Summary
Vi præsenterer en protokol for anvendelse Golgi-Cox farvningsmetode i tykke hjernesnit, for at visualisere neuroner med lange dendritiske træer indeholdt i prøver enkelt væv. To varianter af denne protokol er også præsenteret som involverer cresylviolet modfarvning, og frysning af uforarbejdede hjerner for langtidsopbevaring.
Abstract
Golgi-Cox metode til neuron farvning har været ansat i mere end to hundrede år for at fremme vores forståelse af neuron morfologi inden histologiske hjerneprøver. Mens det foretrækkes ud fra et praktisk perspektiv til fremstilling hjernesnit på den størst mulige tykkelse, for at øge sandsynligheden for at identificere farvede neuroner, der er fuldt indeholdt i enkelte sektioner, denne fremgangsmåde er begrænset fra en teknisk synsvinkel ved arbejdsafstand på høj -magnification mikroskopobjektglas. Vi rapporterer her en protokol til at farve neuroner under anvendelse Golgi-Cox fremgangsmåden i muse hjernesnit, der er skåret ved 500 um tykkelse og at visualisere neuroner i hele dybden af disse sektioner ved hjælp af en opretstående mikroskop udstyret med en høj opløsning 30X 1,05 NA silicone olieimmersionsobjektiv der har en 800 um arbejdsafstand. Vi rapporterer også to nyttige varianter af denne protokol, som kan anvendes til at kontrastfarve overflademonteret hjernesnit med cresylviolet Nissl farvning, eller at fryse hele hjerner til langvarig opbevaring før sektionering og endelig behandling. Den vigtigste protokol og dens to varianter producere farvede tykke hjernesnit, hele som fuld neuron dendritiske træer og dendritceller pigge kan pålideligt visualiseret og kvantificeret.
Introduction
Visualiseringen af individuelle neuroner inden vævsprøver tillader in situ-analyse af neuron morfologiske karakteristika, som i væsentlig grad har avancerede vores forståelse af hjernen, og hvordan det kan påvirkes af endogen sygdom eller eksogene miljøfaktorer. Golgi-Cox farvningsmetode er en omkostningseffektiv, relativt simpelt middel til farvning af en stikprøve af neuroner i hjernen. Først udviklet af Golgi 1 og modificeret af Cox 2 i 1800'erne, har forskere videreudviklet denne teknik i år at producere klare, well-farvede neuroner, der kan anvendes til at visualisere og kvantificere både dendritiske træ morfologi og spidsdensitet 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9.
En vigtig teknisk overvejelse til visualisering af farvede neuroner inden hjernesnit er den maksimale skivetykkelse, som er begrænset af arbejdsafstanden af tilgængelige stor forstørrelse / høj opløsning mikroskopobjektglas. Fælles olie-nedsænkning mål på 60 - 100X range give fremragende opløsning, men er begrænset af deres arbejdsvilkår afstande, der typisk ikke er større end 200 um. Hjernesnit skåret i 200 um område være tilstrækkelig til at visualisere visse neuron typer, der kan være indeholdt i denne skivetykkelse, fx pyramideformede neuroner i lavvandede lag af hjernebarken 10, 11, 12, pyramidale neuroner i CA1-området i det hippocampus 13, 14 og granulerede celler i gyrus dentatus i hippocampus 15. Neuroner med relativt længeredendritiske træer, såsom pyramideneuroner inden dybe lag af hjernebarken, som for muse kan overstige 800 um fra cellen legeme 16, giver en større udfordring, fordi hjerner vil skulle snittet ved en perfekt vinkel at indeholde hele dendritceller træ inden for 200 um skiver. Det kan ikke engang være mulig, hvis en dendritceller eller nogen af sine filialer strækker sig i rostralt eller caudale retning. Selv om det er muligt at løse denne begrænsning ved at spore en neuron på tværs af flere tilstødende hjerne sektioner, denne tilgang introducerer en betydelig teknisk udfordring at tilpasse afsnittene præcist til sporing 17. En mere praktisk fremgangsmåde ville være at visualisere hele neuroner indeholdt i hjernesnit, der er skåret med en større tykkelse.
Vi rapporterer her en teknik til farvning neuroner inden for 400 - 500 um tykke hjerneudsnit fra mus under anvendelse af Golgi-Cox fremgangsmåden og til at visualisere deres morphology anvendelse af en høj opløsning silicium olieimmersionsobjektiv der har en 800 um arbejdsafstand. Golgi-Cox imprægnering og behandlingsprotokol, som vi beskriver er modificeret fra en af de mest citerede moderne protokoller i litteraturen 6. Vores tilgang med tykke hjernesnit tilvejebringer fordelen ved at øge sandsynligheden for at identificere neuroner af enhver type, der er fuldstændigt indeholdt i sektionen. Ud over den vigtigste protokol, vi også præsentere to variationer, der giver enestående fordele: (1) Golgi-Cox farvning med cresylviolet kontrastfarve på overfladen af monterede sektioner, for at definere grænserne for hjerneområder og identificere lag af hjernebarken, og (2) Golgi-Cox farvning med et mellemliggende frysetrin for langtidsopbevaring af imprægnerede hele hjerner før sektionering og endelig behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voksne hunner CD1-stamme mus blev anvendt i denne undersøgelse. Lignende farvning kan opnås ved hjælp af begge køn i forskellige aldre. Forsøgsdyr blev passet efter de principper og retningslinjer for den canadiske Rådet om Animal Care, og forsøgsprotokollen blev godkendt af University of Guelph Animal Care udvalget.
