Summary
우리는 하나의 조직 샘플에 포함 된 긴 수지상 나무와 뉴런을 시각화하기 위해, 두께 뇌 부분에 골지 - 콕스 염색 방법을 사용하기위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 두 가지 변종은 크레 실 바이올렛으로 대조, 장기 저장을위한 처리되지 않은 뇌의 동결을 포함 그되게됩니다.
Abstract
신경 세포 염색의 골지 - 콕스 방법은 조직 학적 뇌 샘플 내에서 신경 세포의 형태에 대한 우리의 이해를 사전에 200 개 이상의 년 동안 사용되어왔다. 완전히 단일 구역 내에 포함 된 스테인드 뉴런을 식별하는 가능성을 증가시키기 위해, 가능한 한 최대 두께 뇌 부분을 제조 실용적인 관점에서 바람직하지만,이 방법은 높은 작업 거리만큼 기술적 인 관점에서 제한 -magnification 현미경 목표. 우리는 여기에 500 개 μm의 두께로 절단 마우스 뇌 섹션의 골지 - 콕스 방법을 사용하여 신경 세포를 염색하고, 고해상도 30 배 1.05 NA 실리콘 장착 직립 현미경을 사용하여이 부분의 깊이를 통해 뉴런을 시각화하기 위해 프로토콜을보고 800 μm의 작동 거리를 갖는 오일 액침 대물. 우리는 또한의 표면을 Counterstain과에 이용 될 수있다이 프로토콜의 두 가지 유용한 변종을보고크레 실 바이올렛 니슬 뇌 부분을 장착하기 전이나 절편 및 최종 처리에 장기 저장을위한 전체 뇌 동결. 주요 프로토콜과의 두 가지 변종은 전체 신경 세포의 수지상 나무와 수상 돌기 가시가 안정적으로 시각화 및 정량화 할 수있는 전체에 스테인드 두께 뇌 부분을 생산하고 있습니다.
Introduction
조직 샘플 내의 개별 뉴런의 시각화는 뇌에 대한 우리의 이해를 전진 크게하고이 내인성 질환이나 외생 적 환경 적 요인에 의해 영향을받을 수있는 방법 신경 세포의 형태 학적 특성의 현장에서 분석이 가능합니다. 골지 - 콕스 염색법은 뇌에서 뉴런의 무작위 샘플을 염색하는 비용 효율적인 상대적으로 단순한 방법이다. 먼저 1800 년대에 골지 (1)에 의해 개발 콕스 2에 의해 수정, 연구자들은 또한, 시각화 및 수지상 트리 형태와 척추 밀도 3, 4 모두 정량화하는 데 사용할 수있는 명확하고 잘 스테인드 뉴런을 생산하기 위해 수년에 걸쳐이 기술을 세련했다 5, 6, 7, 8, 9,.
뇌 섹션 내에서 스테인드 뉴런의 시각화를위한 주요 기술적 인 고려 사항은 가능한 고배율 / 고해상도 현미경 목표의 작동 거리에 의해 제한되는 최대 슬라이스 두께입니다. 60 공통 오일 침지 목표 - 100X는 뛰어난 해상도를 제공 범위하지만, 일반적으로 200 μm의보다 크지 않습니다 자신의 작업 거리에 의해 제한됩니다. 200 ㎛의 범위로 잘라 뇌 절편 대뇌 피질 (10),의 CA1 영역 11, 12, 피라미드 신경의 얕은 층에서의 예시적인 피라미드 신경이 슬라이스 두께 내에 포함될 수있는 소정의 신경 세포 유형을 시각화하기 적합 할 수 해마 (15)의 치아 이랑에서 해마 13, 14, 및 과립 세포. 상대적으로 이상과 뉴런이러한 뇌 전체 수지상 트리를 포함하는 완벽한 각도로 구분 될 필요가 있기 때문에 셀 본체 (16)에서 800 μm의를 확장 할 수 있습니다 마우스, 더 큰 도전을 제공하는 대뇌 피질의 깊은 층에서 피라미드 신경 세포로 수지상 나무, 200 개 μm의 슬라이스 내의. 수지상 또는 분기 중 입쪽 또는 꼬리 방향으로 연장되는 경우에도 실현 될 수 없다. 그것은 다수의 뇌에 인접 섹션에 걸쳐 신경을 추적하여 이러한 제약을 해결하는 것이 가능하지만,이 방식은 17 정확하게 추적하는 섹션을 정렬하는 데 중요한 기술적 도전을 소개한다. 더 실용적인 접근 방식은 더 큰 두께로 잘라 뇌 섹션에 포함 된 전체 뉴런을 시각화하는 것입니다.
