Summary
我们提出了一个协议，用于使用所述高尔基体考克斯染色法在厚的脑切片中，为了可视化与包含单个组织样品中的树突状长树木神经元。此协议的两种变型还提出涉及甲酚紫复染，和未加工的大脑进行长期存储的冻结。
Abstract
神经细胞染色的高尔基 - 考克斯方法已使用超过两百年的脑组织样本中推进我们的神经元形态的理解。虽然它是从实用的观点考虑，优选以制备在最大厚度可能脑切片中，为了提高识别被完全包含单个区段内染色的神经元的概率，该方法是从由高工作距离技术的角度有限-magnification显微镜物镜。我们在这里报告的协议使用在小鼠脑切片的高尔基体考克斯方法，其是在500米微米厚的切割染色的神经元，并使用配有高分辨率30X 1.05 NA硅氧烷直立显微镜遍及这些区段的深度可视化的神经元油浸物镜，其具有800μm的工作距离。我们还报告这个协议可用于复染的表面的两个有用的变体安装的脑切片用甲酚紫染色尼斯尔，或以切片和最后的处理之前，冻结长期储存整个大脑。的主要协议和它的两个变体产生染色的厚的脑切片，在整个这充分神经元的树突树和枝晶棘可以可靠地可视化和量化。
Introduction
单个神经元的组织样本中的可视化允许的神经元形态特征的原位分析，已显著提高了我们的大脑的理解，以及如何可以通过内源性疾病或外生环境因素的影响。高尔基-考克斯染色方法是在大脑中的神经元染色的随机样本的具有成本效益的，相对简单的装置。首先通过高尔基1在19世纪开发并由考克斯2改性，研究人员已经进一步改进这种技术多年来，以产生清晰，染色的神经元可被用于可视化和量化两者树突树形态和棘密度3,4 5，6，7，8，9。
对于染色的神经元的脑切片中的可视化的一个主要技术考虑是最大的切片厚度，这是由可用高倍率/高分辨率显微镜物镜的工作距离的限制。在60共同油浸物镜 - 100X范围上提供优异的分辨率，但他们的工作距离是通常不超过200微米的更大的限制。在200微米范围内切脑切片可能是足够的可视化可以被包含在此切片厚度内的某些神经元类型，在大脑皮质10，11，12，在的CA1区锥体细胞的浅层示例锥体神经元海马13，14，和颗粒细胞在海马15的齿状脑回。相对较长的神经元树突树，如大脑皮层的深层内锥体神经元，对于鼠标可以从细胞体16延伸大于800μm，提供了更大的挑战，因为大脑将需要在一个完美的角度被分段以包含整个树突树在200倍微米的切片。这甚至可能不是可行的，如果枝晶或任何其分支在延髓或尾方向延伸。虽然可以通过跟踪在多个相邻的脑切片中的神经元，以解决此限制，这种方法引入了在准确对准部分用于跟踪17显著的技术挑战。一个更实际的方法是可视化包含被以更大的厚度切脑切片内整个神经元。
我们在这里报告的技术染色400元以内 - 使用高尔基 - 考克斯方法小鼠的500微米厚的脑切片，并以可视化的MOrphology使用具有800微米的工作距离的高分辨率硅油浸物镜。我们描述了高尔基体考克斯浸渍和处理协议从最引用的现代协议之一在文献6改性。我们的与厚的脑切片方法提供了增加的标识被完全包含在节中的任何类型的神经元的概率的优点。除了主协议中，我们还提供独特的优点本两个变化：（1）高尔基体考克斯染色具有安装部分的表面上的甲酚紫染液中，为了限定脑区的边界，并确定的层大脑皮层，和（2）高尔基体考克斯染色与之前切片和最后的处理浸渍整个大脑的长期存储的中间冷冻步骤。
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Protocol
成年雌性CD1系小鼠在本研究中使用。类似的染色可以在不同的年龄段使用两种性别来完成。实验动物照顾根据原则和加拿大动物保护协会的指导方针，以及实验方案经圭尔夫大学动物保护委员会的大学。
1.高尔基考克斯染色
- 脑的高尔基-考克斯浸渍
- 由重铬酸钾和铬酸钾成高品质的水分别溶解使1％的高尔基体考克斯溶液（W / V）的重铬酸钾，0.8％（W / V）的铬酸钾和1％（W / V）氯化汞。混合溶液中，添加氯化汞和过滤器使用1级滤纸最终溶液。存储长达一个月在黑暗中的解决方案。
- 麻醉，用5％异氟醚的鼠标。
- 断头安乐死鼠标，迅速取出大脑。
- 放置大脑到含有17毫升的高尔基考克斯溶液20mL玻璃闪烁瓶中，并在室温在黑暗中孵育25天。
