 1.25X 0.4 NA PlanAPO أو 4X 0.16 NA
    1. تركيز الصورة وضبط إعدادات الكاميرا بما في ذلك وقت التعرض وتوازن اللون الأبيض.
    2. إنشاء نقطة مرجعية من قبل اليسار النقر في أي مكان على القسم
    3. التقاط الصور عن طريق اختيار "الحصول على صورة واحدة" ضمن إطار الحصول على الصور.
  6. التقاط منتصف قرار مداخن صورة للمنطقة التي تحتوي على الخلايا العصبية (ق) من الفائدة، وذلك باستخدام 10X 0.3 NA الهدف UPlan FL N.
    1. التركيز على الصورة وضبط إعدادات الكاميرا بما في ذلك التعرض وتوازن اللون الأبيض.
    2. تعيين الحدود العليا والدنيا للصورة كومة من خلال التركيز على الجزء العلوي من القسمالثانية اختيار "مجموعة" إلى جانب "قمة كومة" ضمن إطار الحصول على الصور، ومن ثم التركيز على الجزء السفلي من القسم واختيار "مجموعة" بجانب "أسفل كومة" ضمن إطار الحصول على الصور.
    3. تعيين مسافة خطوة إلى 5 ميكرون عن طريق إدخال "5 ميكرون" بجوار "المسافة بين الصور" ضمن إطار الحصول على الصور.
    4. القبض على كومة صورة عن طريق اختيار "كومة صورة اكتساب" ضمن إطار الحصول على الصور.
    5. كرر الخطوات المذكورة أعلاه للقبض على المنطقة بأكملها من الفائدة، والتأكد من أن جميع مداخن صورة تتداخل لا يقل عن 10٪ في X و Y محاور.
  7. التقاط عالية الدقة مداخن صورة للمنطقة التي تحتوي على الخلايا العصبية من الفائدة، وذلك باستخدام 30X 1.05 NA سيليكون هدف النفط الغمر.
    1. تطبيق 3-4 قطرات من زيت السيليكون الغمر إلى الشريحة ووضع الهدف على الشريحة، وضمان لاجراء اتصالات بين الهدف ومنظمة اوكسفام الدوليةل.
    2. التركيز على الصورة وضبط إعدادات الكاميرا بما في ذلك التعرض وتوازن اللون الأبيض.
    3. تعيين الحدود العليا والدنيا للصورة كومة من خلال التركيز على الجزء العلوي من الباب، واختيار "مجموعة" إلى جانب "قمة كومة" ضمن إطار الحصول على الصور، ومن ثم التركيز على الجزء السفلي من الباب، واختيار "ضبط" بجانب "أسفل كومة" ضمن إطار الحصول على الصور.
    4. تعيين مسافة خطوة إلى 1 ميكرومتر عن طريق إدخال "1 ميكرون" بجوار "المسافة بين الصور" ضمن إطار الحصول على الصور.
    5. القبض على كومة صورة عن طريق اختيار "كومة صورة اكتساب" ضمن إطار الحصول على الصور.
    6. كرر الخطوات المذكورة أعلاه للقبض على المنطقة بأكملها من الفائدة، والتأكد من أن جميع مداخن صورة تتداخل لا يقل عن 10٪ في X و Y محاور.
  8. حفظ ملف البيانات وحفظ جميع ملفات الصور في شكل TIFF للتجهيز الخارجي.
</ لى>
  • خلق صور Z-الإسقاط وصورة التنسيقات
    1. إنشاء صور Z-الإسقاط في يماغيج
      1. برنامج ImageJ المفتوح الذي المساعد بيو تنسيقات مثبتة.
      2. حدد "الإضافات" -> "بيو تنسيقات" -> "بيو تنسيقات المستورد".
      3. حدد الملف كومة صورة ليتم فتحه.
      4. بمجرد فتح الملف، تغيير تنسيق لRGB عن طريق اختيار "صورة" -> "نوع" -> "RGB اللون".
      5. إنشاء Z-الإسقاط عن طريق اختيار "صورة" -> "أكوام" -> "Z المشروع ...".
      6. حفظ صورة ثنائية الأبعاد Z-الإسقاط كملف TIFF.
    2. إنشاء المونتاج صورة ثنائية الأبعاد من المنطقة بأكملها من الفائدة.