골지 - 콕스 방법을 사용하여 마우스의 500 μm의 두께 뇌 부분, 그들의 개월을 시각화 - 우리는 여기에 (400) 내에서 신경 세포를 염색하는 기술을보고rphology 800 μm의 작동 거리를 갖는 고해상도 실리콘 오일 침지 목적을 사용. 우리가 설명하는 골지 - 콕스 함침 처리 프로토콜은 문헌 (6)에 가장 많이 인용 된 현대 프로토콜 중 하나에서 수정됩니다. 두꺼운 뇌 섹션 우리의 접근 방식은 완전히 섹션에 포함 된 모든 유형의 뉴런을 식별의 가능성을 증가시키는 장점을 제공한다. 기본 프로토콜뿐만 아니라, 또한 독특한 장점 제공 본 개의 변형 : 위해 장착 섹션의 표면 상 크레 실 바이올렛 Counterstain과 함께 (1) 골지 - 콕스 염색 뇌 영역의 경계를 정의하고, 레이어를 식별 할 단면 처리 및 최종 처리 이전에 함침 전체 뇌의 장기 저장을위한 중간 제빙 단계와 대뇌 피질, (2) - 골지 콕스 염색.
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Protocol
성인 여성 CD1 - 변형 마우스는이 연구에 사용되었다. 유사 염색은 다양한 연령층에서 남녀 모두를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 실험 동물은 원칙과 동물 관리에있는 캐나다 협의회의 지침에 따라 마음에 든다고하고, 실험 프로토콜은 구 엘프 동물 관리위원회의 대학에 의해 승인되었다.
1. 골지 - 콕스 염색
- 두뇌의 골지 - 콕스 함침
- 별도로 고품질 물로 칼륨 중크롬산 및 크롬산 칼륨을 용해시켜 1 %의 골지 - 콕스 용액 (w / v)의 중크롬산 칼륨 0.8 % (w / v)의 크롬산 칼륨 1 % (w / v)의 염화 수은 만들기 . 상기 혼합 용액을 염화 수은을 추가 등급 1 여과지를 이용하여 최종 용액을 필터. 최대 1 개월 어둠 속에서 솔루션을 저장합니다.
- 5 %의 이소 플루 란을 사용하여 마우스를 마취.
- 잘린 마우스를 안락사 빠르게 두뇌를 제거합니다.
- 골지 - 콕스 용액 17 mL를 함유하는 20 ML 글래스 섬광 바이알로 뇌를 놓고 25 일 동안 실온에서 어두운 곳에서 배양한다.
- 24 시간 동안 4 ℃의 어두운 곳에서 (0.1 M 인산 완충액, pH가 7.4 / V) 슈 크로스 W (30 %) 자당 동결 방지제를 40㎖를 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 배치하여 뇌 Cryoprotect.
주 : 다음 옵션 세 단계가 장기 저장이 단계에서 뇌를 고정하기 위해, 주요 프로토콜의 대안으로 사용될 수있다. - 드라이 아이스에 미리 냉각 된 200 ㎖의 이소 펜탄에 침지하여 뇌 전체를 고정.
- -80 ℃에서 어둠 속에서 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 저장 동결 뇌 놓는다.
- 준비가 진행하면, 24 시간 동안 4 ℃에서 어둠 속에서 자당 동결 방지제를 40㎖를 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 배치하여 뇌를 해동.
- 뇌 단면
- 자당 및 블록에서 뇌를 제거면도날을 사용하여 소뇌를 차단하고, 뇌의 나머지 꼬리 단부에 평탄한 가장자리를 남겨 절편 대 케이.
- 열 한천 (3 % (w / v)의 물)가 용융 그것의 녹는 점보다 약간 때까지 식지 때까지.
- 그 꼬리 끝면이 아래로 작은 일회용 무게 접시에 두뇌를 놓고 두뇌를 포함 용융 한천의 충분한 양을 추가합니다.
- 한천은 고형화되면, 약 2 이탈 초과 한천 트림 - 뇌를 둘러싸고 4mm 및 에틸 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 소량 사용하여 꼬리 단면 다운 가진에 vibratome의 스테이지 뇌 접착제.
- 400, 슬라이스 두께 뇌 및 단면 뇌 다루 자당 동결 방지제의 충분한 양을 가진에 vibratome의 스테이지 영역 채움 - 86 Hz의 진동 주파수를 사용하여 (피검 뇌 영역에 따라) 500 ㎛ 또는 0.125 mm / s의 블레이드 발전 속도.
- 작은 페인트 브러시를 사용하여상업적으로 이용 가능한 메쉬 바닥 인서트와를 함유하는 6- 웰 조직 배양 플레이트의 웰에 위치 뇌 부분 미리 작성된 6 % 10 ㎖의 0.1 M 인산 완충액, pH를 7.4 (w / v)의 자당.
- CO 4 ° / N의 어두운 부분을 부화.
- 뇌 섹션 개발
- 메쉬 바닥 인서트를 사용하여 0.1 M 인산 완충액, pH 7.4의 웰에 2 %의 파라 포름 알데히드 5 ㎖ (/ V w) (PBD)를 포함하는 신규로 뇌 단면을 옮긴다. 실온에서 15 분 동안 어두운 데에서 저속으로 이동하는 로커 인큐베이션.
- 5 ㎖의 물을 함유하는 새로운 우물로 전송하여 두 부분을 씻는다. 5 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 중간 속도로 이동하는 로커 씻는다.
- 2.7 % (V / V) 수산화 암모늄을 함유하는 5 ㎖의 새로운 웰로 수수 부. 실온에서 15 분 동안 어두운 데에서 느린 속도로 이동 로커에 부화.