1. Golgi-Cox Farvning
- Golgi-Cox Imprægnering af Brains
- Gøre Golgi-Cox opløsning af 1% (vægt / volumen) kaliumdichromat, 0,8% (vægt / volumen) kaliumchromat og 1% (vægt / volumen) kviksølvchlorid ved at opløse kaliumdichromat og kaliumchromat i vand af høj kvalitet separat . Bland opløsningerne, tilsæt kviksølvchlorid og filtrere den endelige opløsning under anvendelse af grad 1 filterpapir. løsningen i mørke i op til en måned Store.
- Bedøver musen med 5% isofluran.
- Aflive musen ved halshugning, og hurtigt fjerne hjernen.
- Placer hjernen i et 20 ml glasscintillationshætteglas indeholdende 17 ml Golgi-Cox opløsning og inkuber i mørke ved stuetemperatur i 25 d.
- Cryoprotect hjernen ved at placere det i et 50 ml konisk rør, der indeholdt 40 ml sucrose kryobeskyttelsesmiddel (30% (w / v) sucrose i 0,1 M phosphatpuffer, pH 7,4) i mørke ved 4 ° C i 24 timer.
BEMÆRK: De følgende valgfrie tre trin kan anvendes som et alternativ til den vigtigste protokol, med henblik på at fryse hjernen på dette trin for langtidsopbevaring. - Fryse hele hjernen ved at nedsænke det i 200 ml isopentan, der er blevet forkølet på tøris.
- Placer frosne hjerne i et 50 ml konisk rør og opbevares i mørke ved -80 ° C.
- Når klar til at fortsætte, optø hjernen ved at placere det i et 50 ml konisk rør, der indeholdt 40 ml sucrose kryobeskyttelsesmiddel i mørke ved 4 ° C i 24 timer.
- Brain Sektionering
- Fjern hjernen fra saccharose og blokk det til sektionering ved afskæring cerebellum ved anvendelse af et barberblad og efterlader en flad kant ved resterende kaudale ende af hjernen.
- Varme agar (3% (vægt / volumen) i vand), indtil det er smeltet og lad afkøle, indtil den er lidt over dens smeltepunkt.
- Placer hjernen i en lille engangs vejer fad med sin caudale ende med forsiden nedad og tilføje en tilstrækkelig mængde smeltet agar til dækning af hjernen.
- Når agaren er størknet, trim overskydende agar mens omkring 2 - 4 mm omgiver hjernen og lim hjernen til den fase af et vibratome med sin kaudale ende forsiden nedad ved anvendelse af en lille mængde ethyl- cyanoacrylatlim.
- Fyld området fase af vibratome med en tilstrækkelig mængde af saccharose kryobeskyttelsesmiddel at dække hjernen, og afsnittet hjernen ved en skivetykkelse på 400 - 500 um (afhængigt af hjerneregion, der skal undersøges) under anvendelse af en vibrationsfrekvens på 86 Hz og et blad fremføringshastighed på 0,125 mm / s.
- Anvendelse af en lille pensel, Sted hjernesnit i en brønd i en 6-brønds vævsdyrkningsplade indeholdende kommercielt tilgængelige mesh-bottom skær og fyldt med 10 ml 6% (vægt / volumen) saccharose i 0,1 M phosphatbuffer, pH 7,4.
- Inkuber sektioner i mørke ved 4 ° CO / N.
- Udvikling Brain Sektioner
- Under anvendelse af de netformede bund skær, overføre hjernesnit i en ny brønd indeholdende 5 ml 2% (vægt / volumen) paraformaldehyd (PBD) i 0,1 M phosphatbuffer, pH 7,4. Inkuber på en rocker bevæger ved lav hastighed i mørke ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Vask sektioner to gange ved at overføre dem til nye brønde indeholdende 5 ml vand. Vask på en vippe bevæger sig med en moderat hastighed i mørke ved stuetemperatur i 5 min.
- Overleveringsstrækningerne i en ny brønd indeholdende 5 ml 2,7% (vol / vol) ammoniumhydroxid. Inkuber på en vippe bevæger sig med en langsom hastighed i mørke ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Vask sektioner to gange ved at overføre dem til nye brønde indeholdende 5 ml vand. Vask ona rocker bevæger sig med en moderat hastighed i mørke ved stuetemperatur i 5 min.
- Overleveringsstrækningerne i en ny brønd indeholdende 5 ml Fixative A (se Materialer tabel), der er blevet fortyndet i vand 10x fra sin oprindelige købt koncentration. Inkuber på en vippe bevæger sig med en langsom hastighed i mørke ved stuetemperatur i 25 min.
