Summary
Wir präsentieren ein Protokoll der Golgi-Cox-Färbung in dicken Hirnschnitten für die Verwendung, um Neuronen mit langen Dendritenbäume innerhalb einzelner Gewebeproben enthalten ist, zu visualisieren. Zwei Varianten dieses Protokolls werden auch vorgestellt, Kresylviolett Gegenfärbung einzubeziehen und das Einfrieren von nicht verarbeiteten Gehirne für die Langzeitlagerung.
Abstract
Der Golgi-Cox-Methode von Neuron-Färbung ist seit mehr als zweihundert Jahren beschäftigt unser Verständnis der neuronalen Morphologie innerhalb histologischen Hirnproben vorzurücken. Zwar ist es aus praktischer Sicht zu bevorzugen ist, um Hirnschnitt bei der größten Dicke möglich ist, um die Wahrscheinlichkeit des Identifizierens stained Neuronen zu erhöhen, die vollständig innerhalb einzelnen Abschnitte enthalten ist, herzustellen, ist dieser Ansatz aus technischen Sicht von dem Arbeitsabstand von hohen begrenztem Lineare Wiedergabe Mikroskopobjektive. Wir berichten hier über ein Protokoll Neuronen färbt das Golgi-Cox-Verfahren in Mausgehirnschnitte verwenden, die bei 500 & mgr; m Dicke geschnitten werden, und Neuronen in der gesamten Tiefe dieser Abschnitte zur Visualisierungen mit einem hochauflösenden 30X 1,05 NA Silikon ausgerüstet ein aufrechtes Mikroskop Ölimmersionsobjektiv, das einen 800 um Arbeitsabstand aufweist. Wir berichten auch zwei nützliche Varianten dieses Protokolls, das verwendet werden kann, um die Oberfläche des gegenzufärbenmontiert Gehirnschnitt mit der Kresylviolett Nissl-Färbung, oder ganze Gehirne für die Langzeitlagerung vor dem Schneiden und Endverarbeitung gefrieren. Das Hauptprotokoll und seine zwei Varianten produzieren gefärbte dicke Hirnschnitten, wobei durchwegs voll Neuron Dendritenbäume und Dendriten Stacheln können zuverlässig sichtbar gemacht und quantifiziert werden.
Introduction
Die Visualisierung von einzelnen Neuronen innerhalb von Gewebeproben ermöglicht die in - situ - Analyse von Neuronen morphologischer Eigenschaften, die unser Verständnis des Gehirns deutlich fortgeschritten sind und wie sie durch endogene Krankheit oder exogene Umweltfaktoren beeinflusst werden. Die Golgi-Cox-Färbeverfahren sind ein kostengünstiges, relativ einfaches Mittel eine Stichprobe von Neuronen im Gehirn Anfärben. Zuerst von Golgi 1 entwickelt und modifiziert von Cox 2 in den 1800er Jahren haben die Forscher weiter verfeinert , diese Technik im Laufe der Jahre klar, gut gefärbten Neuronen zu erzeugen , die verwendet werden können , zu visualisieren und sowohl Dendritenbaum Morphologie und Wirbelsäule Dichte 3, 4, zu quantifizieren 5, 6, 7, 8, 9.
Eine wichtige technische Überlegungen für die Visualisierung von gefärbten Neuronen in Hirnschnitten ist die maximale Schichtdicke, die von der Arbeitsabstand der verfügbaren hochvergrößernde / hochauflösendes Mikroskop-Objektive begrenzt ist. Gemeinsame Öl-Tauchziele in den 60 - 100X Bereich hervorragende Auflösung bieten, sind aber durch ihre Arbeitsabstände begrenzt, die typischerweise nicht größer sind als 200 & mgr; m. Hirnschnitte bei der 200 um Bereich schneiden kann ausreichend sein , bestimmte Neuron Typen sichtbar zu machen , die innerhalb dieser Schichtdicke enthalten sein können, beispielsweise pyramidalen Neuronen in flachen Schichten der Hirnrinde 10, 11, 12, pyramidalen Neuronen in der CA1 - Region des Hippocampus 13, 14 und Körnerzellen im Gyrus dentatus des Hippocampus 15. Neurone mit relativ mehrDendritenbäume wie pyramidalen Neuronen in tiefen Schichten des Hirnrinde , die für Maus kann mehr als 800 erstrecken , um von dem Zellkörper 16, eine größere Herausforderung bieten , da Gehirne in einem perfekten Winkel geschnitten werden müßten den gesamten Dendriten Baum enthalten innerhalb von 200 & mgr; m-Scheiben. Dies kann auch nicht durchführbar sein, wenn ein Dendrit oder eine ihrer Verzweigungen in der rostralen oder kaudalen Richtung erstrecken. Während es möglich ist , diese Einschränkung zu adressieren , indem ein Neuron über mehrere benachbarte Hirnschnitte Tracing stellt dieser Ansatz eine erhebliche technische Herausforderung , die Abschnitte genau in Ausrichtung 17 zur Verfolgung. Ein praktischer Ansatz wäre gesamte Neuronen in Hirnschnitten enthalten ist, zu visualisieren, die mit einer größeren Dicke geschnitten werden.