- 5 ㎖의 물을 함유하는 새로운 우물로 전송하여 두 부분을 씻는다. 오 세척5 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 중간 속도로 이동 NA 로커.
- 또한 정착액 (A)의 5 ㎖을 함유하는 신규로 수수 부 원래 구입 농도에서 물에 10 배 희석 한 것 (재료 표 참조). 25 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 느린 속도로 이동 로커에 부화.
- 5 ㎖의 물을 함유하는 새로운 우물로 전송하여 두 부분을 씻는다. 5 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 중간 속도로 이동하는 로커 씻는다.
- 뇌 섹션을 장착
- 작은 페인트 브러시를 사용하여, 현미경 슬라이드 위에 섹션을 탑재합니다. 여분의 물을 제거하고 핀셋과 작은 조직을 사용하여 한천. 모든 한천 탈수를 진행하기 전에 제거되었는지 확인합니다.
- 약 45 분 (400 개 ㎛의 부분) 또는 90 분 (500 개 ㎛의 부분)을 실온에서 공기 건조시킨 부분을 허용한다.
주 : 건조시기 적절한 수준은 중요하고, 각 결정해야기관 주위 온도 및 습도 수준에 따라. 너무 짧은 건조 시간 이후 탈수 단계에서 슬라이드 탈락 섹션에 이르게, 너무 긴 건조 시간이 균열 부분에 연결됩니다. 섹션은 여전히 건조의 적절한 수준에서 반짝 것으로 나타납니다. - 나타낸 바와 같이, 코 플린 염색 단지에 배치하여 슬라이드 크레 실 바이올렛 염색 섹션.
참고 :이 옵션 단계는 크레 실 바이올렛 신경 세포 핵을 염색하기 위해, 동결 된 적이 섹션을 위해 사용될 수있다. 우리는 지우고 크레 실 바이올렛 부화하기 전에 섹션을 재수하는 경우에도 염색 및 섹션에서 저 배경에 이르게 것으로 나타났습니다.- 5 분 동안 에이전트를 삭제에 놓는다. 한 번 반복합니다.
- 5 분 동안 100 % 에탄올에 놓는다. 한 번 반복합니다.
- 물에이어서, 물에 95 % 에탄올 75 % 에탄올을 배치하고, 2 분마다 물에이어서 50 % 에탄올.
- 5 분 동안 물에 놓는다.
- 0.5 %에서 발생 CRE (/ V w)7 분 동안 물 SYL 보라.
- 2 분 동안 물에 놓는다. 한 번 반복합니다.
- 나타낸 바와 같이, 코 플린 염색 단지에 배치하여 슬라이드 부 탈수.
- 물 다음, 물 50 % 에탄올 75 % 에탄올을 배치하고, 2 분마다 수중 후 95 % 에탄올.
- 5 분 동안 100 % 에탄올에 놓는다. 한 번 반복합니다.
- 5 분 동안 에이전트를 삭제에 놓는다. 한 번 반복합니다.
참고 :이 탈수 및 청소 시간이 원고에 설명 된대로 마우스의 뇌를 처리하기에 충분합니다. 그러나, 우리는 최종 청산 단계는 15 분 총까지 연장해야 할 수도, 쥐 cowbird을 포함한 다른 종에서 관찰했다.
- 무수 장착 매체를 이용하여 커버 슬립 구간.
- 슬라이드는 적어도 5 일 동안 실온에서 어두운 곳에서 수평으로 건조 할 수있다.
두꺼운 뇌 섹션 내에서 2 이미징 스테인드 뉴런
- 이미지 스택을 캡처
- 현미경 전구, 카메라, 무대 컨트롤러를 켭니다.
- 현미경 소프트웨어 (예를 들어, Neurolucida)를 엽니 다.
- 현미경 무대에 슬라이드를 놓습니다.
- 예컨대 1.25 0.4 NA PlanAPO 또는 4X 0.16 NA로 저배율 대물 렌즈를 이용하여 뇌 단면의 2D 시야각 이미지를 캡처
- 이미지 초점 및 노출 시간 및 화이트 밸런스를 포함한 카메라 설정을 조정합니다.
- 섹션의 아무 곳이나 왼쪽 버튼으로 클릭하여 기준점 만들기
- 이미지 획득 창에서 "하나의 이미지를 획득"을 선택하여 이미지를 캡처합니다.
- 10 배 NA 0.3 UPlan FL N 목적을 사용하여 관심의 뉴런 (들)를 함유하는 영역의 중간 해상도 이미지를 캡처 스택.
- 이미지를 초점과 노출, 화이트 밸런스를 포함한 카메라 설정을 조정합니다.
- 섹션 A의 정상에 초점을 맞춤으로써 이미지 스택의 상단 및 하단 경계를 설정ND 선택 화상 획득 창에서 "스택 상단 '옆 다음 섹션의 바닥에 집중하고, 화상 획득 윈도우 내에 다음에"바닥 스택 ","설정 "을 선택"설정 ".
- 화상 획득 창에서 "이미지 사이의 거리를"다음 "5 μm의"을 입력하여 5 ㎛ 인 스텝 거리를 설정한다.