      1. فتح البرنامج (على سبيل المثال، أدوبي فوتوشوب).
      2. حدد "ملف" -> "أتمتة" -> "الدمج الصوري".
      3. حدد "استعراض" ثم قم بإضافة كل ايماجوفاق الملفات المراد دمجها.
      4. تأكد من أن "مزيج الصور معا" يتم تحديد ومن ثم حدد "OK".
      5. حفظ الصورة المونتاج الناتجة من المنطقة بأكملها من الفائدة كملف TIFF.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    يجوز استخدام هذا البروتوكول تلطيخ جولجي كوكس وصفهما مشتقاته اختياري لتصور الخلايا العصبية الفردية داخل 400-500 ميكرون أقسام الدماغ سميكة. وتظهر صورة مركبة تمثيلية اثنين من الأبعاد Z-توقعات استولت باستخدام الهدف 10X و 5 ميكرومتر الخطوات في محور Z في الشكل 1: A1 - C1 لمنطقة واسعة من أقسام الدماغ الاكليلية التي تتضمن الحزامية الأمامية منطقة القشرة 1 و القشرة الحركية الثانوية 18. قطعت أقسام في 500 ميكرون. لاحظ أن البديل بروتوكول يتضمن الكريزيل البنفسجي تلطيخ يسمح لتحديد طبقات الخلايا القشرية، على سبيل المثال كما رأينا لطبقة القشرية 1 على طول سطح حنوني من المقاطع في الشكل 1B1. لاحظ أيضا مظهر مماثل من أقسام الملون عند استخدام بروتوكول الرئيسي باستخدام كل الطازجة الأنسجة (الشكل 1A1) وبروتوكول البديل الذييتم تجميد العقول جزء الطريق من خلال لتخزين على المدى الطويل (الشكل 1C1).

    استخدام عالية الدقة 30X 1.05 NA سيليكون هدف النفط الغمر يسمح للقبض على مداخن صورة التي هي أكبر في X و Y محاور من تلك التي تم التقاطها باستخدام هدفا-التكبير العالي، مما يتطلب مجموع أكوام أقل لصورة معين مجال الاهتمام. وهدف معين العاملين لديه والعمل لمسافات 800 ميكرون، والتي هي أكثر من كافية لصورة أقسام الدماغ سميكة. صورة مركبة من اثنين من الأبعاد Z-توقعات استولت باستخدام هذا الهدف، و1 ميكرومتر الخطوات في محور Z في الشكل 1 (A2-C2) ضمن الحزامية الأمامية منطقة القشرة 1، وثنائية الأبعاد Z-توقعات اقتفاء أثر لل وتظهر الخلايا العصبية هو مبين في الشكل (1): A3 - C3. لاحظ الصور عالية الدقة التي تسمح لتصور من الخلايا العصبية والتشعبات من خلالعمق كل كومة صورة. البديل البروتوكول باستخدام البنفسجي الكريزيل يضيف الأرجواني تلطيخ نيسل عبر شريحة، ولكن مع المعلمات المستخدمة لوحظ هذا تلطيخ الخلوية فقط بالقرب من أعلى شريحة. البديل بروتوكول يتضمن خطوة تجميد اختياري تنتج تلطيخ الخلايا العصبية التي تشبه إلى البروتوكول الرئيسي، ومع ذلك فإنه يقدم أيضا تلوين الخلفية منتشر أن يخلق ظهور الضباب التي كتبها الانعراج الضوء تحت سطح شريحة. هذا الضباب هو أكثر وضوحا عندما التصوير أعمق في شريحة وهو واضح في الصورة Z-الإسقاط في الشكل 1C2. ويمكن أيضا الصور التي تم التقاطها باستخدام الهدف 30X استخدامها لتصور وتحديد الهياكل العصبية الدقيقة مثل العمود الفقري شجيري. وتظهر الصور واحدة الطائرة في الشكل 2 لالتشعبات الملون