Wir berichten hier über eine Technik Neuronen zu färben innerhalb von 400 bis 500 & mgr; m dicker Hirnschnitten von Mäusen, die die Golgi-Cox-Methode und dessen mo zu visualisierenrphology unter Verwendung eines hochauflösenden Silizium-Ölimmersionsobjektiv, das einen 800 um Arbeitsabstand aufweist. Das Golgi-Cox Imprägnierung und Verarbeitungsprotokoll , das wir beschreiben , wird aus einem der zitierten modernen Protokollen in der Literatur 6 modifiziert. Unser Ansatz mit dicken Hirnschnitten bietet den Vorteil einer Erhöhung der Wahrscheinlichkeit der Identifizierung Neuronen jeglicher Art, die im Abschnitt vollständig enthalten sind. Neben dem Hauptprotokoll wir auch zeigen zwei Varianten, die einzigartige Vorteile bieten: (1) Golgi-Cox-Färbung mit Cresylviolett Gegenfärbemittel auf der Oberfläche der montierten Teile, um die Grenzen der Hirnregionen zu definieren und Schichten des identifizieren Großhirnrinde, und (2) Golgi-Cox-Färbung mit einem Zwischengefrierschritt für die lang~~POS=TRUNC von imprägniertem gesamtem Gehirn vor dem Schneiden und Endverarbeitung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Erwachsene weibliche CD1-Stamm-Mäuse wurden in dieser Studie verwendet. Ähnliche Färbung kann unter Verwendung beider Geschlechter in verschiedenen Altersstufen durchgeführt werden. Versuchstiere wurden nach den Grundsätzen und Richtlinien des Canadian Council on Animal Care betreut, und das experimentelle Protokoll wurde von der University of Guelph Animal Care Committee genehmigt.
1. Golgi-Cox Staining
- Golgi-Cox Imprägnierung von Brains
- Macht die Golgi-Cox Lösung von 1% (w / v) Kaliumdichromat, 0,8% (w / v) Kaliumchromat und 1% (w / v) Quecksilberchlorid durch das Kaliumdichromat Auflösen und Kaliumchromat in hochwertiges Wasser separat . Mischen Sie die Lösungen, fügen Sie das Quecksilberchlorid und filtern die endgültige Lösung unter Verwendung von Grad 1 Filterpapier. Bewahren Sie die Lösung im Dunkeln für bis zu einem Monat.
- Betäuben die Maus mit 5% Isofluran.
- Euthanize die Maus durch Enthauptung und schnell das Gehirn entfernen.
- Legen Sie das Gehirn in ein 20 ml Glasszintillationsröhrchen mit 17 ml Golgi-Cox-Lösung und Inkubieren im Dunkeln bei RT 25 d.
- Cryoprotect das Gehirn, indem es in ein konisches 50 ml-Röhrchen mit 40 ml Saccharose Kryoprotektivum (30% (w / v) Sucrose in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4) im Dunkeln bei 4 ° C für 24 h platziert.
HINWEIS: Die folgenden optionalen drei Schritte als Alternative zum Hauptprotokoll verwendet werden können, um das Gehirn in dieser Phase für die langfristige Lagerung einfrieren. - Frieren Sie das ganze Gehirn, indem es in 200 ml Isopentan getaucht, das auf Trockeneis vorgekühlt wurde.
- Das tiefgefrorene Gehirn in ein 50 ml konischen Röhrchen und speichert im Dunkel bei -80 ° C.
- Wenn bereit zu gehen, aufzutauen, das Gehirn, indem es in ein konisches 50 ml-Röhrchen mit 40 ml Saccharose Kryoschutzmittels im Dunkeln bei 4 ° C für 24 h platziert.
- Gehirn Sectioning
- Entfernen Sie das Gehirn aus dem Saccharose und block es zum Schneiden durch das Kleinhirn mit einer Rasierklinge abgeschnitten und eine flache Kante an dem verbleibenden kaudalen Ende des Gehirns zu verlassen.
- Wärme-Agar (3% (w / v) in Wasser), bis sie geschmolzen und abkühlen lassen, bis sie geringfügig über seinem Schmelzpunkt liegt.
- Legen Sie das Gehirn in einem kleinen Einweg wiegt Gericht mit seinen Schwanzende bedruckten Seite nach unten und fügen Sie eine ausreichende Menge an geschmolzenem Agar, das Gehirn zu decken.
- Sobald der Agar sich verfestigt hat, Überschüssiges Agar verlassen etwa 2 bis 4 mm um das Gehirn und das Gehirn auf die Bühne eines Vibratom mit seinem caudalen Ende der Vorderseite nach unten Leim eine kleine Menge von Ethylcyanoacrylat Leim.
- Füllen Bühnenbereich des Vibratom mit einer ausreichenden Menge an Saccharose Gefrierschutzmitteln, das Gehirn zu bedecken, und Abschnitt des Gehirn bei einer Schichtdicke von 400 bis 500 um (je nach der Hirnregion zu untersuchenden) unter Verwendung eine Schwingungsfrequenz von 86 Hz und eine Klingenvorschubgeschwindigkeit von 0,125 mm / s.
- Mit einem kleinen Pinsel, Place Hirnschnitten in eine Vertiefung einer 6-Well-Gewebekulturplatte mit im Handel erhältlichen maschenBodenEinsätze und vorgefüllt mit 10 ml 6% (w / v) Sucrose in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4 enthält.
- Inkubieren Abschnitte im Dunkeln bei 4 ° CO / N.
- Die Entwicklung Hirnschnitten
- Unter Verwendung der maschenBodenEinsätze, übertragen Hirnschnitten in eine neue Vertiefung mit 5 ml 2% (w / v) Paraformaldehyd (PBD) in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4. Inkubieren auf einem Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT für 15 min bewegt.
- Wasche zweimal Abschnitte von ihnen, um neue Vertiefungen mit 5 ml Wasser zu übertragen. Waschen Sie auf einer Wippe mit mäßiger Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT für 5 min bewegt.
- Transferabschnitte in einen neuen gut, die 5 ml von 2,7% (v / v) Ammoniumhydroxid. Inkubieren auf einem Schüttler mit einer langsamen Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT für 15 min bewegt.
- Wasche zweimal Abschnitte von ihnen, um neue Vertiefungen mit 5 ml Wasser zu übertragen. waschen Sie ona Wippe für 5 Minuten bei mäßiger Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT bewegt.
- Transferabschnitte in einen neuen gut , die 5 ml Fixativ A (siehe Materialien Table) , die in Wasser 10 - fach von seiner ursprünglichen Konzentration verdünnt gekauft wurde. Inkubieren auf einer Wippe mit einer langsamen Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT für 25 min bewegt.
- Wasche zweimal Abschnitte von ihnen, um neue Vertiefungen mit 5 ml Wasser zu übertragen. Waschen Sie auf einer Wippe mit mäßiger Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT für 5 min bewegt.