- 화상 획득 창에서 "이미지 획득 스택"을 선택하여 이미지 캡처 스택.
- 모든 이미지 스택은 X 축과 Y 축에 10 % 이상 겹치는 것을 확인하고, 관심의 전체 영역을 캡처하려면 위의 단계를 반복합니다.
- 30 배 NA 1.05 실리콘 오일 액침 대물를 사용 관심 뉴런을 포함하는 영역의 높은 해상도 이미지를 캡처 스택.
- 대물과 OI과 접촉하도록 보장 슬라이드 침지 실리콘 오일 4 방울 슬라이드 위에 대물 배치 - 3 적용엘.
- 이미지를 초점과 노출, 화이트 밸런스를 포함한 카메라 설정을 조정합니다.
- 섹션 상단에 포커싱 "설정"을 선택하여 이미지 스택 상위 및 하위 경계를 설정 다음 다음 이미지 획득 창에서, 및 "스택의 상단"부분의 바닥에 집중하고 선택하는 「설정」 이미지 획득 창에서 "스택의 하단에"옆에.
- 화상 획득 창에서 "이미지 사이의 거리를"다음에 "1 ㎛"을 입력하여 1 ㎛의 단계의 거리를 설정한다.
- 화상 획득 창에서 "이미지 획득 스택"을 선택하여 이미지 캡처 스택.
- 모든 이미지 스택은 X 축과 Y 축에 10 % 이상 겹치는 것을 확인하고, 관심의 전체 영역을 캡처하려면 위의 단계를 반복합니다.
- 데이터 파일을 저장하고 외부 처리를 위해 TIFF 형식의 모든 이미지 파일을 저장합니다.
- ImageJ에있는 Z-투사 이미지 만들기
- 바이오 형식 플러그인이 설치되어 열기 ImageJ에 소프트웨어.
- "플러그인"을 선택 -> "바이오 형식"-> "바이오 형식 가져 오기".
- 이미지 스택 파일을 선택 열 수 있습니다.
- > "유형"- -> "RGB 색상"파일이 열리면, "이미지"를 선택하여 RGB의 형식을 변경합니다.
- "이미지"를 선택하여 Z 프로젝션 만들기 -> "스택"-> "Z 프로젝트 ...".
- TIFF 파일로 두 개의 차원 Z 프로젝션 이미지를 저장합니다.
- 관심의 전체 영역의 2 차원 이미지의 몽타주를 작성합니다.
- (예를 들어, 어도비 포토샵) 소프트웨어를 엽니 다.
- "파일"을 선택 -> "자동화"-> "진 Photomerge를".
- 선택 "찾아보기"및 모든 IMAG을 추가ES 파일을 병합 할 수 있습니다.
- "함께 이미지를 혼합"을 선택하고 "확인"을 선택해야합니다.
- TIFF 파일로 관심의 전체 영역의 결과 몽타주 이미지를 저장합니다.
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Representative Results
500 μm의 두께 뇌 구역 -이 골지체 콕스 - 염색 프로토콜과 두 바와 선택적 변이체 (400) 내의 개별 뉴런을 시각화하는데 이용 될 수있다. 10 배의 대물 렌즈와 Z 축에서 5 ㎛의 단계를 사용하여 캡처 이차원 Z-돌기 대표 화상 몽타주는도 1에 도시된다 : A1 - 전방 피질 영역 (1)과를 포함하는 코로나 뇌 부분의 넓은 영역에 대한 C1 이차 운동 피질 (18). 섹션 500 μm의 절단했다. 도 1B1의 부분의 표면을 따라 피질 pial 레이어 1 본 크레 실 바이올렛 염색 프로토콜을 포함하는 변형, 예를 들어 피질 세포층의 식별이 가능합니다. 모든 신선한 조직 (그림 1A1)과 프로토콜의 변형을 사용하여 주요 프로토콜을 사용하는 경우도 스테인드 섹션의 유사한 모양을 참고하는뇌는 장기 저장 (그림 1C1)을위한 과정에서 부분적으로 동결된다.