- 通过在4℃下将其置于含有40毫升蔗糖的冷冻保护剂的50mL锥形管中（30％（W / V）蔗糖的0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.4）在黑暗中24小时Cryoprotect大脑。
注：以下可选三个步骤可被用作替代的主要协议，为了冻结所述的脑在此阶段对于长期储存。 - 通过将其浸入已预冷在干冰上200毫升异戊烷冻结整个大脑。
- 放置冷冻大脑进入在黑暗中的50mL锥形管中，并储存在-80℃。
- 当准备好继续时，通过将其放置到含有40毫升在黑暗中蔗糖的冷冻保护剂在4℃下24小时的50mL锥形管解冻大脑。
- 脑切片
- 从蔗糖和集团取出大脑ķ它用于通过切断使用刀片小脑和在脑的剩余尾端留下一平边缘切片。
- 热琼脂（3％（重量/体积）的水），直到它被熔化并放冷，直到它是稍微高于其熔点。
- 放置在脑以其尾端面朝下一个小一次性称重盘中，并添加熔融的琼脂足够量的以覆盖大脑。
- 一旦琼脂凝固后，修剪多余琼脂留下大约2 - 4毫米大脑周围和胶水大脑使用乙基氰基丙烯酸酯胶少量其尾端面朝下一个振动切片机的阶段。
- 填充蔗糖的冷冻保护剂的足量的振动切片机的阶段区以覆盖所述脑，和部分中的脑在400层厚 - 使用86赫兹的振动频率为500μm（取决于大脑区域待检查）和为0.125mm / s的刀片前进速度。
- 使用小油漆刷，地点脑切片成含有市售的网状底部插入和6孔组织培养板的孔中的预填充用10mL的6％的0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.4（W / V）蔗糖。
- 在4℃CO / N孵育在黑暗部分。
- 开发脑切片
- 使用网状底部插入，在0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.4中转移的脑切片到一个新的孔含有5毫升的2％（W / V）多聚甲醛（PBD）。孵育上的摇杆以低速在黑暗中在RT移动15分钟。
- 通过将它们转移到含有5毫升水新井洗部分两次。洗上的摇杆以中等速度在黑暗中在RT移动5分钟。
- 转移部分到含有5毫升的2.7％（V / V）氢氧化铵一个新井。孵育上的摇杆以缓慢的速度在黑暗中在RT移动15分钟。
- 通过将它们转移到含有5毫升水新井洗部分两次。 Ø洗净呐摇杆以中等速度在黑暗中在RT移动5分钟。
- 转印部到一个新的孔含有5毫升固定剂A的（见材料表 ），其具有在水中的10倍稀释从其原始购买浓度。孵育上的摇杆以缓慢的速度在黑暗中在RT移动25分钟。
- 通过将它们转移到含有5毫升水新井洗部分两次。洗上的摇杆以中等速度在黑暗中在RT移动5分钟。
- 安装脑切片
- 使用小油漆刷，安装部到显微镜载玻片上。除去过量的水和琼脂使用镊子和小组织。确保所有琼脂和脱水继续之前除去。
- 允许部分空气干燥在室温约45分钟（400个微米的部分）或90分钟（500个微米的部分）。
注：干的时间和适当的水平是关键的，并且可能需要在每一个都被确定实验室取决于环境温度和湿度水平。过短的干燥时间，导致在随后的脱水步骤脱落幻灯片的部分，和太长的干燥时间导致部分开裂。部分将仍然显得有光泽，在干燥的适当水平。 - 通过将滑动到科普林染色瓶当指示用甲酚紫染色切片。
注：此可选步骤可以采用一种从未冰冻切片，以染色用甲酚紫神经元细胞核。我们发现，清理和甲酚紫孵育前补水部分导致甚至染色和跨节低背景。- 在清除剂5分钟放置。重复一次。
- 在100％乙醇放置5分钟。重复一次。
- 在95％乙醇中放置水，再用75％乙醇在水中，然后在水中50％的乙醇，每次2分钟。
- 在水中放置5分钟。
- 在0.5％的地方（W / V）CRESYL在水中呈紫色7分钟。
- 在水中放置2分钟。重复一次。
- 通过将滑动到科普林染色罐子所示脱水部分。
- 在50％乙醇中放置水，再用75％乙醇在水中，然后在水中95％的乙醇，每次2分钟。
- 在100％乙醇放置5分钟。重复一次。
- 在清除剂5分钟放置。重复一次。
注意：这些脱水和清洁时间足以在这个手稿中描述处理小鼠的大脑。然而，我们观察到对其他物种，包括大鼠和牛鹂属，最终结算步骤可能需要被延长至15分钟总。
- 使用无水安装平台盖玻片部分。
- 允许滑动以水平地在黑暗中在室温下至少5天干燥。
2.厚脑切片内成像彩色神经元
- 捕获图像堆栈
- 打开显微镜灯泡，相机和阶段控制器。