- Montage Gehirnschnitte
- Mit einem kleinen Pinsel, montieren Schnitte auf Objektträger. Überschüssiges Wasser und Agar Pinzette und ein kleines Gewebe verwendet wird. Stellen Sie sicher, dass alle Agar, bevor mit Dehydratation entfernt wird.
- Allow Abschnitte an der Luft trocknet bei RT für etwa 45 min (400 & mgr; m Abschnitte) oder 90 min (500 & mgr; m Abschnitte).
HINWEIS: Der Zeitpunkt und die richtige Höhe der Trockenheit ist kritisch und muss möglicherweise in jedem zu bestimmendenLabor in Abhängigkeit von der Umgebungstemperatur und der Luftfeuchtigkeit. Ein zu kurzer Trocknungszeit führt zu Abschnitten aus den Folien während der anschließenden Entwässerungsschritte fallen, und ein zu lange Trocknungszeit führt zu Abschnitten Knacken. Abschnitte werden nach wie vor auf der entsprechenden Ebene der Trockenheit sein glänzend erscheinen. - Stain Schnitte mit Kresylviolett von Dias in Coplin Färbeschalen wie angezeigt setzt.
HINWEIS: Dieser optionale Schritt für Abschnitte verwendet werden kann, die eingefroren nie hatte, um neuronale Kerne mit Kresylviolett zu färben. Wir haben gefunden, dass das Clearing und Rehydratisieren Abschnitte vor der Inkubation in Kresylviolett führt zu noch über Abschnitte und niedrige Hintergrundfärbung.- Platzieren in Mittel für 5 min löschen. Wiederhole einmal.
- Legen Sie in 100% Ethanol für 5 min. Wiederhole einmal.
- Platzieren in 95% Ethanol in Wasser, dann 75% Ethanol in Wasser und dann 50% Ethanol in Wasser für 2 min je.
- Legen Sie in Wasser für 5 min.
- Platzieren in 0,5% (w / v) cresyl violet in Wasser für 7 min.
- Legen Sie in Wasser für 2 min. Wiederhole einmal.
- Dehydratisieren Abschnitte durch wie angegeben Dias in Coplin Färbeschalen platzieren.
- Platzieren in 50% Ethanol in Wasser, dann 75% Ethanol in Wasser und dann 95% Ethanol in Wasser für 2 min je.
- Legen Sie in 100% Ethanol für 5 min. Wiederhole einmal.
- Platzieren in Mittel für 5 min löschen. Wiederhole einmal.
HINWEIS: Diese Austrocknung und Clearing Zeiten sind ausreichend Gehirn der Maus zu verarbeiten, wie in diesem Manuskript beschrieben. Wir haben jedoch für andere Arten, einschließlich Ratten und cowbird beobachtet, dass der endgültige Clearing Schritt muß bis 15 min insgesamt verlängert werden.
- Coverslip Abschnitte eine wasserfreie Befestigungsmedium verwendet.
- Erlauben Folien für mindestens 5 d horizontal im Dunkeln bei RT zu trocknen.
2. Imaging Stained Neurone innerhalb Thick Hirnschnitten
- Erfassen von Bildstapel
- Schalten Sie das Mikroskop Glühbirne, die Kamera und Objekttischsteuerung.
- Öffnen Sie die Mikroskop - Software (zB Neurolucida).
- Platzieren einer Folie auf dem Mikroskoptisch.
- Erfassen eine 2D-Weitsichtbild des Gehirns Abschnitt eine niedrige Vergrößerung Ziel Verwendung wie 1,25X 0,4 NA PlanApo oder 4x 0,16 NA
- Fokus Bild und stellen Sie die Kameraeinstellungen einschließlich der Belichtungszeit und Weißabgleich.
- Erstellen Sie einen Referenzpunkt mit der linken Maustaste irgendwo auf dem Abschnitt
- Nehmen Sie das Bild von „erwerben einzelnes Bild“ im Bildaufnahmefenster auswählen.
- Erfassen Mitte Auflösung Bildstapel der Fläche enthält, die Neuronen (e) von Interesse, unter Verwendung eines 10X-0,3 NA uPlan FL N Ziels.
- das Bild konzentrieren und die Kameraeinstellungen einschließlich der Belichtung und Weißabgleich einzustellen.
- Stellen Sie die obere und untere Grenze für die Bildstapel durch an der Oberseite des Abschnitts eine fokussierendend die Auswahl von „gesetzt“ neben „top of stack“ innerhalb des Bildaufnahmefensters, und dann auf den Boden des Abschnitts konzentriert und „set“ neben „bottom of stack“ innerhalb des Bildaufnahmefensters ausgewählt wird.
- Stellen Sie das Schrittweite bis 5 um durch „5 & mgr; m“ neben „Abstand zwischen den Bildern“ innerhalb des Bildaufnahmefensters eintritt.
- Nehmen Sie das Bild Stapel von „acquire Bildstapel“ im Bildaufnahmefenster auswählen.
- Wiederholen der obigen Schritte den gesamten Bereich von Interesse zu erfassen, um sicherzustellen, dass alle Bildstapel von mindestens 10% überlappen, in der X- und Y-Achsen.
- Erfassen hochauflösenden Bildstapeln der Fläche des Neurons von Interesse enthalten, unter Verwendung eines 30X 1,05 NA Silikonölimmersionsobjektiv.
- Anwenden von 3 bis 4 Tropfen Silikon Sionsöl auf den Objektträger und legt das Ziel über den Objektträger, um sicherzustellen, Kontakt herzustellen zwischen dem Objektiv und oil.
- das Bild konzentrieren und die Kameraeinstellungen einschließlich der Belichtung und Weißabgleich einzustellen.
- Stellen Sie die obere und untere Grenze für die Bildstapel durch an die Oberseite des Abschnitts Fokussierung und die Auswahl von „gesetzt“ neben „top of stack“ innerhalb des Bildaufnahmefensters, und dann auf den Boden des Abschnitts Fokussierung und die Auswahl von „gesetzt“ neben „bottom of stack“ innerhalb des Bildaufnahmefensters.