باستخدام بروتوكول الرئيسي ومشتقاته اثنين، مع أخذ صورة واحدة بالقرب من أعلى القسم وصورة واحدة أخذت بالقرب من أسفل الباب. لاحظ purplالبريد الكريزيل البنفسجي تلطيخ للمادة نيسل داخل نواة الخلايا العصبية الفردية بالقرب من أعلى القسم في الشكل 2B1، الذي ينظر إليه على أنه منتشر خلفية الأرجواني / الضوء المتناثرة بالقرب من أسفل القسم في الشكل 2B2. لاحظ أيضا أنه على الرغم من التشعبات والعمود الفقري لها وكذلك ملطخة باستخدام بروتوكول مع خطوة التجميد، الضباب الخلفية التي سبق ذكرها، وهذا هو الظاهر بالقرب من الجزء السفلي من شريحة في الشكل 2C2 يجعل الأمر أكثر صعوبة لتصور العمود الفقري عن طريق الحد من التباين بين بينها وبين الخلفية المجاورة. ويمكن أيضا أن أهداف أعلى التكبير أن تستخدم لتوصيف شجيري التشكل العمود الفقري، كما تظهر في الشكل 2: A3 - C3 حيث العمود الفقري من أنواع مختلفة مرئية بوضوح في أقسام الملون باستخدام كل من البروتوكولات الثلاثة. هنا، تم استخدام NA هدف النفط الغمر 60X 1.42. علينا أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول تلطيخ ومشتقاته وصمة عار الخلايا العصبية داخل hippocampus أقسام قطع في 400 ميكرون. كما هو مبين في الشكل (3)، التشعبات العصبية والعمود الفقري يمكن تصور حد سواء نحو مناطق أكثر سطي من القسم (على سبيل المثال، الحصين المسنن منطقة التلفيف في الشكل (3): A2 - C2) والمناطق الأكثر الاطراف من القسم (على سبيل المثال والحصين المنطقة CA3 في الشكل (3): A3 - C3). كما تجدر الإشارة إلى أن كل حالة تلطيخ أسفرت عن نتائج مماثلة، ومزايا وعيوب لتلك التي تظهر في أرقام 1 و 2 لقشرة الدماغ.

    سمك النهائي من أقسام الدماغ معالجتها يعتمد على البديل بروتوكول معين العاملين. كما هو مبين في الشكل 4A للأقسام التي تحتوي على قشرة الدماغ وقطع في 500 ميكرون، كان هناك تأثير كبير من بروتوكول البديل على سمك يقاس من معالجتها والتي شنت / الأقسام coverslipped (في اتجاه واحد أنوفا، ف <0.000 1). هنا، نجد أن سماكة المقاطع باستخدام بروتوكول الرئيسي (251.0 ± 12.5 (SEM) ميكرومتر (ن = 6)) والبديل بروتوكول تنطوي البنفسجي الكريزيل (219.3 ± 8.5 ميكرومتر (ن = 6)) كان أصغر من سمك أقسام التي تستخدم بروتوكول البديل تنطوي على خطوة تجميد (340.6 ± 17.1 ميكرون (ن = 6)) (اختبار بونفيروني بعد خاص، كل مقارنة ص ≤ 0.0006). وقد لوحظت آثار مشابهة جدا لبروتوكول البديل للأقسام التي تحتوي على الحصين وقطع في 400 ميكرون (الشكل 4B، في اتجاه واحد أنوفا، ف <0.0001). هنا، نجد أن سماكة المقاطع باستخدام بروتوكول الرئيسي (217.6 ± 19.2 ميكرون (ن = 6)) وبروتوكول البديل تنطوي البنفسجي الكريزيل (198.0 ± 14.8 ميكرون (ن = 6)) كان أصغر من سمك أقسام جعل استخدام البديل بروتوكول تنطوي على خطوة تجميد (313.5 ± 8.4 ميكرومتر (ن = 6)) (اختبار بونفيروني بعد خاص، كل مقارنة ص ≤ 0.001).