- 打开显微镜软件（ 例如 ，Neurolucida）。
- 放置在显微镜载物台上的滑动。
- 使用低放大倍数的物镜如1.25X 0.4 NA PlanAPO或4X 0.16 NA捕获脑切片的2D宽视图图像
- 焦点图像和调整相机设置包括曝光时间和白平衡。
- 上一节创建左键点击一个参考点的任何位置
- 通过选择图像采集窗口内“获取单个图像”捕获图像。
- 捕获包含感兴趣的神经元（多个）区域的中间分辨率图像栈，使用10X 0.3 NA UPlan FLÑ目标。
- 聚焦图像和调整相机设置包括曝光和白平衡。
- 通过集中到一个部分的顶部设置用于图像堆栈中的上和下边界第二选择“设置”图像采集窗口内旁边的“堆栈的顶部”，然后聚焦到段的底部，并选择所述图像采集窗口内“设置”旁边的“栈的底部”。
- 由图像采集窗口内输入“5微米”旁边的“距离图像之间的”设定为5μm的步距。
- 由图像采集窗口内选择“获取图像堆栈”捕获图像栈。
- 重复上述步骤，以捕获感兴趣的整个区域，确保所有图像栈至少10％，在X和Y轴重叠。
- 捕获包含感兴趣的神经元区域的高分辨率图像栈，使用30X 1.05 NA硅油浸泡的目的。
- 申请3 - 硅浸油4滴于载玻片并把目标在幻灯片，确保能够使目标与爱之间的接触湖
- 聚焦图像和调整相机设置包括曝光和白平衡。
- 通过集中到该部分的顶部，并选择“设定”设定为图像堆栈中的上和下边界旁图像采集窗口内，然后“堆的顶部”聚焦到段的底部，并选择“设置”图像采集窗口内旁边的“栈的底部”。
- 由图像采集窗口内输入“1微米”旁边的“距离图像之间的”设置为1微米的步距。
- 由图像采集窗口内选择“获取图像堆栈”捕获图像栈。
- 重复上述步骤，以捕获感兴趣的整个区域，确保所有图像栈至少10％，在X和Y轴重叠。
- 保存数据文件和TIFF格式保存所有图像文件进行外部处理。
- 创建ImageJ的Z-投影图像
- 已经安装了生物格式插件打开ImageJ软件。
- 选择“插件” - >“生物格式” - >“生物格式进口商”。
- 选择图像栈要打开的文件。
- >“类型” - - >“RGB颜色”一旦文件被打开，通过选择“图像”更改格式为RGB。
- 通过选择 “图像” 创建Z-投影 - > “堆栈” - > “Z项目...”。
- 保存的二维Z-投影图像为TIFF文件。
- 创建感兴趣整个区域的二维图像蒙太奇。
- 打开软件（ 如 Adobe公司的Photoshop）。
- 选择 “文件” - > “自动完成” - > “的Photomerge”。
- 选择“浏览”，然后添加所有IMAGES文件合并。
- 确保“混合图像一起”被选中，然后选择“OK”。
- 保存的利益为TIFF文件的整个区域的产生蒙太奇图像。
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Representative Results
此高尔基体考克斯染色方案和它的两个描述可选的变体可以被采用以400个内可视化的单个神经元 - 500微米厚的脑切片。使用10X物镜和在Z轴5层微米的步骤捕获的二维Z-突起的代表性图像的蒙太奇显示在图1：A1 - C1为冠状脑切片的大面积，其包括前扣带回皮层区域1和次级运动皮层18。切片在500微米切割。需要注意的是，其包括甲酚紫染色的协议变体允许皮质细胞层的识别，例如，如看到的皮质层1沿部分的图1B1的软膜表面。使用利用所有的新鲜组织（ 图1A1）和协议的变体的主要协议时还要注意染色的切片的相似的外观，其中大脑通过用于长期储存（ 图1C1）冷冻部分的方式。
使用高分辨率的30X 1.05 NA硅酮油浸物镜的允许其在X大和Y比使用更高倍率的物镜捕获轴线图像栈的捕获，因此需要较少的总堆叠到图像的给定感兴趣的领域。所采用的特定目标具有800微米的工作距离，这是超过足以图像厚的脑切片。二维Z-突起的图像蒙太奇使用这一目标和在Z轴1层微米的步骤所捕获的所述前扣带回皮层区域1内示出在图1（A2-C2），以及描记为二维Z-突起指示神经元显示于图1：A3 - C3。需要注意的是允许对神经元的可视化通过高分辨率的图像和其树突每个图像堆栈的深度。使用甲酚紫的协议变体增加了紫色Nissl染色跨越切片，然而与参数采用该蜂窝染色仅在靠近切片的顶部观察到的。