고해상도 30X 1.05 NA 실리콘 오일 침지 목적의 사용은 따라서 주어진 화상을 적은 전체 스택을 요하는 X 커진 및 Y는 더 높은 배율의 대물 렌즈를 사용하여 캡처 비해 축 상 스택의 포착을 허용 관심 분야. 사용되는 특정 목적은 화상 두꺼운 뇌 섹션보다 충분 800 μm의 작동 거리를 가진다. 이차원 Z-돌기 이미지 몽타주는 전방 피질 영역 (1)의 내부에도 1 (A2-C2)에 도시되는 이러한 목적 및 Z 축에서 1 μm의 단계를 사용하여 캡쳐하고 트레이싱의 이차원 Z-돌기위한 C3 - A3 : 표시 뉴런은도 1에 도시된다. 스루 높은 해상도 뉴런의 시각화를 허용 이미지와 자신의 수상 돌기를 참고각 이미지 스택의 깊이. 크레 실 바이올렛를 사용하여 프로토콜의 변형은 파라미터가이 세포의 염색은 슬라이스의 상단 관찰 고용 그러나 함께, 슬라이스에 걸쳐 보라색 Nissl 염색을 추가합니다. 선택적 동결 단계를 포함하는 프로토콜 변형 그러나 그것은 또한 슬라이스의 표면 아래로 광을 회절에 의한 헤이즈의 모양을 생성하는 확산 배경 염색 도입 기본 프로토콜과 유사한 신경 세포 염색을 생성한다. 이 헤이즈 슬라이스로 촬상 깊이 때 가장 분명한도 1C2에 Z-투사 화상에서 명백하다. 30X 대물 렌즈를 이용하여 촬영 된 이미지들은 시각화 및 미세 돌기 쪽의 연결 구조를 정량화하는데 사용될 수있다. 단일 평면의 이미지 부분의 상단에 촬영 한 영상과 부 하단에서 촬영 한 화상과, 기본 프로토콜의 두 가지 변종을 사용하여 염색 수지상위한도 2에 도시되어있다. purpl 참고도 2B2의 부 하단으로서 확산 보라색 배경 / 산란광을 보이는도 2B1에 단면의 상단 개별 핵 내의 신경 Nissl 물질의 전자 크레 실 바이올렛 염색. 참고 또한 덴 드라이트 및 그 쪽이 동결 단계,도 2C2의 슬라이스 하단 명백한 더 어렵게 간의 대비를 제한하여 척추를 시각화 할 수 앞서 언급 한 배경 연무와 프로토콜을 사용하여 잘 염색되지만 그들과 인접한 배경. 높은 배율의 목표는 그림 2에서 쇼로, 돌기 척추의 형태를 특징 짓는 데에 이용 될 수있다 : A3 - C3 종류의 서로 다른의 쪽은 세 개의 각 프로토콜을 사용하여 스테인드 섹션에서 명확하게 볼 수있는 곳. 여기서, NA 1.42 60X 오일 액침 대물 사용 하였다. 우리는 또한 hippoc 내에서 신경 세포를 염색이 염색 프로토콜과 그 변종을 고용섹션 ampus 400 μm의 절단. 상기 섹션의 더 측방 영역 (예 : -도 3에 도시 된 바와 같이, 신경 세포 수지상과 등뼈는 섹션의 더 - 중간 영역 (C2 A2 예,도 3의 해마 치아 이랑 영역)를 향해 동시에 가시화 될 수있다 도 3에서 해마 CA3 영역 : A3 - C3). 또한, 각각의 염색 상태가 대뇌 피질도 1 및 2에 도시 된 것과 유사한 결과 장단점을 생성하는 것이 주목되어야한다.
뇌 처리 섹션의 최종 두께는 사용 된 특정 프로토콜 변형에 의존한다. 대뇌 피질을 포함하는 부분에 대해도 4a에 도시 500 μm의 절단으로 0.000 <도 가공의 측정 두께 프로토콜 변형의 중요한 효과이고 / coverslipped 부 (일방향 ANOVA, P 마운트1). 여기서, 섹션의 두께 ((N = 6) 251.0 ± 12.5 (SEM) μm의) 및 크레 실 바이올렛 관련된 프로토콜 변이체 ((N = 6) 219.3 ± 8.5 μm의) 부분의 두께보다도 작았 기본 프로토콜을 사용하여 제조 동결 단계 (340.6 ± 17.1 μm의 (N = 6)) (페로 니 사후 시험 0.0006 ≤ 각 비교 P)를 포함하는 프로토콜의 변형을 사용 하였다. 프로토콜 변형 매우 유사한 효과 해마를 포함한 단면 관찰 및 400 ㎛의 (도 4B, 일방향 ANOVA, p <0.0001)으로 절단 하였다. 여기서, 부분의 두께는 기본 프로토콜을 사용했다 (217.6 ± 19.2 μm의 (N = 6))과, 상기 프로토콜 변형 포함 크레 실 바이올렛 (198.0가 ± 14.8 μm의 (N = 6)) 부분의 두께보다도 작았 다 사용하여 제조 동결 단계 (313.5 ± 8.4 μm의 (N = 6)) (페로 니 사후 시험 0.001 ≤ 각 비교 P)를 포함하는 프로토콜의 변형.
도 1 앞쪽에 cingulate 영역에서 스테인드 뉴런의 예시 현미경 사진 (1) A1 - C1, 10 배 대물 렌즈를 사용하여 획득 된 화상 스택 병합 Z-돌기 전방 피질 영역 (1)과 2 차 코일을 갖는다 대뇌 피질의 한 반구 나타낸다 운동 피질 정수리 약 1.18 mm (18). 이 섹션은 500 μm의 절단했다. 현미경 사진 크레 실 바이올렛 염색 (B1)와 신선한 프로토콜 변형과 뇌는 골지체-콕스 함침 (C1) 아래 고정되는 프로토콜 변이체 메인 모든 새로운 프로토콜 (A1)를 사용하여 나타내었다. 스케일 바는 500 μm의 수 있습니다. 적색 제곱으로 나타낸 각 영역 C2 - 고해상도 Z는 프로젝션 이미지 A2에 도시되는 30X 실리콘 오일 액침 대물 렌즈를 사용하여 획득 된 스택을 병합A1의 현미경 사진에 uare - C1. 스케일 바는 100 μm의 수 있습니다. 신경 트레이싱 차원의 Z-돌기 A3에 나타낸다 - C2 - A2의 현미경 사진에서 붉은 화살표로 표시된 뉴런 C3한다. 모든 수상 돌기의 직경은 설명의 편의를 위해 2 μm의 설정했다. 스케일 바는 100 μm의 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 스테인드 뉴런 돌기 쪽의 예시 현미경 사진. 30 배 실리콘 오일 액침 대물를 사용하여 캡처 현미경 사진이 섹션은 500 μm의 절단 된 전방 피질 영역 (1)의 제 1 층 내에 위치 신경 수지상 하나 개 초점면에 나타낸다. 뉴런은 F를 사용하여 염색 하였다 resh 프로토콜 (A1, A2), 크레 실 바이올렛 염색 (B1, B2)과 뇌는 골지체 콕스 - 함침 (C1, C2) 다음 동결되는 프로토콜에 대한 변형으로, 상기 프로토콜 변이체. 현미경 사진은 슬라이스의 상단 찍은 (A1 - C1) 및 다음 현미경 슬라이드 슬라이스 하단 (A2 - C2). A1-2, B1-2 및 C1-2에 대한 스케일 바는 50 μm의 수 있습니다. 현미경 사진은 다른 척추 유형을 식별하기 위해, A3, 높은 배율 60X 오일 액침 대물를 사용하여 하나 개의 초점 평면 B3 및 C3에 나타낸다. A3, B3 및 C3에 대한 스케일 바 ~ 10㎛이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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도 3 해마 뉴런 스테인드 예시 현미경 사진. C1 (a 4X 목적을 사용하여 캡처 현미경 사진은 새로운 프로토콜 (A1), 크레 실 바이올렛 염색 (B1)와 상기 프로토콜의 변형을 이용하여 염색 뉴런 하나 개의 초점면에 도시되어 있으며, 상기 프로토콜 변이체되는 뇌 골지 - 콕스 함침 다음 동결 ). 섹션 400 μm의 절단 된 약 정수리 -2.18 mm 18에 도시된다. 스케일 바는 500 ㎛의 A1있다 - C1. 고배율 현미경이 30X 실리콘 오일 침지 목표로 촬영하고, 해마의 치아 이랑 (dentate gyrus)의 영역 내에 위치 수지상 뉴런 하나 개 초점면에 나타낸다 (A2 - C2) 및 해마의 CA3 영역 (A3 - C3). 스케일 바는 A2 50 μm의 아르 - C2및 A3 - C3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
장착 섹션 4. 두께 그림. 장착 부분의 측정 된 두께는 대략 대뇌 피질 정수리 1.18 mm (18)를 포함하는 부분에 대한에 도시 500 개 ㎛의 두께로 절단하고, 약 해마 정수리 -2.18 mm (18)를 포함하는 섹션의 B에서 400 μm의 절단 할 두께. 측정 섹션은 새로운 프로토콜, 크레 실 바이올렛 염색 프로토콜 변형, 또는 뇌는 골지 - 콕스 함침 다음 동결되는 프로토콜의 변형을 사용하여 염색 하였다. 모두 뇌 영역의 경우, 처리 프로토콜의 큰 영향이 있었다(일방향 ANOVA, p <0.0001) 프로토콜을 통해 냉동 가공 방법이었다 뇌로부터 부분 냉동되지 않은 것보다 상당히 두꺼운 어디 (페로 니 사후 시험 모두 p <0.001). 데이터는 각 그룹의 여섯 개 섹션의 평균 ± SEM으로서 도시되고, 다른 문자 데이터 세트는 큰 차이를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 두께 뇌 부분에서 신경을 시각화 여기 골지 - 콕스 염색 프로토콜이 유용한 변종과 함께 설명합니다. 대표 결과에 나타낸 바와 같이, 긴 800 μm의 작동 거리가있는 고해상도 목적의 사용은 500 μm의 절단 뇌 부분의 깊이에 걸쳐 전체 뉴런의 신뢰성 시각화 수 있습니다. 비교적 두꺼운 뇌 섹션의이 연구는 모든 유형의 스테인드 신경 세포가 완전히 길고 복잡한 꼭대기 수지상 나무와 피라미드 뉴런에 특히 중요하다 슬라이스에 포함되는 확률을 증가시킨다. 예를 들어, 설치류 뇌의 관상 부에, 이는 입쪽 또는 꼬리 방향으로 멀리 연장 뉴런의 포함을 가능하게하고, 절편 단계 정면 뇌 차단시에도 오차 자유도를 증가시킨다. 우리는,이 프로토콜은 다른 PL에 절편을 위해 적용 할 수있는 관상면에서 절편의 뇌를 설명하지만필요에 따라 anes 완전히 하나의 섹션 내에서 신경 세포를 표지 포함합니다. 고용 단면의 평면은 조사중인 신경 세포 인구의 형태 학적 특성에 따라 달라집니다. 돌기 쪽이 시각과 높은 배율의 대물 렌즈가 척추 입력 / 그림 2의 현미경 사진을 생성하는데 사용 된 60X 오일 액침 대물 같은 형태 평가해야하지만,이 프로토콜을 이용하여 정량화 될 수있다 : A3 - C3한다. 이 두꺼운 부분에서 이용 될 수 있지만 목적의 작동 거리 내에 슬라이스의 선두에 제한된다. 우리는 여분의 비특이적 염색 또는 배경으로 이어지는없이 표준 25 일 함침 기간이 완전히 마우스, 쥐 cowbird 뇌 전체에 신경을 얼룩 것을 발견으로이 프로토콜은 또한 유사한 뇌 크기의 다른 종에 사용하기 위해 적용 할 수 있습니다 그 한 달 이상 함침 기간 발생할 수 있습니다. 짧은 함침 기간이 s의 종 충분할 수있다말러 뇌 또는 개별 연구자에 의해 최적화 될 수있는 상기 언급 한 종으로부터 뇌 해부를 샘플한다.
이 얼룩 프로토콜 제시 한 세 가지 변종 중, 대조되지 않은 신선한 뇌 샘플을 사용하여 주요 프로토콜은 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 도 2의 현미경 사진이 기본 프로토콜 쉽게 상단과 탑재 두꺼운 부분의 아래쪽에 잘 볼 수 표지 수지상과 등뼈를 생성 함을 입증. 크레 실 바이올렛 Counterstain과를 추가하면 뇌 영역과 대뇌 피질 층의 정의를 용이하게하는 장점을 가지고 있지만, 두꺼운 부분으로 깊은 시각화하는 경우에도 확산 보라색 배경을 추가했습니다. 이 프로토콜의 변형 만 얼룩 때문에, 크레 실 바이올렛, 수지상 그들의 등뼈 장착 두꺼운 부분의 표면 부분의 저부 (도 2 B) 근처 명확하게 볼이었다. 이것은 또한 PRODU 보인다이전에 더 얇은 부분 19, 20, 21를 사용하는 경우에도,보고에 도시보다 두꺼운 부분의 표면 근방 Nissl 염색 선명한 패턴 CE. 동결 단계를 포함하는 프로토콜 변형 수지상 트리 형태의 분석을위한 수용 가능한 결과를 산출한다. 그러나, 배경 얼룩이 더욱 어렵게 시각화 수지상 쪽 (도 2 C)를 정량화하기 따라서 슬라이스로 촬상 깊이 때 가장 두드러 신선한 조직에서보다 훨씬 더 어둡다. 우리는 냉동되었던 뇌에서 섹션의 크레 실 바이올렛 Counterstain과 시도,이 그것이 매우 어려운 섹션의 하단 쪽을 시각화하고 정량화하기 위해 만든 짝수 어두운 보라색 배경 안개를 생성 (데이터가 표시되지 않음). 골지 - 콕스 수태하기 전에 마우스의 뇌를 동결 포함 평가했다 또 다른 실패 프로토콜 변형ATION. 이되어있을 수 신경교 세포 개체의 염색 결과이지만 뉴런 어떤 종류의 얼룩하지 않았다 (데이터 미기재).
성공적인 결과를 얻기위한 내용이 프로토콜에서 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 이 온도, 습도에 매우 의존적이기 때문에 (1)는, 각각의 실험실 내의 부분의 건조 시간을 확인하는 것이 중요하다. 건조 시간이 너무 짧은 경우, 섹션은 탈수 과정에서 슬라이드 떨어져 떨어질 것이다; 건조 시간이 너무 긴 경우, 섹션은 균열 것입니다. 이것은 심지어 같은 실험실과 계절에 따라 다를 수 있기 때문에 연구 조사를 예비 성형 직전에 "테스트"뇌의 세트로 건조 시간을 확인하는 것이 유리하다. (2) 모든 초과 한천은 탈수 단계 전에 섹션과 현미경 슬라이드에서 제거해야합니다. 이렇게하지 않으면, 한천은 변형되고 슬라이드 떨어져 섹션을 풀 수 있습니다.
조직 학적 또 다른 중요한 요소생물학적 시료의 분석 등의 조직 수축이다. 우리는 처리 후, 탈수 및 최종 섹션 두께 일본어 절단 값의 약 절반으로 감소 하였다 메인 골지 - 콕스 프로토콜 (도 4)을 이용하여 뇌 섹션 coverslipping 장착하였습니다. 또한 동결 단계를 포함하는 프로토콜의 변형을 이용하여 처리 섹션 메인 프로토콜 (도 4)를 통하여 처리 된 신선한 부분보다 상당히 두꺼운 하였다 참고. 두 프로토콜이 같은 cryoprotection 및 처리 단계를 포함하고, 단지 뇌의 실제 동결에 의해 차이가 있기 때문에 재미 있고 예상치 못한 양이었다. 따라서 서로 다른 연구 또는 다른 실험실에서 골지 - 콕스 염색을 사용하여 생성 된 신경 세포의 형태의 데이터를 비교할 때 프로토콜의 잠재적 인 차이를 고려하는 것이 중요합니다. 우리는 문학의 마지막 부분 두께에 대한 데이터를 찾을 수 없습니다했지만, 그것은 도움이 될 것입니다신경 세포 형태의 대책을보고 할 때 연구자들은 조직의 수축 및 / 또는 정확한 데이터를보고하기 위해. 또한, 500 ㎛의 절단 부분에 대한> 200 ㎛의 최종 막 두께는 가장 높은 배율의 대물 렌즈의 작동 거리보다 클지라도, 이는 실험실에서 사용 30X 대물 렌즈의 작동 거리 내에도 여전히 있음을 주목해야한다. 덴 드라이트 및 등뼈 메인 골지 - 콕스 프로토콜을 이용하여 이들 분할 영역의 하단 분명히 볼 수 있기 때문에, 행 및 1mm의 범위를 포함한 더 큰 두께로 절단 섹션 내에 포함 된 신경 세포를 시각화시킬 수있다.