- Vask sektioner to gange ved at overføre dem til nye brønde indeholdende 5 ml vand. Vask på en vippe bevæger sig med en moderat hastighed i mørke ved stuetemperatur i 5 min.
- Montering Brain Sektioner
- Anvendelse af en lille malerpensel, mount sektioner onto mikroskopobjektglas. Fjerne overskydende vand og agar med en pincet og en lille væv. Sørg for, at alle agar fjernes, før man går videre med dehydrering.
- Tillad sektioner lufttørre ved stuetemperatur i ca. 45 min (400 um snit) eller 90 minutter (500 um snit).
BEMÆRK: Timingen og korrekt niveau af tørhed er kritisk, og kan være nødvendigt at blive bestemt i hvertlaboratorium afhængig af den omgivende temperatur og luftfugtighed. For kort en tørretid medfører sektioner falde ned af dias under efterfølgende dehydrering trin, og for lang en tørretid medfører sektioner revner. Sektioner vil stadig ud til at være skinnende på et passende niveau af tørhed. - Farv sektioner med cresylviolet ved at placere glider ind Coplin farvning krukker som angivet.
BEMÆRK: Dette valgfrie trin kan anvendes til sektioner, der aldrig havde været frosset, med henblik på at farve neuronale kerner med cresylviolet. Vi har fundet, at clearing og rehydrering sektioner før inkubation i cresylviolet fører til endnu farvning og lav baggrund tværs sektioner.- Placer i clearing agent for 5 min. Gentag en gang.
- Placere i 100% ethanol i 5 minutter. Gentag en gang.
- Placer i 95% ethanol i vand, herefter 75% ethanol i vand, og derefter 50% ethanol i vand i 2 minutter hver.
- Placer i vand i 5 minutter.
- Placer i 0,5% (vægt / volumen) cresyl violet i vand i 7 min.
- Placer i vand i 2 min. Gentag en gang.
- Dehydrer sektioner ved at placere glider ind Coplin farvning krukker som angivet.
- Placer i 50% ethanol i vand, herefter 75% ethanol i vand, og derefter 95% ethanol i vand i 2 minutter hver.
- Placere i 100% ethanol i 5 minutter. Gentag en gang.
- Placer i clearing agent for 5 min. Gentag en gang.
BEMÆRK: Disse dehydrering og clearingtid er tilstrækkelige til at behandle musehjerner som beskrevet i dette håndskrift. Vi har imidlertid konstateret for andre arter, herunder rotter og Cowbird, at den endelige klaringstrin kan være nødvendigt at forlænges op til 15 min total.
- Dækglas snit under anvendelse af et vandfrit monteringsmedium.
- Tillad objektglassene tørre vandret i mørke ved stuetemperatur i mindst 5 d.
2. Imaging Stained neuroner inden Tykke Brain Sektioner
- Optagelse af billede Stakke
- Tænd mikroskopet pære, kamera, og scene controller.
- Åbn mikroskop software (f.eks, Neurolucida).
- Placer en glider på objektbordet.
- Indfange et 2D bred-view billede af sektionen hjernen under anvendelse af en lille forstørrelse mål såsom 1,25X 0.4 NA PlanAPO eller 4X 0,16 NA
- Fokus billede og juster kameraets indstillinger, herunder eksponeringstid og hvidbalance.
- Opret et referencepunkt ved at venstreklikke overalt på strækningen
- Tage billedet ved at vælge "erhverve enkelt billede" i vinduet købet billedet.
- Fange mid opløsning billedstakke af området indeholdende neuronerne (er) af interesse, under anvendelse af en 10X 0,3 NA UPlan FL N mål.
- Fokuser billedet og justere kameraets indstillinger, herunder eksponering og hvidbalance.
- Indstil de øvre og nedre grænser for stakken billedet ved at fokusere på den øverste del af sektionen etnd vælge "sæt" ved siden af "toppen af stakken" i vinduet billedet erhvervelse, og derefter fokusere på bunden af sektionen og vælge "set" ved siden af "nederst i stakken" i vinduet købet billedet.
- Indstil skridt afstand til 5 um ved at indtaste "5 um" ved siden af "afstand mellem billeder" i vinduet købet billedet.
- Capture stak billedet ved at vælge "erhverve billedstak" i vinduet købet billedet.
- Gentag ovenstående trin for at fange hele området af interesse, og sørg for, at alle billedstakke overlapper med mindst 10% i X- og Y-akser.
- Fange høj opløsning billedstakke af området indeholdende neuron af interesse, under anvendelse af en 30X 1.05 NA silikone olieimmersionsobjektiv.
- Anvendelse 3 - 4 dråber nedsænkning silikoneolie til objektglasset og placere målet over glideren, hvilket sikrer at skabe kontakt mellem målet og oil.
- Fokuser billedet og justere kameraets indstillinger, herunder eksponering og hvidbalance.