    r.within الصفحات = "1"> شكل 1
    الشكل 1. النموذجية Photomicrographs من الزجاج الملون الخلايا العصبية في منطقة الحزامية الأمامية 1. A1 - C1، يتم عرض مدموجة Z-توقعات مداخن صورة المكتسبة باستخدام الهدف 10X لنصف الكرة الأرضية واحدة من قشرة الدماغ التي تتضمن الحزامية الأمامية منطقة القشرة 1 والثانوية القشرة الحركية في حوالي Bregma +1.18 ملم 18. وقطعت هذه المقاطع في 500 ميكرون. وترد Photomicrographs باستخدام الرئيسي كل جديد بروتوكول (A1)، البديل لبروتوكول جديد مع الكريزيل البنفسجي تلطيخ (B1)، والبديل لبروتوكول الذي يتم تجميد العقول التالية جولجي كوكس التشريب (C1). الحانات هي مقياس 500 ميكرون. دمج دقة عالية Z-إسقاط مداخن صورة المكتسبة باستخدام الهدف السيليكون النفط الغمر 30X ترد في A2 - C2 لكل المنطقة المشار إليها من قبل مربع أحمرuare في photomicrographs في A1 - C1. الحانات هي مقياس 100 ميكرون. وترد 2D Z-توقعات اقتفاء أثر الخلايا العصبية في A3 - C3 للالخلايا العصبية الذي يشير إليه السهم الأحمر في photomicrographs في A2 - C2. تم تعيين قطر كل التشعبات إلى 2 ميكرون لسهولة التوضيح. الحانات هي مقياس 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل 2
    الشكل 2. النموذجية Photomicrographs من شجيري العمود الفقري لالملون الخلايا العصبية. وترد Photomicrographs التقاطها باستخدام هدف النفط الغمر 30X السيليكون في طائرة واحدة محورية للالتشعبات العصبية الموجودة داخل طبقة 1 من منطقة القشرة الحزامية الأمامية 1. قطعت هذه المقاطع في 500 ميكرون. كانت ملطخة الخلايا العصبية باستخدام و بروتوكول resh (A1، A2)، والبديل بروتوكول مع تلطيخ الكريزيل البنفسجي (B1، B2) والبديل لبروتوكول الذي يتم تجميد العقول التالية جولجي كوكس التشريب (C1، C2). اتخذت Photomicrographs بالقرب من أعلى شريحة (A1 - C1) وبالقرب من الجزء السفلي من شريحة إلى جانب شريحة المجهر (A2 - C2). أشرطة النطاق لA1-2، B1-2 وC1-2 هي 50 ميكرون. وتظهر Photomicrographs في A3، B3 و C3 لطائرة الوصل واحد باستخدام-أعلى التكبير الهدف 60X النفط الغمر، من أجل تحديد أنواع العمود الفقري المختلفة. أشرطة النطاق لA3، B3 و C3 هي 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    55358 / 55358fig3.jpg "/>
    الشكل 3. النموذجية Photomicrographs من الزجاج الملون الخلايا العصبية في الحصين. وترد Photomicrographs استولت باستخدام الهدف 4X في طائرة واحدة محورية للالخلايا العصبية الملون باستخدام بروتوكول جديد (A1)، والبديل بروتوكول مع تلطيخ الكريزيل البنفسجي (B1) وبروتوكول البديل الذي يتم تجميد العقول التالية جولجي كوكس التشريب (C1 ). قطعت أقسام في 400 ميكرون، وهي واردة في حوالي Bregma -2.18 مم 18. الحانات هي مقياس 500 ميكرون لA1 - C1. تم القبض على أعلى photomicrographs التكبير باستخدام الهدف النفط الغمر 30X السيليكون، وهي واردة في طائرة واحدة محورية للالخلايا العصبية التشعبات التي تقع داخل منطقة التلفيف المسنن من الحصين (A2 - C2) والمنطقة CA3 للقرن آمون (A3 - C3). الحانات هي مقياس 50 ميكرون لA2 - C2وA3 - C3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل (4)