- Stellen Sie die Schrittweite auf 1 & mgr; m um „1 & mgr; m“ neben „Abstand zwischen den Bildern“ innerhalb des Bildaufnahmefensters eintritt.
- Nehmen Sie das Bild Stapel von „acquire Bildstapel“ im Bildaufnahmefenster auswählen.
- Wiederholen der obigen Schritte den gesamten Bereich von Interesse zu erfassen, um sicherzustellen, dass alle Bildstapel von mindestens 10% überlappen, in der X- und Y-Achsen.
- Speichern Sie die Datei und speichern Sie alle Bilddateien im TIFF-Format für externe Verarbeitung.
- Erstellen Z-Projektionsbilder in ImageJ
- Offene ImageJ-Software, die das Bio-Formate Plugin installiert hat.
- Wählen Sie "Plugins" -> "Bio-Formate" -> "Bio-Formate Importeur".
- Wählen Sie die Bildstapel-Datei zu öffnen.
- Sobald die Datei geöffnet wird, um das Format zu ändern, indem RGB „Bild“ wählen -> „Type“ -> „RGB-Farbe“.
- Erstellen Sie die Z-Projektion durch Auswahl von "Bild" -> "Stacks" -> "Z Projekt ...".
- Speicher zweidimensionales Z-Projektionsbild als TIFF-Datei.
- Erstellen Sie ein zweidimensionales Bild Montage der gesamten Fläche von Interesse.
- Öffnen Sie die Software (zB Adobe Photoshop).
- Wählen Sie "Datei" -> "Automatisieren" -> "Photomerge".
- Wählen Sie „Durchsuchen“ und dann alle imag hinzufügenes Dateien zusammengeführt werden.
- Stellen Sie sicher, dass „Blend Images Together“ ausgewählt ist, und wählen Sie dann „OK“.
- Speichern Sie die Montagebild des gesamten Bereichs von Interesse als TIFF-Datei.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
500 & mgr; m dicke Gehirnschnitte - Dieses Golgi-Cox-Färbung Protokoll und seine beiden beschriebenen optionalen Varianten können einzelne Neuronen innerhalb von 400 zu visualisieren eingesetzt werden. Repräsentatives Bild montages von zweidimensionalen Z-Projektionen Ziel unter Verwendung eines 10X aufgefangen und 5 um Schritte in der Z - Achse ist in Abbildung 1 gezeigt: A1 - C1 für einen großen Bereich der koronalen Hirnschnitten, die den anterioren cingulären Cortex Bereich 1 und das umfassen Sekundärmotor 18 cortex. Die Schnitte wurden bei 500 & mgr; m geschnitten. Man beachte , daß die Protokoll - Variante , die Kresylviolett - Färbung ermöglicht die Identifizierung der kortikalen Zellschichten, zum Beispiel enthält als für Rindenschicht 1 entlang der Pia - Oberfläche der Abschnitte in Figur 1B1 gesehen. Man beachte auch das ähnliche Aussehen gefärbter Abschnitte , wenn das Hauptprotokoll unter Verwendung unter Verwendung von all-frisches Gewebe (Abbildung 1A1) und die Protokollvariante , bei derGehirne werden für die Langzeitlagerung (Abbildung 1C1) teilweise durch eingefroren.
Die Verwendung eines hochauflösenden 30X 1,05 NA Silikonölimmersionsobjektiv erlaubt die Erfassung von Bildstapeln, die größer in der X und Y-Achsen als die einen höheren Verkleinerungs Ziel erfasst Verwendung, wodurch insgesamt weniger Stapeln dem Bild einer gegebenen erfordern Interessenbereich. Das besondere Ziel verwendet wird, hat einen 800 & mgr; m Arbeitsabstand, der das Bild dicken Gehirnschnitt mehr als ausreichend ist. Bildmontagen von zweidimensionalen Z-Projektionen erfaßt unter Verwendung dieses Ziels und 1 um Schritte in der Z - Achse sind in Abbildung 1 (A2-C2) innerhalb des anterioren cingulären Cortex Bereichs 1 gezeigt ist , und die zweidimensionale Z-Projektionen von Kurven für die C3 - A3: angegeben Neuronen sind in Abbildung 1 dargestellt. Beachten Sie die Bilder mit hoher Auflösung, die für die Visualisierung von Neuronen und ihre Dendriten durch die erlaubenTiefe jeden Bildstapels. Die Protokollvariante Kresylviolett fügt über die Scheibe lila Nissl-Färbung verwendet wird, jedoch mit den Parametern dieser zelluläre Färbung verwendet wird, nur in der Nähe der Oberseite der Scheibe beobachtet. Die Protokoll-Variante, die den optionalen Gefrierschritt umfasst erzeugt Neuron Färbung, die mit dem Hauptprotokoll ähnlich ist, aber es führt auch eine diffuse Hintergrundfärbung, die das Aussehen einer Trübung erzeugt, indem unter der Oberfläche der Scheibe Beuge von Licht. Diese Trübung ist am deutlichsten , wenn tiefer in den Schichtaufnahmen und zeigt sich in der Z-Projektionsbild in Abbildung 1C2. Bilder erfasst das 30X Ziel verwendet, können auch verwendet werden, zu visualisieren und zu quantifizieren feine neuronalen Strukturen wie dendritischen Dornen. Benen-Bilder werden in Figur 2 für Dendriten gefärbt gezeigt Hauptprotokoll und seine beiden Varianten verwenden, mit einem Bild in der Nähe der Spitze des Abschnitts genommen und ein Bild in der Nähe der Unterseite des Abschnitts entnommen. Beachten Sie die purple Kresylviolett - Färbung von Nissl Substanz innerhalb der einzelnen neuronalen Kerne in der Nähe der Spitze des Abschnitts in Figur 2B1, 2B2 , die als diffuses violetten Untergrund / gestreute Licht in der Nähe der Unterseite des Abschnitts in Figur zu sehen ist. Man beachte auch , dass , obwohl Dendriten und ihre Stacheln sind gut gefärbt , um das Protokoll mit dem Gefrierschritt unter Verwendung der zuvor erwähnten Hintergrundtrübung , die in der Nähe der Unterseite der Scheibe in Figur ersichtlich 2C2 macht es schwieriger , Stacheln zu visualisieren durch den Kontrast zwischen Begrenzungs sie und der angrenzende Hintergrund. A3 - C3 wo Stacheln unterschiedlicher Arten sind deutlich sichtbar in den Abschnitten jeder der drei Protokolle gefärbt mit: Höhere vergrößernden Objektiven können auch dendritischen Dorn Morphologie zu charakterisieren, die in Bild 2 verwendet werden. Hier wird ein 60X 1,42 NA Ölimmersionsobjektiv verwendet wurde. Wir haben auch dieses Färbeprotokolls und seine Varianten eingesetzt zu färben Neuronen innerhalb des Hippocampus von Abschnitten bei 400 & mgr; m geschnitten. Wie in Figur 3, können Dendriten und Stacheln Neurons gezeigt sowohl in Richtung der mehr medialen Bereiche des Abschnitts visualisiert werden (beispielsweise 3 die Hippocampus dentatus Region Gyrus in Figur: A2 - C2) und die mehr-Seitenbereichen des Abschnitts (zB , der Hippocampus CA3 Region in Abbildung 3: A3 - C3). Es sollte auch beachtet werden , dass jede Färbungsbedingung zu ähnlichen Ergebnissen, Vorteile und Nachteile , die die in den 1 & 2 für die Großhirnrinde.