- Indstil de øvre og nedre grænser for stakken billedet ved at fokusere på den øverste del af sektionen og vælge "set" ved siden af "toppen af stakken" i vinduet købet billedet og derefter fokusere på bunden af sektionen og vælge "sæt" ved siden af "nederst i stakken" i vinduet købet billedet.
- Indstil skridt afstand til 1 um ved at indtaste "1 um" ved siden af "afstand mellem billeder" i vinduet købet billedet.
- Capture stak billedet ved at vælge "erhverve billedstak" i vinduet købet billedet.
- Gentag ovenstående trin for at fange hele området af interesse, og sørg for, at alle billedstakke overlapper med mindst 10% i X- og Y-akser.
- Gem datafil og gemme alle billedfiler i TIFF-format til ekstern behandling.
- Opret Z-projektion billeder i ImageJ
- Åbent ImageJ software, der har Bio-formater plugin installeret.
- Vælg "Plugins" -> "Bio-formater" -> "Bio-formater Importør".
- Vælg det billede stak fil, der skal åbnes.
- Når filen er åbnet, ændre formatet til RGB ved at vælge "Billede" -> "Type" -> "RGB Color".
- Opret Z-projektion ved at vælge "Billede" -> "Stacks" -> "Z Project ...".
- Spar todimensional Z-projektion billede som en TIFF-fil.
- Opret et todimensionalt billede montage af hele området af interesse.
- Åbn softwaren (fx Adobe Photoshop).
- Vælg "File" -> "Automatiser" -> "Photomerge".
- Vælg "Browse" og derefter tilføje alle images filer, der skal flettes.
- Sørg for, at "Blend Images Together" er valgt, og vælg derefter "OK".
- Gem den resulterende montage billede af hele området af interesse som en TIFF-fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne Golgi-Cox farvningsprotokol og de to beskrevne valgfrie varianter kan anvendes til at visualisere individuelle neuroner inden for 400 - 500 um tykke hjernesnit. Repræsentative billede montager af to-dimensionelle Z-fremspring taget med et 10X objektiv og 5 um trin i Z-aksen er vist i figur 1: A1 - C1 for et stort område af coronale hjernesnit, som omfatter den forreste cingulate cortex område 1 og sekundær motor cortex 18. Snit blev skåret på 500 um. Bemærk, at den protokol variant, der omfatter cresylviolet farvning muliggør identifikation af corticale cellelag, for eksempel som set for kortikal Lag 1 langs pial overflade af afsnittene i figur 1B1. Bemærk også den lignende udseende farvede snit ved brug af primære protokol anvender en helt frisk væv (figur 1A1) og protokollen variant, hvorhjerner er frosne delvis gennem for langtidsopbevaring (figur 1C1).
Anvendelsen af en høj opløsning 30X 1.05 NA silikone olieimmersionsobjektiv muliggør indfangning af billedstakke der er større i X- og Y-aksen end dem taget med et højere forstørrelsesobjektiv, hvilket kræver færre samlede stakke til billedet en given interesseområde. Det specielle formål knyttet, har en 800 um arbejdsafstand, hvilket er mere end tilstrækkeligt til at afbilde tykke hjernesnit. Billeddata montager af to-dimensionelle Z-fremspring indfanget med dette mål, og 1 um trin i Z-aksen er vist i figur 1 (A2-C2) inden den forreste cingulate cortex område 1, og todimensionale Z-projektioner af tracings for angivne neuroner er vist i figur 1: A3 - C3. Bemærk de billeder i høj opløsning, der giver mulighed for visualisering af neuroner og deres dendritter gennemdybde af hver billedstak. Protokollen variant hjælp cresylviolet tilføjer lilla Nissl farvning hele skive, dog med de parametre, anvendte denne cellulære farvning kun observeret nær toppen af den pågældende del. Protokollen variant, der indbefatter det eventuelle frysetrin producerer neuron farvning, der ligner den vigtigste protokol, men det også indfører en diffus baggrundsfarvning der skaber udseendet af uklarhed ved diffrakterer lys under overfladen af udsnittet. Denne uklarhed er mest tydeligt, når billeddannelse dybere ind i skive og fremgår i Z-projektion billede i figur 1C2. Billeder taget under anvendelse af 30X mål kan også anvendes til at visualisere og kvantificere fine neuronale strukturer såsom dendritiske spidser. Single-plane billeder er vist i figur 2 for dendritter farvet ved hjælp af hovedkontakten protokol og dens to varianter, med et billede taget nær toppen af sektionen og et billede taget nær bunden af sektionen. Bemærk viole cresylviolet farvning af Nissl substans i de enkelte neuronale kerner nær toppen af sektionen i fig 2B1, hvilket ses som diffus lilla baggrund / spredt lys nær bunden af sektionen i fig 2B2. Bemærk også, at selv dendritter og deres spines er godt farves under anvendelse af protokollen med frysetrinnet, den tidligere nævnte baggrund tåge, der fremgår nær bunden af udsnittet i fig 2C2 gør det vanskeligere at visualisere pigge ved at begrænse kontrasten mellem dem og den tilstødende baggrund. Højere forstørrelsesobjektiver kan også anvendes til at karakterisere dendritiske rygsøjlen morfologi, som vist på Figur 2: A3 - C3 hvor pigge af forskellig type er klart synlige i snit farvet ved anvendelse af hver af de tre protokoller. Her blev en 60X 1,42 NA olieimmersionsobjektiv brugt. Vi anvendte også denne farvning protokol og dens varianter at plette neuroner i hippocAmpus af sektioner skåret på 400 um. Som vist i figur 3, kan Neuron dendritter og pigge visualiseres både mod mere-mediale områder af sektionen (fx hippocampus gyrus dentatus region i Figur 3: A2 - C2), og de mere-laterale områder af sektionen (f.eks , hippocampus CA3 region i Figur 3: A3 - C3). Det skal også bemærkes, at hver farvning betingelse gav lignende resultater, fordele og ulemper til dem vist i figur 1 & 2 for hjernebarken.