包括任选的冷冻步骤的协议变体产生神经元染色，类似于主协议，然而，还引入了产生雾度的由切片的表面下方衍射光的外观的漫背景染色。成像更深地进入切片时，该雾度是最明显的，并且在图1C2的Z投影图像中是显而易见的。使用30X物镜拍摄的图像也可以被用于可视化和量化精细神经元结构如树突棘。单平面图像示于图2中使用的主要协议及其两种变体染色树突，与附近的部分的顶部拍摄的一个图像和附近的部分的底部取出一个图像。注意purpl邻近其在图2B2视为漫紫色的背景/散射光附近的部分的底部在图2B1中，部分的顶部个体神经元核内尼氏物质电子甲酚紫染色。还要注意的是，尽管树突和他们的棘正在使用的协议与冷冻步骤中，将前述的背景雾度附近的切片的图2C2底部表观使得更难以通过限制之间的对比度显现刺以及染色它们与相邻的背景。更高放大倍率的目标也可以使用在图2中表征树突棘形态，作为显示：A3 - C3，其中不同类型的刺都在使用各三个协议的染色切片清晰可见。在这里，使用了60X 1.42 NA油浸物镜。我们也采用这种染色协议及其变种的hippoc内染色神经元段昂皮切断为400μm。 如图3所示，神经元树突和棘可以可视化既朝向所述部分的更内侧的区域（ 例如， 图3中的海马齿状脑回区域：A2 - C2）和该部分的更外侧的区域（ 例如， 图3中的海马CA3区域：A3 - C3）。还应当指出的是，每个染色条件产生类似的结果，优点和缺点，以图1和图2对大脑皮层中所示的那些。
处理脑切片的最终厚度取决于所使用的特定协议的变体。 如图4A含有大脑皮层切片，并在500微米切割，有协议变体上的处理所测量的厚度的显著效果和安装/盖玻片部（单向ANOVA，P <0.0001）。在此，切片的厚度使用主协议作出（251.0±12.5（SEM）微米（N = 6）），并涉及甲酚紫的协议变体（219.3±8.5微米（N = 6））比部分的厚度小使用该协议的变体涉及冷冻步骤（340.6±17.1微米（N = 6））（Bonferroni事后检验，每个比较p≤0.0006）制成。观察到协议变体非常相似的效果含有海马切片，并在400微米（ 图4B，单向ANOVA，P <0.0001）切割。在此，切片的厚度使用主协议作出（217.6±19.2微米（N = 6））和协议的变体涉及甲酚紫（198.0±14.8微米（N = 6））比部分的厚度小造使用协议的变体涉及冷冻步骤（313.5±8.4微米（N = 6））（Bonferroni事后检验，每个比较p≤0.001）。
图1.染色神经元的示例性显微照片前扣带区域1 A1 - C1，示出了大脑皮层包括所述前扣带皮层区域1和次级的一个半球使用10X物镜获得的图像栈的合并Z-突起运动皮层在大约前囟1.18毫米18。这些切片在500微米切割。显微照片是使用主所有的新鲜协议（A1），用于新鲜协议的变体用甲酚紫染色（B1）和用于协议变型，其中大脑被冻结以下高尔基考克斯浸渍（C1）中示出。比例尺是500微米。更高分辨率的合并使用30X硅油浸物镜在A2中示出取得的Z-投影图像栈- C2用于由红色平方表示的各区域uare在A1中的显微照片- C1。比例尺是100微米。神经元轨迹的2D Z-突起示于A3 - C2 -用于通过在A2中的显微照片红色箭头指示的神经元C3。所有枝晶的直径被设定为2μm为了便于说明。比例尺是100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.树突棘为彩色神经元的示例性显微照片。使用30X硅油浸物镜捕获显微照片示于一个焦平面位于该前扣带皮层区域1.这些切片切断，在500微米的层1内的神经元树突。神经元用F染色 RESH协议（A1，A2），该协议的变体用甲酚紫染色（B1，B2）和用于协议变型，其中大脑被冻结以下高尔基考克斯浸渍（C1，C2）。显微照相邻近切片的顶部（A1 - C1）和邻近的切片的底部旁边的显微镜载片（A2 - C2）。为A1-2，B1-2及C1-2比例尺是50微米。显微照片示于A3，B3和C3用于使用高放大率60X油浸物镜一个焦平面中，为了识别不同的脊柱的类型。为A3，B3和C3比例尺是10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图3.染色神经元在海马的示例性显微照片。使用4X物镜捕获显微照片中使用新鲜协议（A1），该协议的变体用甲酚紫染色（B1）染色的神经元一个焦平面被示出并为协议变型，其中大脑被冻结以下高尔基考克斯浸渍（C1 ）。切片在400微米切割并在大约前囟点-2.18毫米18被示出。比例尺是500微米为A1 - C1。更高的放大倍率显微照片是使用30X硅油浸物镜拍摄并显示在一个焦平面为神经元树突位于海马的齿状回区域内（A2 - C2）和海马的CA3区域（A3 - C3）。比例尺是50微米的A2 - C2和A3 - C3。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.厚度固定的切片的。安装部分的所测得的厚度示于一种用于容纳大脑皮层在大约前囟1.18毫米18部分，并在500米微米厚的切割，并且在B中含有海马在大约前囟-2.18毫米18个部分，并在400微米切厚度。测量切片使用任一新鲜协议，协议变体用甲酚紫染色，或在其中的大脑冻结以下高尔基考克斯浸渍的协议变体染色。对于这两个脑区域中，存在处理协议的显著效果（单向ANOVA，P <0.0001），其中从通过该协议被冻结部分的方式的大脑切片进行比那些没有冻结显著较厚（Bonferroni事后检验，所有的p <0.001）。数据显示为平均值±SEM对每个组中的六个部分，和数据集具有不同的字母表示显著差异。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
我们在这里介绍一个高尔基考克斯染色协议了两个有用的变种沿着厚的脑切片中神经元的可视化。正如代表结果所示，使用具有长800μm的工作距离的高分辨率目标的允许整个神经元在整个500μm的切割脑切片的深度可靠可视化。比较厚的脑切片的这项研究增加了任何类型的神经元染色完全包含切片，这是长而复杂的顶端树突树锥体神经元是特别重要内的概率。例如，在啮齿动物的脑中的冠状切片，这允许包括在延髓或尾方向延伸更远神经元的，并且在切片步骤正视阻断大脑时也增加了错误的余地。虽然我们描述了大脑冠状面而已，这个协议可以适用于其他PL切片切片ANES根据需要完全包含单个区段内标记的神经元。切片，使用的飞机将取决于被调查的神经元群体的形态特征。树突棘可以可视化，并使用该协议来定量，尽管更高倍率的目标需要评估脊柱类型/形态如用于产生图2中的显微照片的60X油浸物镜：A3 - C3。这可以在厚的部分可以采用但不限于物镜的工作距离内的切片的顶部。该协议也可以适用于不同物种相似的大脑尺寸的使用，因为我们发现，一个标准的25天浸渍期间将充分弄脏整个小鼠，大鼠和牛鹂属大脑的神经元，而不会导致过多的非特异性染色或背景可能与超越1个月浸渍时间发生。较短的浸渍时间可以是足够用于与S物种小光伏大脑或从上述物质，其可以通过单独的研究者进行优化的大脑解剖样品英寸
提出了这种染色协议的三个变种，采用新鲜脑样品未复的主要协议产生最佳效果。在图 2A的显微照片表明，该主协议产生良好的标记的树突和棘，他们很容易靠近顶部和安装厚部分的底部是可见的。加入甲酚紫染液具有促进大脑区域和大脑皮层层的定义的优点，但深成可视化厚的部分时，还添加了扩散紫色背景。然而，由于该协议仅变体与染色甲酚紫，树突和他们的棘安装厚的部分的表面是接近部分的底部（ 图2 B）清晰可见。这也似乎机生产线CE Nissl染色的厚部分与所示的表面附近更清晰的图案在先前的报道，使用薄得多的部分19，20，21时也是如此。包括冷冻步骤的协议变体产生树突树形态的分析可接受的结果。然而，背景染色是在新鲜组织，成像更深时到片从而使之更难以可视化和量化树突棘（ 图2 C），这是最显着的比这更暗。我们试图从大脑已被冰冻切片甲酚紫染液，以及由此产生的偶数暗紫色背景阴霾，使得它极难接近部分的底部可视化和量化刺（数据未显示）。这是评估的因素包括前高尔基体考克斯impregn冷冻小鼠脑的另一不成功协议变通货膨胀。这导致可能已神经胶质细胞的对象的染色，但不染色的任何类型的神经元（数据未显示）。
还有在这个协议必须遵循获得成功结果的两个关键步骤。 （1）它是为了验证每个实验室中的段的干燥时间关键的，因为这是高度依赖于温度和湿度。如果干燥时间过短，部分就会脱落在脱水过程中的滑动;如果干燥时间太长，部分将开裂。这将是有利的，以验证干燥时间在一组的“测试”大脑之前，为了预成型一项研究，因为这可能会因季节，即使同一个实验室有所不同。 （2）所有过量琼脂必须从脱水步骤之前的部分和显微镜载玻片移除。如果不这样做，琼脂会变形，可以拉动部分关闭的幻灯片。
对于组织学的另一个重要因素生物样品的人分析是组织收缩。我们发现，处理之后，安装，脱水和使用主高尔基考克斯协议最终部厚度减少了约一半的原始剪切值（ 图4）盖片脑切片。另外请注意，使用包括在冷冻步骤中的协议变体处理的部分比通过主协议（ 图4）进行处理，该新鲜部分显著厚。这是既有趣和意外，因为这两种协议所涉及的相同抗冻剂和加工步骤，并且只能由大脑的实际冰点不同。因此，关键的比较使用高尔基体考克斯染色从不同的研究或从不同实验室产生的神经元形态数据时，以考虑协议的电位差。虽然我们无法找到在文献中最后一节的厚度数据，这将是有益的调查人员对报告的神经元形态的措施时，报告这一数据和/或纠正组织收缩。还应当指出的是，虽然> 200微米在500微米切割部分的最终厚度比的最高倍率目标的工作距离更大，这仍远远在我们的实验室中使用的30X物镜工作距离内。由于树突和棘附近使用主高尔基考克斯协议这些切片的底部清晰可见，有可能可视化包含在一个更大的厚度高达并包括1mm的范围切段内的神经元。
虽然这个协议提供了许多优点，包括跟踪单节内长树突乔木的能力，选择推迟切片和浸渍大脑的处理，并用甲酚紫复染，以更好地识别大脑结构的选择，也有一些缺点应该可以考虑。 25天潜伏期可考虑一些研究者太长。的能力，图像深入到安装部分取决于获得高分辨率浸没物镜具有长工作距离，这是相对昂贵的。此外，可视化精细结构具有高分辨率的能力尽可能接近所安装的切片的底部一个图像减小。因此，该协议的实现依赖于神经元和脑区域的形态性质进行研究，并提供给研究者的设备。我们建议使用“测试”样品的运行一项研究，如高尔基 - 考克斯浸渍时间为大脑和感兴趣的区域的大小之前，以优化协议的变量，和切片的树突到的平面和厚度可视化。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作是由一个发现格兰特CDCB从自然科学和加拿大（NSERC）工程研究理事会，加拿大创新基金会（CFI项目编号30381），约翰·R·埃文斯领导基金研究基础设施补助金CDCB，并支持发现格兰特NJM从NSERC。 ELL是由安大略研究生奖学金和安大略兽医学院的奖学金OVC圭尔夫大学的支持。 CDS是由NSERC本科生助研支持。 ALM是由NSERC亚历山大·格雷厄姆·贝尔奖学金和安大略兽医学院在圭尔夫大学的奖学金OVC支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| potassium dichromate | Fisher Scientific | P188-100 | Hazardous |
| potassium chromate | Fisher Scientific | P220-100 | Hazardous |
| mercuric chloride | Fisher Scientific | S25423 | Hazardous |
| Whatman grade 1 filter paper | Fisher Scientific | 1001-185 | |
| isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | CP0406V2 | |
| 20 mL scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| sucrose | Bioshop Canada | SUC700.1 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S5011-500G | |
| sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9390-500G | |
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| isopentane | Fisher Scientific | AC126470010 | Also known as 2-methylbutane; hazardous |
| agar | Sigma Aldrich | A1296-100G | |
| small weigh dish | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 6-well tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1b | |
| mesh bottom tissue culture inserts | Fisher Scientific | 07-200-214 | |
| paraformadelhyde (PFA), 16% | Electron Microscope Sciences | 15710-S | Hazardous |
| ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | Hazardous |
| Kodak Fixative A | Sigma Aldrich | P7542 | |
| superfrost plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| CitroSolv clearing agent | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| anhydrous ethyl alcohol | Commercial Alcohols | N/A | |
| cresyl violet | Sigma Aldrich | C1791 | |
| permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| upright microscope | Olympus | BX53 model | |
| colour camera, 12 bit | MBF Biosciences | DV-47d | QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12 |
| 3D motorized microscope stage, controller and enoders | MBF Biosciences | N/A | Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences |
| 4X microscope objective | Olympus | 4x 0.16 N.A. UplanSApo | |
| 10X microscope objective | Olympus | 10x 0.3 N.A. UPlan FL N | |
| 30X microscope objective | Olympus | 30x 1.05 N.A. UPlanSApo | |
| 60X microscope objective | Olympus | 60x 1.42 N.A. PlanAPO N | |
| silicone immersion oil | Olympus | Z-81114 | |
| Neurolucida software | MBF Biosciences | Version 10 | |
| ImageJ software | U. S. National Institutes of Health | Current version | With the OME Bio-Formats plugin installed |
| Photoshop software | Adobe | version CS6 |
References
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- Cox, W. H. Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen. Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).
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