Die Enddicke der verarbeiteten Gehirnschnitte hängt von der spezifischen Protokollvariante eingesetzt. Wie für die Abschnitte in 4A gezeigt die Hirnrinde und schnitt bei 500 & mgr; m war , die eine signifikante Wirkung von Protokollvariante auf der gemessenen Dicke des bearbeiteten und montiert / Deckglas versehen Abschnitte (one-way ANOVA, p <0,0001). Hier hat der Dicke der Abschnitte das Haupt Protokoll (251,0 ± 12,5 (SEM) um (n = 6)) und die Protokollvariante Einbeziehung Kresylviolett (219,3 ± 8,5 & mgr; m (n = 6)) war kleiner als die Dicke der Abschnitte machte die Protokollvariante mit dem Gefrierschritt (340,6 ± 17,1 um (n = 6)) (Bonferroni post-hoc-Test, Vergleich jeden p ≤ 0,0006) beteiligt ist. Sehr ähnliche Effekte der Protokollvariante wurden Abschnitte beobachtet , Hippocampus und bei 400 & mgr; m geschnitten (4B, one-way ANOVA, p <0,0001) enthalten. Hier hat der Dicke der Abschnitte das Haupt Protokoll (217,6 ± 19,2 um (n = 6)) und die Protokollvariante Einbeziehung Kresylviolett (198,0 ± 14,8 um (n = 6)) war kleiner als die Dicke von Abschnitten, die unter Verwendung des Protokollvariante des Gefrierschritts (313,5 ± 8,4 & mgr; m (n = 6)) (Bonferroni post-hoc-Test, Vergleich jedes p ≤ 0,001) beteiligt sind.
Abbildung 1. Beispielhafte Mikrofotografien von Bunt Neurons in dem anterioren cingulären 1. Gebiet A1 - C1 fusionierte Z-Projektionen von Bildstapeln unter Verwendung eines 10X - Objektiv erworben werden für eine Halbkugel der Hirnrinde gezeigt , dass der anterioren cingulären Cortex Bereich 1 und Sekundär umfasst motorische Kortex bei etwa Bregma 1,18 mm 18. Diese Abschnitte wurden bei 500 & mgr; m geschnitten. Photomikrographien gezeigt , um das Haupt all frischen Protokolle (A1) verwendet wird , für das frische Protokollvariante mit Kresylviolett - Färbung (B1) und für die Protokollvariante , in der Golgi-Gehirne folgende Cox Imprägnierung (C1) eingefroren. Maßstabsbalken sind 500 & mgr; m. Höherer Auflösung fusionierte Z-Projektionsbildstapeln unter Verwendung eines 30X Silizium Ölimmersionsobjektiv erworben werden in A2 gezeigt - C2 für jeden Bereich durch den roten sq angegebenenuare in den Mikrophotographien in A1 - C1. Maßstabsbalken 100 & mgr; m. C3 für die Neuronen , die durch den roten Pfeil in den Mikrophotographien in der A2 angedeutet - - C2 2D-Projektionen der Z neuron Kurven sind in A3 gezeigt. Der Durchmesser aller Dendriten wurden 2 & mgr; m zur Vereinfachung der Darstellung eingestellt. Maßstabsbalken 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2 : Beispielhafte Mikroaufnahmen von Dendriten für Bunt Neurons. Photomikrographien erfaßt ein 30X Silizium Ölimmersionsobjektiv verwendet, ist in einer Fokalebene für das Neuron Dendriten lag innerhalb der Schicht 1 von dem anterioren cingulären Cortex Bereich 1. Diese Abschnitte wurden bei 500 & mgr; m geschnitten gezeigt. Neurone wurden mit dem f gefärbt Resh Protokoll (A1, A2), die Protokollvariante mit Kresylviolett - Färbung (B1, B2) , und für die Protokollvariante , bei den Gehirne gefroren sind folgend Golgi-Cox Imprägnierung (C1, C2). Photomikrographien wurden in der Nähe der Oberseite der Scheibe genommen (A1 - C1) und in der Nähe der Unterseite der Scheibe neben dem Mikroskop - Objektträger (A2 - C2). Maßstabsbalken für A1-2, B1-2 und C1-2 sind 50 um. Photomikrographien in A3, B3 und C3 für eine Brennebene mit einem höheren Verkleinerungs 60X Ölimmersionsobjektiv, um verschiedene Typen zu identifizieren Wirbelsäule gezeigt. Maßstabsbalken für A3, B3 und C3 sind 10 um. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
55358 / 55358fig3.jpg“/>