    الرقم 4. سمك أقسام الخيالة. يظهر سمك يقاس من المقاطع التي تقام في لأقسام تحتوي على قشرة الدماغ في حوالي Bregma +1.18 ملم 18 وقطع في 500 ميكرون سمك، وB للأقسام التي تحتوي على قرن آمون في حوالي Bregma -2.18 مم 18 وقطع في 400 ميكرون سماكة. كانت ملطخة أقسام تقاس باستخدام بروتوكول جديد، والبديل بروتوكول مع تلطيخ الكريزيل البنفسجي، أو البديل البروتوكول الذي يتم تجميد العقول التالية جولجي كوكس التشريب. لكل من مناطق الدماغ، كان هناك تأثير كبير للبروتوكول معالجة(في اتجاه واحد أنوفا، ف <0.0001)، حيث كانت مقاطع من العقول التي كانت جزء الطريق المجمدة من خلال بروتوكول سمكا بكثير من تلك التي لم المجمدة (اختبار بونفيروني بعد خاص، كل ع <0.001). وأظهرت بيانات نفسه كما ± SEM لمدة ستة أقسام في كل مجموعة، ومجموعات البيانات مع رسائل مختلفة تشير إلى اختلافات كبيرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    نحن هنا وصف بروتوكول تلطيخ جولجي كوكس جنبا إلى جنب مع اثنين من المتغيرات مفيدة لتصور الخلايا العصبية داخل أقسام الدماغ سميكة. كما هو مبين في ممثل النتائج، واستخدام هدفا عالية الدقة لديه طويلة المسافة 800 ميكرون العمل يسمح التصور يمكن الاعتماد عليها من الخلايا العصبية كامل في جميع أنحاء عمق أقسام الدماغ قطع في 500 ميكرون. هذه الدراسة من أقسام الدماغ سميكة نسبيا يزيد من احتمال أن الخلايا العصبية الملون من أي نوع ترد بشكل كامل داخل شريحة، وهو أمر مهم خاصة بالنسبة للخلايا العصبية الهرمية مع أشجار تغصناته قمية طويلة ومعقدة. على سبيل المثال، في أقسام الاكليلية من القوارض الدماغ، وهذا يسمح لإدراج الخلايا العصبية التي تمتد أبعد في اتجاه منقاري أو الذيلية، وأيضا يزيد من مجال للخطأ عندما حجب الدماغ بشكل مباشر في خطوة باجتزاء. على الرغم من أن وصفنا الدماغ باجتزاء في الطائرة الاكليلية فقط، يمكن تكييف هذا البروتوكول لباجتزاء في رر أخرىأنس كما هو مطلوب لاحتواء صفت تماما الخلايا العصبية داخل أقسام واحدة. والطائرة من باجتزاء المستخدمة تعتمد على الخصائص المورفولوجية من السكان العصبية قيد التحقيق. العمود الفقري شجيري يمكن تصور وكميا باستخدام هذا البروتوكول، على الرغم من أن أهداف أعلى التكبير المطلوبة لتقييم نوع العمود الفقري / التشكل مثل هدف النفط الغمر 60X المستخدمة لإنتاج photomicrographs في الشكل 2: A3 - C3. وهذا يمكن أن تستخدم في أقسام سميكة ولكن يقتصر على الجزء العلوي من شريحة ضمن مسافة العمل من الهدف. ويمكن أيضا أن تتكيف هذا البروتوكول لاستخدامها في أنواع مختلفة من حجم الدماغ مماثلة، كما وجدنا أن فترة الحمل 25 يوما القياسية وصمة عار تماما الخلايا العصبية في جميع أنحاء الجرذان والفئران والدماغ شحارير البقر دون أن يؤدي ذلك إلى تلطيخ غير محدد الزائد أو الخلفية التي قد تحدث مع فترات الحمل إلى ما بعد شهر واحد. قد تكون فترات أقصر التشريب كافية للأنواع مع الصورةالعقول maller أو في عينات تشريح أدمغة من الأنواع المذكورة أعلاه، والتي يمكن أن يكون الأمثل من قبل المحقق الفردية.