Den endelige tykkelse af forarbejdede hjernesnit afhænger af den specifikke protokol anvendte variant. Som vist i figur 4A til sektioner indeholdende den cerebrale cortex og skåret i 500 um, der var en signifikant effekt af protokol variant af den målte tykkelse af forarbejdet og monteret / dækglas sektioner (envejs ANOVA, p <0,0001). Her er tykkelsen af sektioner ved anvendelse af den vigtigste protokol (251,0 ± 12,5 (SEM) um (n = 6)) og protokollen variant involverer cresylviolet (219,3 ± 8,5 um (n = 6)) var mindre end tykkelsen af sektioner fremstillet under anvendelse af protokollen variant involverer frysetrinnet (340,6 ± 17,1 um (n = 6)) (Bonferroni post-hoc test, hver sammenligning p ≤ 0,0006). Meget lignende virkninger af protokol variant blev observeret for sektioner og indeholder hippocampus og skæres ved 400 um (figur 4B, envejs ANOVA, p <0,0001). Her er tykkelsen af sektioner ved anvendelse af den vigtigste protokol (217,6 ± 19,2 um (n = 6)) og protokollen variant involverer cresylviolet (198,0 ± 14,8 um (n = 6)) var mindre end tykkelsen af sektioner fremstillet under anvendelse af protokol variant involverer frysetrinnet (313,5 ± 8,4 um (n = 6)) (Bonferroni post-hoc test, hver sammenligning p ≤ 0,001).
Figur 1. Eksempler Mikrofotografier af Stained neuroner i forreste cingulate område 1. A1 - C1, Flettede Z-projektioner af billedstakke erhvervet ved anvendelse af et 10X objektiv er vist for en halvkugle af hjernebarken, der omfatter forreste cingulate cortex område 1 og sekundær motor cortex ved ca. Bregma 1,18 mm 18. Disse snit blev skåret på 500 um. Mikrofotografier er vist ved hjælp af den vigtigste al-friske protokol (A1), for den friske protokol varianten med cresylviolet farvning (B1) og for protokollen variant, hvor hjerner fryses efter Golgi-Cox imprægnering (C1). Skalapanelerne er 500 um. Højere opløsning fusionerede Z-projektion billedstakke erhvervet ved anvendelse af en 30X silicium olieimmersionsobjektiv er vist i A2 - C2 for hvert område angivet af den røde square i mikrofotografierne i A1 - C1. Skalapanelerne er 100 um. 2D Z-projektioner af neuron tracings er vist i A3 - C3 til neuronerne angivet ved røde pil i mikrofotografierne i A2 - C2. Diameteren af alle dendritter blev sat til 2 um for at lette illustrationen. Skalapanelerne er 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Eksempler Mikrofotografier af dendritiske spidser for Stained neuroner. Fotomikrografier taget med et 30X silicium olieimmersionsobjektiv er vist i et fokusplan for neuron dendritter placeret inden lag 1 i den forreste cingulate cortex område 1. Disse snit blev skåret på 500 um. Neuroner blev farvet under anvendelse af f resh protokol (A1, A2), protokollen varianten med cresylviolet farvning (B1, B2) og for protokollen variant, hvor hjerner fryses efter Golgi-Cox imprægnering (C1, C2). Der blev taget mikrofotografier nær toppen af udsnittet (A1 - C1) og nær bunden af udsnittet siden mikroskopobjektglasset (A2 - C2). Skalapanelerne for A1-2, B1-2 og C1-2 er 50 um. Mikrofotografier er vist i A3, B3 og C3 for én brændplan anvendelse af en højere forstørrelse 60X olieimmersionsobjektiv, med henblik på at identificere forskellige spine typer. Scale stænger til A3, B3 og C3 er 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
55.358 / 55358fig3.jpg"/>
Figur 3. Eksempler Mikrofotografier af Stained neuroner i hippocampus. Fotomikrografier taget med et 4X objektiv er vist i et fokusplan for neuroner farvet under anvendelse af frisk protokol (A1), protokollen varianten med cresylviolet farvning (B1) og for protokollen variant, hvor hjerner fryses efter Golgi-Cox imprægnering (C1 ). Snit blev skåret på 400 um og er vist ved ca. Bregma -2,18 mm 18. Scale barer er 500 um for A1 - C1. Højere forstørrelse mikrofotografier blev taget med et 30X silicium olieimmersionsobjektiv og er vist i et fokusplan for neuron dendritter placeret inden gyrus dentatus-området i hippocampus (A2 - C2) og CA3-området i hippocampus (A3 - C3). Scale barer er 50 um for A2 - C2og A3 - C3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Tykkelse af Mounted Sektioner. Den målte tykkelse monterede sektioner er vist i A for sektioner og indeholder hjernebarken ved ca. Bregma 1,18 mm 18 og skåret i 500 um tykkelse og i B for sektioner og indeholder hippocampus ved ca. Bregma -2,18 mm 18 og skåret i 400 um tykkelse. Målte snit blev farvet under anvendelse af enten den friske protokol protokollen varianten med cresylviolet farvning eller protokollen variant, hvor hjerner fryses efter Golgi-Cox imprægnering. For begge områder af hjernen, der var en signifikant effekt af behandlingsprotokol(Envejs ANOVA, p <0,0001), hvor snit fra hjerner, der var frosset delvis gennem protokollen var signifikant tykkere end de, der ikke blev nedfrosset (Bonferroni post-hoc test, alle p <0,001). Data er vist som middelværdi ± SEM for seks sektioner i hver gruppe, og datasæt med forskellige bogstaver angiver signifikante forskelle. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver her en Golgi-Cox farvningsprotokol sammen med to nyttige varianter til visualisering neuroner inden tykke hjernen sektioner. Som vist i Repræsentative resultater, anvendelse af en høj opløsning mål der har en lang 800 um arbejdsafstand muliggør pålidelig visualisering af hele neuroner i hele dybden af hjernesnit skåret ved 500 um. Denne undersøgelse af relativt tykke hjernesnit øger sandsynligheden for, at farvede neuroner af enhver type er fuldstændigt indeholdt i udsnittet, hvilket er særligt vigtigt for pyramideformede neuroner med lange og komplicerede apikale dendritceller træer. For eksempel i coronale snit af gnaverhjerne, dette giver mulighed for optagelse af neuroner, der strækker sig længere i den rostrale eller kaudal retning og øger også plads til fejl, når blokering hjernen holdent sektionering trin. Selvom vi beskriver hjerne sektionering i koronale plan kun kan denne protokol tilpasses til sektionering i andre plAnes som kræves for fuldt ud at indeholde mærkede neuroner i enkelte sektioner. Flyet af sektionering vil afhænge af de morfologiske egenskaber af neuron befolkningen under efterforskning. Dendritiske spidser kan visualiseres og kvantificeres under anvendelse af denne protokol, skønt højere forstørrelsesobjektiver skal vurdere rygsøjlen type / morfologi såsom 60X olieimmersionsobjektiv anvendes til fremstilling mikrofotografierne i figur 2: A3 - C3. Dette kan anvendes i tykke sektioner, men er begrænset til toppen af skive inden for arbejdsområdet afstand af målet. Denne protokol kan også tilpasses til anvendelse i forskellige arter af lignende hjerne størrelse, som vi har fundet, at en standard 25 dages imprægnering periode fuldt ud vil plette neuroner hele mus, rotter og Cowbird hjerne uden at føre til overskydende ikke-specifik farvning eller baggrund der kan opstå med imprægnering perioder på over en måned. Kortere Imprægnering perioder kan være tilstrækkelig for arter med sMøller hjerner eller i dissekerede prøver af hjerner fra de ovennævnte arter, som kunne optimeres af den enkelte investigator.
Af de tre varianter præsenteret for denne farvningsprotokol, den vigtigste protokol med friske hjerne prøver, som ikke kontrastfarvet giver de bedste resultater. Mikrofotografier i figur 2 A viser, at denne primære protokol produceres det mærkede dendritter og pigge, som er let synlig nær toppen og bunden af monterede tykke sektioner. Tilsætning af cresylviolet kontrastfarve har den fordel at lette udformning hjerneområder og cerebrale cortex lag, men også tilføjet en diffus lilla baggrund når visualisere dybt ind tykke sektioner. Da denne protokol variant kun pletter overfladen af monterede tykke sektioner med cresylviolet, dendritter og deres pigge var klart synlige nær bunden af sektioner (fig 2 B). Dette synes også at produce en klarere mønster af Nissl-farvning nær overfladen af tykke sektioner end der er vist i tidligere rapporter, selv ved anvendelse af meget tyndere sektioner 19, 20, 21. Protokollen variant, der omfatter frysetrinnet giver acceptable resultater for analyse af dendritiske træ morfologi. Imidlertid baggrundsfarvning er meget mørkere end den frisk væv, der er mest mærkbar, når billeddannelse dybere ind i udsnit og dermed gøre det vanskeligere at visualisere og kvantificere dendritceller pigge (figur 2 C). Vi forsøgte at cresylviolet kontrastfarve i snit fra hjerner, der var blevet frosset, og dette frembragte en endog-mørkere lilla baggrund dis, gjort det yderst vanskeligt at visualisere og kvantificere pigge nær bunden af sektionen (data ikke vist). En anden mislykket protokol variant, der blev vurderet inkluderet frysning musehjerner før Golgi-Cox impregntion. Dette resulterede i farvning af cellulære genstande, der kan have været glia, men farvede ikke nogen form for neuron (data ikke vist).