Abbildung 3. Exemplarische Photomikrographien von Bunt Neurons in dem Hippocampus. Photomikrographien mit einem 4X Ziel erfaßt werden , in einer Fokalebene für Neuronen mit Kresylviolett - Färbung (B1) und für die Protokollvariante , bei den Gehirne werden gefrieren folgende Golgi-Cox Imprägnierung (C1 unter Verwendung des frische Protokolls (A1), die Protokollvariante gefärbt gezeigt ). Die Schnitte wurden bei 400 & mgr; m geschnitten und auf etwa -2,18 mm Bregma 18 gezeigt. Maßstabsbalken sind 500 & mgr; m für A1 - C1. Höhere Vergrößerung Photomikrographien wurden erfasst ein 30X Silizium Ölimmersionsobjektiv verwendet und werden in einer Fokalebene für das Neuron innerhalb des Gyrus dentatus Region des Hippocampus Dendriten angeordnet gezeigt (A2 - C2) und der CA3 Region des Hippocampus (A3 - C3). Maßstabsbalken sind 50 & mgr; m für A2 - C2und A3 - C3. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Die Dicke der Mounted Schnitten. Die gemessene Dicke der Abschnitte angebracht ist , für die Abschnitte A gezeigt in der Hirnrinde bei etwa Bregma 1,18 mm 18 geschnitten und bei 500 & mgr; m Dicke enthalten, und in B für die Abschnitte des Hippocampus bei etwa -2,18 mm Bregma 18 und schneiden bei 400 & mgr; m enthält , Dicke. Meßstrecken wurden gefärbt entweder das frische Protokoll, das Protokollvariante mit Kresylviolett Färbung oder die Protokollvariante, in dem Gehirn eingefroren wird nach Golgi-Cox Imprägnierung. Für beiden Hirnregionen gab es einen signifikanten Effekt des Verarbeitungsprotokolls(One-way ANOVA, p <0,0001), wobei Abschnitte von Gehirnen, die gefrorenen teilweise durch das Protokoll als die deutlich dicker waren, waren die nicht eingefroren wurden (Bonferroni post-hoc-Test, p <0,001). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM für sechs Abschnitte in jeder Gruppe, und Datensätze mit verschiedenen Buchstaben zeigen signifikante Unterschiede gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wir beschreiben hier ein Golgi-Cox Färbeprotokolls zusammen mit zwei nützliche Varianten für Neuronen im dicken Hirnschnitten sichtbar zu machen. Wie in den Repräsentative Ergebnisse gezeigt, die Verwendung eines hochauflösenden Ziel, die eine lange 800 & mgr; m Arbeitsabstand hat ermöglicht die zuverlässige Visualisierung der gesamten Neuronen über die gesamte Tiefe des Gehirns bei 500 & mgr; m geschnitten Abschnitte. Diese Studie von relativ dicken Hirnschnitten erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass gefärbt Neuronen jede Art sind vollständig innerhalb der Scheibe enthalten, die für die Pyramidenneuronen mit langen und komplizierten apikalen Dendriten Bäumen besonders wichtig ist. Beispielsweise in Koronalschnitte von Nagetier Gehirn, ermöglicht dies die Aufnahme von Neuronen, die in der rostralen oder kaudalen Richtung erstrecken weiter und erhöht auch den Raum für Fehler, wenn das Gehirn direkt an dem Schnitt Schritt blockiert. Obwohl wir beschreiben nur in der koronalen Ebene sectioning Gehirn, dieses Protokoll in anderen pl angepasst werden kann für das Schneidenane nach Bedarf vollständig innerhalb einzelnen Abschnitte enthalten markiert Neuronen. Die Ebene der eingesetzten sectioning wird auf den morphologischen Eigenschaften der Neuronenpopulation untersucht abhängen. Dendriten kann mit diesem Protokoll visualisiert und quantifiziert werden, obwohl höhere Vergrößerung Ziele erforderlich sind Wirbelsäule Typ / Morphologie wie das 60X Ölimmersionsobjektiv zur Beurteilung verwendet , um die Photomikrographien in Abbildung 2 zu erzeugen: A3 - C3. Dies kann in dicken Abschnitten eingesetzt werden, sondern ist an die Oberseite der Scheibe in dem Arbeitsabstand des Objektivs begrenzt. Dieses Protokoll kann auch für den Einsatz in verschiedenen Arten der ähnlichen Gehirngröße angepasst werden, da wir, dass ein Standard-25-Tage-Imprägnierung Zeitraum vollständig Neuronen überschüssigen nicht-spezifische Färbung oder Hintergrund der ganze Maus, Ratte und cowbird Gehirn gefunden haben, ohne dass es zu verfärben dass mit Imprägnierungszeiten über einen Monat hinaus auftreten. Kürzere Imprägnierungszeiten können für Arten mit s ausreichend sein,maller Gehirne seziert oder in Proben von Gehirnen von den oben erwähnten Arten, die von den einzelnen Investigator optimiert werden konnten.