    المتغيرات الثلاثة المقدمة لهذا البروتوكول تلطيخ، وبروتوكول الرئيسي باستخدام عينات الدماغ الجديدة التي لم يتم counterstained غلة أفضل النتائج. Photomicrographs في الشكل 2 A تثبت أن هذا البروتوكول الرئيسي تنتج التشعبات والعمود الفقري وصفت جيدا التي هي واضحة بالقرب من أعلى وأسفل أبواب سميكة شنت بسهولة. إضافة مباين الكريزيل البنفسجي لديه ميزة تسهيل تعريف مناطق الدماغ وطبقات القشرة الدماغية، لكنه أضاف أيضا خلفية الأرجواني منتشر عندما تصور عمق أبواب سميكة. ومع ذلك، لأن هذا البروتوكول البديل بقع فقط كان سطح أبواب سميكة شنت مع البنفسجي الكريزيل، التشعبات والعمود الفقري لها واضحة للعيان بالقرب من أسفل أقسام (الشكل 2 B). ويبدو أيضا أن الم Ùم نمط أكثر وضوحا من نيسل تلطيخ بالقرب من سطح أبواب سميكة من ذلك هو مبين في تقارير سابقا، حتى عند استخدام المقاطع أرق بكثير 19 و 20 و 21. البديل بروتوكول يتضمن خطوة تجميد ينتج نتائج مقبولة لتحليل مورفولوجيا الشجرة شجيري. ومع ذلك، فإن تلوين الخلفية أغمق من ذلك بكثير في أنسجة جديدة، والتي هي أكثر ما يلفت الانتباه عند التصوير أعمق في شريحة مما يجعل الأمر أكثر صعوبة لتصور وقياس العمود الفقري تغصناته (الشكل 2 C). حاولنا البنفسج مباين الكريزيل في مقاطع من العقول التي كانت قد جمدت، وهذا أنتج ضباب خلفية الأرجواني حتى-المظلم الذي جعل من الصعوبة بمكان تصور وقياس العمود الفقري بالقرب من أسفل القسم (لا تظهر البيانات). آخر البديل بروتوكول فاشلة التي تم تقييم شملت تجميد أدمغة فئران قبل جولجي كوكس العزلأوجه. وأدى ذلك إلى تلطيخ من الأجسام الخلوية التي قد يكون تم الدبقية، ولكن لم يلوث أي نوع من الخلايا العصبية (لا تظهر البيانات).

    هناك نوعان من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول التي يجب اتباعها للحصول على نتائج ناجحة. (1) ومن الأهمية بمكان للتحقق من وقت التجفيف من الفروع داخل كل مختبر، لأن هذا يعتمد إلى حد كبير على درجة الحرارة والرطوبة. إذا كان الوقت تجفيف قصير جدا، وسوف أقسام تسقط الشرائح أثناء عملية الجفاف. إذا كان الوقت تجفيف طويل جدا، وأقسام قضاء. وسيكون من المفيد للتحقق من وقت التجفيف في مجموعة من العقول "اختبار" فقط قبل preforming دراسة بحثية، وهذا يمكن أن تختلف من موسم حتى مع نفس المختبر. (2) يجب أن تكون إزالة جميع أجار الزائدة من قسم وشريحة المجهر قبل الخطوات الجفاف. إذا لم يتم ذلك، فإن أجار تشوه وقد سحب قسم من الشريحة.

    عامل آخر مهم لنسيجيةتحليل آل العينات البيولوجية هو انكماش الأنسجة. لقد وجدنا أنه بعد تجهيز وتركيب والتجفيف وcoverslipping أقسام الدماغ باستخدام بروتوكول الرئيسي جولجي كوكس أن تم تخفيض سمك الباب النهائي قبل ما يقرب من نصف قيمة قطع الأصلية (الشكل 4). نلاحظ أيضا أن أقسام معالجتها باستخدام البديل البروتوكول الذي شمل خطوة التجميد كانت أكثر سمكا بكثير من الأقسام الجديدة التي تم معالجتها عبر بروتوكول الرئيسي (الشكل 4). وكان هذا مثيرا للاهتمام وغير متوقعة لأن كلا من بروتوكولات تضمنت نفس cryoprotection وتجهيز الخطوات، وتختلف فقط من قبل التجميد الفعلي للدماغ. لذا فمن الأهمية بمكان أن مراعاة الفروق المحتملة في البروتوكولات عند مقارنة البيانات الخلايا العصبية التشكل تم إنشاؤها باستخدام جولجي كوكس تلطيخ من الدراسات المختلفة أو من مختبرات مختلفة. على الرغم من أننا لم نتمكن من العثور على معلومات عن سمك الباب نهائيا في الأدب، وسيكون من المفيدللمحققين أن يقدم هذه البيانات و / أو الصحيح للانكماش الأنسجة عند الإبلاغ عن التدابير مورفولوجيا الخلايا العصبية. تجدر الإشارة أيضا إلى أنه على الرغم من سمك النهائي لل> 200 ميكرون لقطاعات قطع في 500 ميكرون أكبر من المسافة عمل معظم أهداف عالية التكبير، وهذا لا يزال جيدا ضمن مسافة العمل من الهدف 30X المستخدمة في المختبر لدينا. منذ التشعبات والعمود الفقري واضحة للعيان بالقرب من أسفل هذه الشرائح باستخدام بروتوكول الرئيسي جولجي كوكس، قد يكون من الممكن تصور الخلايا العصبية الموجودة داخل أقسام قطع في سمك أكبر من ذلك بكثير، وذلك حتى حدود 1 مم.