Der er to vigtige skridt i denne protokol, som skal følges for at opnå gode resultater. (1) Det er afgørende at verificere tørretiden af sektioner i hvert laboratorium, fordi det er meget afhængig af temperatur og fugtighed. Hvis tørretiden er for kort, vil sektionerne falde dias under dehydrering proces; hvis tørretiden er for lang, vil sektioner knække. Det ville være en fordel at kontrollere tørretid i et sæt af "test" hjerner bare før preforming en forskningsundersøgelse, da dette kan variere efter sæson selv med det samme laboratorium. (2) Alle overskydende agar skal fjernes fra sektionen og mikroskopobjektglasset før dehydrering trin. Hvis dette ikke sker, vil agaren deformere og kan trække afsnittet ud af dias.
En anden vigtig faktor for histologiskeal analyse af biologiske prøver er væv krympning. Vi fandt, at efter forarbejdning, montage, dehydratisering og dækglas hjernesnit med hovedkontakten Golgi-Cox protokol, som snittykkelse endelig blev reduceret med ca. halvdelen af den oprindelige cut værdi (figur 4). Bemærk også, at sektionerne forarbejdet under anvendelse af protokollen variant, der omfattede frysetrin var signifikant tykkere end de friske sektioner, der blev behandlet via de vigtigste protokol (figur 4). Dette var interessant og uventet, fordi begge protokoller involverede de samme kryobeskyttelse og procestrin, og kun afveg den faktiske frysning af hjerner. Det er derfor afgørende at tage højde for eventuelle forskelle i protokoller, når man sammenligner neuron morfologi data genereret med Golgi-Cox-farvning fra forskellige studier eller fra forskellige laboratorier. Selvom vi ikke var i stand til at finde data for sidste afsnit tykkelse i litteraturen, ville det være en fordelfor efterforskerne at rapportere disse data og / eller korrigere for væv svind ved rapportering foranstaltninger af neuron morfologi. Det skal også bemærkes, at selv om den endelige tykkelse> 200 um for sektioner skåret på 500 um er større end arbejdsafstand på de fleste høj-forstørrelsesobjektiver, er det stadig godt inden for arbejdsområdet afstand af 30X objektiv anvendes i vores laboratorium. Eftersom dendritter og pigge er klart synlige nær bunden af disse udsnit med den vigtigste Golgi-Cox protokol, kan det være muligt at visualisere neuroner indeholdt i sektioner skåret på en langt større tykkelse op til og med 1 mm interval.
Selv om denne protokol tilbyder en række fordele, herunder muligheden for at spore lange dendritiske dorne indenfor enkelte sektioner, at muligheden for at forsinke udskæring og forarbejdning af imprægnerede hjerner, og mulighed for modfarvning med cresylviolet til bedre at identificere hjernens strukturer, der er nogle ulemper, som børovervejes. Den 25-dages inkubationstid kan anses for lang for nogle forskere. Evnen til at billedet dybt ind monterede sektioner afhængig af adgang til en høj opløsning nedsænkning objektiv med en lang arbejdsafstand, som er relativt dyre. Hertil kommer, at evnen til at visualisere fine strukturer med høj opløsning falder som én billeder nær bunden af den monterede skive. Gennemførelsen af denne protokol afhænger derfor af de morfologiske egenskaber af neuroner og hjerne region, der skal undersøges, og det udstyr til rådighed for undersøgeren. Vi anbefaler anvendelse af "test" prøver at optimere protocol variabler før kører en forskningsundersøgelse, såsom Golgi-Cox imprægnering tid for størrelsen af hjernen og området af interesse, og planet og tykkelsen af sektionering for dendritiske arbor til visualiseres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en Discovery Grant til CDCB fra naturvidenskab og teknik Forskningsråd of Canada (NSERC), en John R. Evans Ledere Fund forskningsinfrastruktur tilskud til CDCB fra Canada Foundation for Innovation (CFI-projekt nummer 30381), og ved en Discovery Grant til NJM fra NSERC. ELL blev understøttet af en Ontario Graduate Scholarship og ved en OVC legat fra Ontario Veterinary College på University of Guelph. CDS blev understøttet af en bachelorstuderende forskningsassistent fra NSERC. ALM blev understøttet af en Alexander Graham Bell Scholarship fra NSERC og ved en OVC legat fra Ontario Veterinary College på University of Guelph.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| potassium dichromate | Fisher Scientific | P188-100 | Hazardous |
| potassium chromate | Fisher Scientific | P220-100 | Hazardous |
| mercuric chloride | Fisher Scientific | S25423 | Hazardous |
| Whatman grade 1 filter paper | Fisher Scientific | 1001-185 | |
| isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | CP0406V2 | |
| 20 mL scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| sucrose | Bioshop Canada | SUC700.1 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S5011-500G | |
| sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9390-500G | |
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| isopentane | Fisher Scientific | AC126470010 | Also known as 2-methylbutane; hazardous |
| agar | Sigma Aldrich | A1296-100G | |
| small weigh dish | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 6-well tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1b | |
| mesh bottom tissue culture inserts | Fisher Scientific | 07-200-214 | |
| paraformadelhyde (PFA), 16% | Electron Microscope Sciences | 15710-S | Hazardous |
| ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | Hazardous |
| Kodak Fixative A | Sigma Aldrich | P7542 | |
| superfrost plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| CitroSolv clearing agent | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| anhydrous ethyl alcohol | Commercial Alcohols | N/A | |
| cresyl violet | Sigma Aldrich | C1791 | |
| permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| upright microscope | Olympus | BX53 model | |
| colour camera, 12 bit | MBF Biosciences | DV-47d | QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12 |
| 3D motorized microscope stage, controller and enoders | MBF Biosciences | N/A | Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences |
| 4X microscope objective | Olympus | 4x 0.16 N.A. UplanSApo | |
| 10X microscope objective | Olympus | 10x 0.3 N.A. UPlan FL N | |
| 30X microscope objective | Olympus | 30x 1.05 N.A. UPlanSApo | |
| 60X microscope objective | Olympus | 60x 1.42 N.A. PlanAPO N | |
| silicone immersion oil | Olympus | Z-81114 | |
| Neurolucida software | MBF Biosciences | Version 10 | |
| ImageJ software | U. S. National Institutes of Health | Current version | With the OME Bio-Formats plugin installed |
| Photoshop software | Adobe | version CS6 |
References
- Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia del cervello. Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).
- Cox, W. H. Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen. Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).
- Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox Staining Step by Step. Front Neuroanat. 10, 38 (2016).
- Levine, N. D., et al. Advances in thin tissue Golgi-Cox impregnation: fast, reliable methods for multi-assay analyses in rodent and non-human primate brain. J Neurosci Methods. 213 (2), 214-227 (2013).
- Ranjan, A., Mallick, B. N. A modified method for consistent and reliable Golgi-Cox staining in significantly reduced time. Front Neurosci. 1, 157 (2010).
- Gibb, R., Kolb, B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods. 79 (1), 1-4 (1998).
- Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
- Narayanan, S. N., et al. Appraisal of the effect of brain impregnation duration on neuronal staining and morphology in a modified Golgi-Cox method. J Neurosci Methods. 235, 193-207 (2014).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Sutherland, R., Gibb, R., Kolb, B. The hippocampus makes a significant contribution to experience-dependent neocortical plasticity. Behav Brain Res. 214 (1), 121-124 (2010).
- Hamilton, G. F., Whitcher, L. T., Klintsova, A. Y. Postnatal binge-like alcohol exposure decreases dendritic complexity while increasing the density of mature spines in mPFC Layer II/III pyramidal neurons. Synapse. 64 (2), 127-135 (2010).
- Nashed, M. G., Seidlitz, E. P., Frey, B. N., Singh, G. Depressive-like behaviours and decreased dendritic branching in the medial prefrontal cortex of mice with tumors: A novel validated model of cancer-induced depression. Behav Brain Res. 294, 25-35 (2015).
- Frauenknecht, K., et al. Mice with experimental antiphospholipid syndrome display hippocampal dysfunction and a reduction of dendritic complexity in hippocampal CA1 neurones. Neuropathol Appl Neurobiol. 41 (5), 657-671 (2015).
- Camacho-Abrego, I., et al. Rearrangement of the dendritic morphology of the neurons from prefrontal cortex and hippocampus after subthalamic lesion in Sprague-Dawley rats. Synapse. 68 (3), 114-126 (2014).
- Redila, V. A., Christie, B. R. Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus. Neuroscience. 137 (4), 1299-1307 (2006).
- Bailey, C. D., Alves, N. C., Nashmi, R., De Biasi, M., Lambe, E. K. Nicotinic alpha5 subunits drive developmental changes in the activation and morphology of prefrontal cortex layer VI neurons. Biol Psychiatry. 71 (2), 120-128 (2012).
- Lytton, W. W. From computer to brain : foundations of computational neuroscience. , Springer. (2002).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd, Academic. (2001).
- Ha, H. A modified Golgi-Cox method with counterstain for the study of synapses. Anat Rec. 155 (1), 59-64 (1966).
- Swanson, L. W. The locus coeruleus: a cytoarchitectonic, Golgi and immunohistochemical study in the albino rat. Brain Res. 110 (1), 39-56 (1976).
- Pilati, N., Barker, M., Panteleimonitis, S., Donga, R., Hamann, M. A rapid method combining Golgi and Nissl staining to study neuronal morphology and cytoarchitecture. J Histochem Cytochem. 56 (6), 539-550 (2008).