Von den drei Varianten für dieses Färbungsprotokoll vorgestellt, das Hauptprotokoll mit frischen Hirnproben, die nicht counterstained werden die besten Ergebnisse erzielt. Photomikrographien in Figur 2 A zeigt , dass dieses Hauptprotokoll erzeugt auch markierte Dendriten und Dornen , die gut sichtbar in der Nähe der oberen und untere Ende angebrachter Verdickungen sind. Hinzufügen des Kresylviolett Gegenfärbemittel hat den Vorteil der Definition von Hirnregionen zu erleichtern und Hirnrinde Schichten, sondern auch einen diffusen violetten Untergrund hinzugefügt, wenn tief in dicke Bereiche zu visualisieren. Da jedoch nur diese Protokollvariante die Oberfläche montiert dicke Abschnitte mit Kresylviolett, Dendriten und ihre Dorne anfärbt waren deutlich sichtbar in der Nähe der Unterseite der Abschnitte (Figur 2 B). Dies scheint auch zu produce ein klareres Muster von Nissl - Färbung in der Nähe der Oberfläche der dicken Abschnitte als die gezeigten in zuvor berichtet, auch bei Verwendung von vielen dünneren Abschnitten 19, 20, 21. Die Protokollvariante, die den Gefrierschritt umfasst ergibt akzeptable Ergebnisse für die Analyse von Dendritenbaum Morphologie. Jedoch ist die Hintergrundfärbung viele dunkler als die in frischem Gewebe, das am deutlichsten ist , wenn tiefer in das Abbilden slice wodurch es schwieriger Dendriten Stacheln (2 C) sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Wir haben versucht, die Kresylviolett counterstain in Abschnitte von Gehirnen, die eingefroren worden waren, und dies erzeugt einen noch dunkleren lila Hintergrund Schleier, der es extrem schwierig gemacht zu visualisieren und zu quantifizieren Stacheln am unteren Rand des Abschnitts (Daten nicht gezeigt). Eine weitere erfolglose Protokollvariante, die bewertet wurde inklusive Einfrieren Mäusegehirne vor Golgi-Cox imprägniertation. Dies resultierte in der Färbung von Zellobjekten, die gewesen Gliazellen haben, aber befleckte nicht jede Art von Neuronen (Daten nicht gezeigt).
Es gibt zwei wichtige Schritte in diesem Protokoll, das erfolgreiche Ergebnisse zu erzielen befolgt werden müssen. (1) Es ist entscheidend, um die Trocknungszeit von Abschnitten innerhalb jeden Labors, um zu überprüfen, weil diese von der Temperatur und Feuchtigkeit in hohem Maße abhängig ist. Wenn die Trocknungszeit zu kurz ist, Abschnitte werden während des Entwässerungsprozesses aus den Folien fallen; Wenn die Trocknungszeit zu lang ist, werden Abschnitte knacken. Es wäre vorteilhaft, Trocknungszeit in einer Reihe von „test“ Gehirnen, um zu überprüfen gerade vor einer Forschungsstudie Vorformen, da dies nach Saison sogar mit dem gleichen Labor variieren. (2) Alle überschüssigen Agar muss aus dem Abschnitt und Mikroskop-Objektträger vor der Austrocknung Schritten entfernt werden. Wenn dies nicht geschieht, wird die Agar verformen und kann den Abschnitt aus den Schlitten ziehen.
Ein weiterer wichtiger Faktor für die histologischenal Analyse von biologischen Proben ist Gewebeschrumpfung. Wir fanden , daß nach der Bearbeitung, Montage, Dehydratisieren und Eindecken Gehirnschnitte des Haupt Golgi-Cox - Protokoll , dass der letzte Abschnitt Dicke um etwa die Hälfte des ursprünglichen Schnittwert (Figur 4) reduziert wurde. Beachten Sie auch , dass die bearbeiteten Abschnitte die Protokollvariante, die den Gefrierschritt enthalten waren deutlich dicker als die frischen Abschnitte , die über das Hauptprotokoll (Abbildung 4) verarbeitet wurden. Das war interessant und unerwartet, da beide Protokolle die gleichen Kryokonservierung und Verarbeitungsschritte beteiligt, und nur durch die tatsächliche Einfrieren von Gehirn unterschieden. Es ist daher von entscheidender Bedeutung für mögliche Unterschiede in den Protokollen zu berücksichtigen, wenn Neuron Morphologie Daten Vergleich von verschiedenen Studien Golgi-Cox-Färbung erzeugt wurde oder aus verschiedenen Laboratorien. Obwohl wir Daten nicht in der Lage waren für die in der Literatur letzten Abschnitt Dicke zu finden, wäre es vorteilhaft,für die Ermittler diese Daten und / oder zu korrigieren für Gewebeschrumpfung zu berichten, wenn Maßnahmen von Neuronen Morphologie berichten. Es sollte auch beachtet werden, dass obwohl die endgültige Dicke von> 200 & mgr; m für die Abschnitte bei 500 & mgr; m geschnitten ist größer als der Arbeitsabstand von allerhöchsten vergrößernden Objektiven, diese noch gut innerhalb des Arbeitsabstandes des 30X Ziels in unserem Labor verwendet wird. Da Dendriten und Stacheln deutlich sichtbar in der Nähe der Unterseite dieser Scheiben des Haupt Golgi-Cox-Protokoll verwenden sind, kann es möglich sein, Neuronen innerhalb von Abschnitten zu einem wesentlich größeren Dicke von bis zu und einschließlich dem 1 mm geschnitten Bereichs enthalten ist, zu visualisieren.