    على الرغم من أن هذا البروتوكول يوفر عددا من المزايا بما في ذلك القدرة على تتبع العرش شجيري طويلة داخل أقسام واحدة، وخيار لتأخير تشريح وتجهيز العقول المشرب، وخيار counterstaining مع البنفسجي الكريزيل لتحديد أفضل هياكل الدماغ، وهناك بعض العيوب التي ينبغييعتبر. ويمكن اعتبار فترة الحضانة 25 يوما فترة طويلة جدا لبعض المحققين. القدرة على الصورة في عمق أقسام شنت تعتمد على الوصول إلى الهدف الغمر عالية الدقة مع مسافة العمل الطويلة، وهو أمر مكلف نسبيا. وبالإضافة إلى ذلك، فإن القدرة على تصور الهياكل الدقيقة مع ارتفاع القرار النقصان كما صور احدة بالقرب من الجزء السفلي من شريحة مثبتة. ولتنفيذ هذا البروتوكول يعتمد على خصائص شكلية من الخلايا العصبية ومنطقة في الدماغ لدراستها، والمعدات المتاحة للمحقق. من المستحسن استخدام العينات "اختبار" لتحسين المتغيرات بروتوكول قبل تشغيل دراسة بحثية، مثل جولجي كوكس وقت التبويض لحجم الدماغ والمنطقة من اهتمام، والطائرة وسمك باجتزاء لجذع شجيري ل يمكن تصور.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

    Acknowledgments

    وأيد هذا العمل من قبل منحة ديسكفري إلى CDCB من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC)، وجون ريس ايفانز صندوق قادة منحة البنية التحتية البحثية لCDCB من المؤسسة الكندية للابتكار (CFI مشروع رقم 30381)، و منحة ديسكفري إلى NJM من NSERC. وأيد ELL عن طريق منح الدراسية أونتاريو العليا وعن طريق منح الأيتام والأطفال الضعفاء من كلية أونتاريو البيطري في جامعة جيلف. وأيد CDS عن طريق مساعدة مالية البحوث الجامعية الطالب من NSERC. وأيد ALM عن طريق منح الكسندر غراهام بيل من NSERC وقبل منح الأيتام والأطفال الضعفاء من كلية أونتاريو البيطري في جامعة جيلف.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    potassium dichromate Fisher Scientific P188-100 Hazardous
    potassium chromate Fisher Scientific P220-100 Hazardous
    mercuric chloride Fisher Scientific S25423 Hazardous
    Whatman grade 1 filter paper Fisher Scientific 1001-185
    isoflurane Pharmaceutical Partners of Canada CP0406V2
    20 mL scintillation vial Fisher Scientific 03-337-4
    sucrose Bioshop Canada SUC700.1
    sodium phosphate monobasic Sigma Aldrich S5011-500G
    sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S9390-500G
    50 mL conical tube Fisher Scientific 12-565-271
    isopentane Fisher Scientific AC126470010 Also known as 2-methylbutane; hazardous
    agar Sigma Aldrich A1296-100G
    small weigh dish Fisher Scientific 02-202-100
    vibratome Leica VT1000 S
    6-well tissue culture plates Fisher Scientific 08-772-1b
    mesh bottom tissue culture inserts Fisher Scientific 07-200-214
    paraformadelhyde (PFA), 16% Electron Microscope Sciences 15710-S Hazardous
    ammonium hydroxide Fisher Scientific A669S-500 Hazardous
    Kodak Fixative A Sigma Aldrich P7542
    superfrost plus slides Fisher Scientific 12-550-15
    CitroSolv clearing agent Fisher Scientific 22-143-975
    anhydrous ethyl alcohol Commercial Alcohols N/A
    cresyl violet Sigma Aldrich C1791
    permount Fisher Scientific SP15-100
    upright microscope Olympus BX53 model
    colour camera, 12 bit MBF Biosciences DV-47d QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12
    3D motorized microscope stage, controller and enoders MBF Biosciences N/A Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences
    4X microscope objective Olympus 4x 0.16 N.A. UplanSApo
    10X microscope objective Olympus 10x 0.3 N.A. UPlan FL N 
    30X microscope objective Olympus 30x 1.05 N.A. UPlanSApo 
    60X microscope objective Olympus 60x 1.42 N.A. PlanAPO N
    silicone immersion oil Olympus Z-81114
    Neurolucida software MBF Biosciences Version 10
    ImageJ software U. S. National Institutes of Health Current version With the OME Bio-Formats plugin installed
    Photoshop software Adobe version CS6

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia del cervello. Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).