이 프로토콜은 하나의 섹션 내에서 긴 돌기 아버를 추적하는 기능을 포함하여 많은 장점을 제공하지만, 옵션이 슬라이스 함침 두뇌의 처리, 그리고 더 나은 뇌 구조를 식별하는 데 크레 실 바이올렛으로 대조하는 옵션을 지연, 몇 가지 단점이있다 그 할까요고려. 25 일간의 잠복기는 일부 연구자 너무 긴 고려 될 수있다. 깊은 장착 섹션으로 이미지 능력은 상대적으로 비싼 긴 작동 거리와 고해상도 침수 목표에 액세스 할 수에 따라 달라집니다. 또한, 고해상도의 미세 구조를 시각화 할 수있는 기능이 탑재 슬라이스의 아래쪽에 하나 개의 이미지로 감소한다. 이 프로토콜의 구현 때문에 공부하는 뉴런과 뇌 영역의 형태 학적 특성에 의존하며, 연구자가 사용할 수있는 장비. 우리는 이전과 같은 뇌와 관심의 영역의 크기에 대한 골지 - 콕스 함침 시간 등의 조사 연구를 실행하는 프로토콜 변수를 최적화 할 수있는 "테스트"샘플의 사용,에 돌기 아버에 대한 절편의 평면 및 두께를 추천합니다 시각화.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 자연 과학 및 캐나다 (NSERC)의 공학 연구 협의회, 혁신에 대한 캐나다 재단 (CFI 프로젝트 번호 30381)에서 CDCB에 존 R. 에반스 지도자 기금 연구 인프라 보조금, 그리고에 의해에서 CDCB에 발견 그랜트에 의해 지원되었다 NSERC에서 NJM에 발견 그랜트. ELL는 온타리오 대학원 장학금에 의해 구 엘프 대학의 온타리오 수의과 대학에서 OVC 장학금에 의해 지원되었다. CDS는 NSERC에서 학부 학생 연구 조교에 의해 지원되었다. ALM은 NSERC에서 알렉산더 그레이엄 벨 (Alexander Graham Bell) 장학금에 의해 구 엘프 대학의 온타리오 수의과 대학에서 OVC 장학금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| potassium dichromate | Fisher Scientific | P188-100 | Hazardous |
| potassium chromate | Fisher Scientific | P220-100 | Hazardous |
| mercuric chloride | Fisher Scientific | S25423 | Hazardous |
| Whatman grade 1 filter paper | Fisher Scientific | 1001-185 | |
| isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | CP0406V2 | |
| 20 mL scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| sucrose | Bioshop Canada | SUC700.1 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S5011-500G | |
| sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9390-500G | |
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| isopentane | Fisher Scientific | AC126470010 | Also known as 2-methylbutane; hazardous |
| agar | Sigma Aldrich | A1296-100G | |
| small weigh dish | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 6-well tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1b | |
| mesh bottom tissue culture inserts | Fisher Scientific | 07-200-214 | |
| paraformadelhyde (PFA), 16% | Electron Microscope Sciences | 15710-S | Hazardous |
| ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | Hazardous |
| Kodak Fixative A | Sigma Aldrich | P7542 | |
| superfrost plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| CitroSolv clearing agent | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| anhydrous ethyl alcohol | Commercial Alcohols | N/A | |
| cresyl violet | Sigma Aldrich | C1791 | |
| permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| upright microscope | Olympus | BX53 model | |
| colour camera, 12 bit | MBF Biosciences | DV-47d | QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12 |
| 3D motorized microscope stage, controller and enoders | MBF Biosciences | N/A | Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences |
| 4X microscope objective | Olympus | 4x 0.16 N.A. UplanSApo | |
| 10X microscope objective | Olympus | 10x 0.3 N.A. UPlan FL N | |
| 30X microscope objective | Olympus | 30x 1.05 N.A. UPlanSApo | |
| 60X microscope objective | Olympus | 60x 1.42 N.A. PlanAPO N | |
| silicone immersion oil | Olympus | Z-81114 | |
| Neurolucida software | MBF Biosciences | Version 10 | |
| ImageJ software | U. S. National Institutes of Health | Current version | With the OME Bio-Formats plugin installed |
| Photoshop software | Adobe | version CS6 |
References
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