Obwohl dieses Protokoll eine Reihe von Vorteilen, einschließlich der Fähigkeit bietet lange dendritischen Dorne innerhalb einzelnen Abschnitte zu verfolgen, die Option Schneiden und Verarbeitung von imprägnierten Gehirnen zu verzögern, und die Möglichkeit, mit Kresylviolett von Gegenfärbung besser Gehirnstrukturen zu identifizieren, gibt es einige Nachteile, die solltein Betracht gezogen werden. Die 25-Tage Inkubationszeit kann für einige Forscher zu lang angesehen werden. Die Fähigkeit, Bild tief in montierten Abschnitte hängt vom Zugang zu einem hochauflösenden Immersionsobjektiv mit einem großen Arbeitsabstand, die relativ teuer ist. Darüber hinaus verringert sich die Fähigkeit, feine Strukturen mit hoher Auflösung sichtbar zu machen, wie man Bilder in der Nähe der Unterseite der Scheibe angebracht. Die Umsetzung dieses Protokolls hängt daher von den morphologischen Eigenschaften der Neuronen und Hirnregion untersucht werden, und das Gerät an die Ermittler zur Verfügung. Wir empfehlen die Verwendung von „test“ Proben-Protokoll Variablen vor der Ausführung eine Studie, wie Golgi-Cox Imprägnierungszeit für die Größe des Gehirns und die Region von Interesse, und die Ebene und die Dicke des sectioning für den dendritischen Dorn zu optimieren visualisiert werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von einem Discovery-Grant CDCB aus den Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada (NSERC) unterstützt, ein John R. Evans Leaders Fund Forschungsinfrastruktur Zuschuss CDCB aus Kanada Foundation for Innovation (CFI Projektnummer 30381) und durch eine Entdeckung Grant NJM von NSERC. ELL wurde von einem Ontario Graduate Scholarship und von einem OVC Stipendium des Ontario Veterinary College an der University of Guelph unterstützt. CDS wurde durch einen Bachelor-Student Aspirantur von NSERC unterstützt. ALM wurde von einem Alexander Graham Bell Stipendium NSERC und von einem OVC Stipendium des Ontario Veterinary College an der University of Guelph unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| potassium dichromate | Fisher Scientific | P188-100 | Hazardous |
| potassium chromate | Fisher Scientific | P220-100 | Hazardous |
| mercuric chloride | Fisher Scientific | S25423 | Hazardous |
| Whatman grade 1 filter paper | Fisher Scientific | 1001-185 | |
| isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | CP0406V2 | |
| 20 mL scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| sucrose | Bioshop Canada | SUC700.1 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S5011-500G | |
| sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9390-500G | |
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| isopentane | Fisher Scientific | AC126470010 | Also known as 2-methylbutane; hazardous |
| agar | Sigma Aldrich | A1296-100G | |
| small weigh dish | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 6-well tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1b | |
| mesh bottom tissue culture inserts | Fisher Scientific | 07-200-214 | |
| paraformadelhyde (PFA), 16% | Electron Microscope Sciences | 15710-S | Hazardous |
| ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | Hazardous |
| Kodak Fixative A | Sigma Aldrich | P7542 | |
| superfrost plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| CitroSolv clearing agent | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| anhydrous ethyl alcohol | Commercial Alcohols | N/A | |
| cresyl violet | Sigma Aldrich | C1791 | |
| permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| upright microscope | Olympus | BX53 model | |
| colour camera, 12 bit | MBF Biosciences | DV-47d | QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12 |
| 3D motorized microscope stage, controller and enoders | MBF Biosciences | N/A | Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences |
| 4X microscope objective | Olympus | 4x 0.16 N.A. UplanSApo | |
| 10X microscope objective | Olympus | 10x 0.3 N.A. UPlan FL N | |
| 30X microscope objective | Olympus | 30x 1.05 N.A. UPlanSApo | |
| 60X microscope objective | Olympus | 60x 1.42 N.A. PlanAPO N | |
| silicone immersion oil | Olympus | Z-81114 | |
| Neurolucida software | MBF Biosciences | Version 10 | |
| ImageJ software | U. S. National Institutes of Health | Current version | With the OME Bio-Formats plugin installed |
| Photoshop software | Adobe | version CS6 |
References
- Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia del cervello. Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).
- Cox, W. H. Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen. Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).
- Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox Staining Step by Step. Front Neuroanat. 10, 38 (2016).
- Levine, N. D., et al. Advances in thin tissue Golgi-Cox impregnation: fast, reliable methods for multi-assay analyses in rodent and non-human primate brain. J Neurosci Methods. 213 (2), 214-227 (2013).
- Ranjan, A., Mallick, B. N. A modified method for consistent and reliable Golgi-Cox staining in significantly reduced time. Front Neurosci. 1, 157 (2010).
- Gibb, R., Kolb, B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods. 79 (1), 1-4 (1998).
- Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
- Narayanan, S. N., et al. Appraisal of the effect of brain impregnation duration on neuronal staining and morphology in a modified Golgi-Cox method. J Neurosci Methods. 235, 193-207 (2014).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Sutherland, R., Gibb, R., Kolb, B. The hippocampus makes a significant contribution to experience-dependent neocortical plasticity. Behav Brain Res. 214 (1), 121-124 (2010).
- Hamilton, G. F., Whitcher, L. T., Klintsova, A. Y. Postnatal binge-like alcohol exposure decreases dendritic complexity while increasing the density of mature spines in mPFC Layer II/III pyramidal neurons. Synapse. 64 (2), 127-135 (2010).
- Nashed, M. G., Seidlitz, E. P., Frey, B. N., Singh, G. Depressive-like behaviours and decreased dendritic branching in the medial prefrontal cortex of mice with tumors: A novel validated model of cancer-induced depression. Behav Brain Res. 294, 25-35 (2015).
- Frauenknecht, K., et al. Mice with experimental antiphospholipid syndrome display hippocampal dysfunction and a reduction of dendritic complexity in hippocampal CA1 neurones. Neuropathol Appl Neurobiol. 41 (5), 657-671 (2015).
- Camacho-Abrego, I., et al. Rearrangement of the dendritic morphology of the neurons from prefrontal cortex and hippocampus after subthalamic lesion in Sprague-Dawley rats. Synapse. 68 (3), 114-126 (2014).
- Redila, V. A., Christie, B. R. Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus. Neuroscience. 137 (4), 1299-1307 (2006).
- Bailey, C. D., Alves, N. C., Nashmi, R., De Biasi, M., Lambe, E. K. Nicotinic alpha5 subunits drive developmental changes in the activation and morphology of prefrontal cortex layer VI neurons. Biol Psychiatry. 71 (2), 120-128 (2012).
- Lytton, W. W. From computer to brain : foundations of computational neuroscience. , Springer. (2002).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd, Academic. (2001).
- Ha, H. A modified Golgi-Cox method with counterstain for the study of synapses. Anat Rec. 155 (1), 59-64 (1966).
- Swanson, L. W. The locus coeruleus: a cytoarchitectonic, Golgi and immunohistochemical study in the albino rat. Brain Res. 110 (1), 39-56 (1976).
- Pilati, N., Barker, M., Panteleimonitis, S., Donga, R., Hamann, M. A rapid method combining Golgi and Nissl staining to study neuronal morphology and cytoarchitecture. J Histochem Cytochem. 56 (6), 539-550 (2008).