    2. Cox, W. H. Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen. Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).
    3. Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox Staining Step by Step. Front Neuroanat. 10, 38 (2016).
    4. Levine, N. D., et al. Advances in thin tissue Golgi-Cox impregnation: fast, reliable methods for multi-assay analyses in rodent and non-human primate brain. J Neurosci Methods. 213 (2), 214-227 (2013).
    5. Ranjan, A., Mallick, B. N. A modified method for consistent and reliable Golgi-Cox staining in significantly reduced time. Front Neurosci. 1, 157 (2010).
    6. Gibb, R., Kolb, B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods. 79 (1), 1-4 (1998).
    7. Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
    8. Narayanan, S. N., et al. Appraisal of the effect of brain impregnation duration on neuronal staining and morphology in a modified Golgi-Cox method. J Neurosci Methods. 235, 193-207 (2014).
    9. Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
    10. Sutherland, R., Gibb, R., Kolb, B. The hippocampus makes a significant contribution to experience-dependent neocortical plasticity. Behav Brain Res. 214 (1), 121-124 (2010).
    11. Hamilton, G. F., Whitcher, L. T., Klintsova, A. Y. Postnatal binge-like alcohol exposure decreases dendritic complexity while increasing the density of mature spines in mPFC Layer II/III pyramidal neurons. Synapse. 64 (2), 127-135 (2010).
    12. Nashed, M. G., Seidlitz, E. P., Frey, B. N., Singh, G. Depressive-like behaviours and decreased dendritic branching in the medial prefrontal cortex of mice with tumors: A novel validated model of cancer-induced depression. Behav Brain Res. 294, 25-35 (2015).
    13. Frauenknecht, K., et al. Mice with experimental antiphospholipid syndrome display hippocampal dysfunction and a reduction of dendritic complexity in hippocampal CA1 neurones. Neuropathol Appl Neurobiol. 41 (5), 657-671 (2015).
    14. Camacho-Abrego, I., et al. Rearrangement of the dendritic morphology of the neurons from prefrontal cortex and hippocampus after subthalamic lesion in Sprague-Dawley rats. Synapse. 68 (3), 114-126 (2014).
    15. Redila, V. A., Christie, B. R. Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus. Neuroscience. 137 (4), 1299-1307 (2006).
    16. Bailey, C. D., Alves, N. C., Nashmi, R., De Biasi, M., Lambe, E. K. Nicotinic alpha5 subunits drive developmental changes in the activation and morphology of prefrontal cortex layer VI neurons. Biol Psychiatry. 71 (2), 120-128 (2012).
    17. Lytton, W. W. From computer to brain : foundations of computational neuroscience. , Springer. (2002).
    18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd, Academic. (2001).
    19. Ha, H. A modified Golgi-Cox method with counterstain for the study of synapses. Anat Rec. 155 (1), 59-64 (1966).
    20. Swanson, L. W. The locus coeruleus: a cytoarchitectonic, Golgi and immunohistochemical study in the albino rat. Brain Res. 110 (1), 39-56 (1976).
    21. Pilati, N., Barker, M., Panteleimonitis, S., Donga, R., Hamann, M. A rapid method combining Golgi and Nissl staining to study neuronal morphology and cytoarchitecture. J Histochem Cytochem. 56 (6), 539-550 (2008).

    Tags

    علم الأعصاب، العدد 122، الخلايا العصبية التشكل، علم الأنسجة، جولجي كوكس تلطيخ، قشرة الدماغ، الحصين، التغصنات، العمود الفقري، الخلايا العصبية الهرمية
    الخلايا العصبية التصوير داخل أقسام الدماغ سميكة باستخدام أسلوب جولجي كوكس
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Louth, E. L., Sutton, C. D.,… More

    Louth, E. L., Sutton, C. D., Mendell, A. L., MacLusky, N. J., Bailey, C. D. C. Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method. J. Vis. Exp. (122), e55358, doi:10.3791/55358 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter