Summary
Biz bir doku örnekleri içinde bulunan uzun dendritik ağaçlar nöronlar görselleştirmek amacıyla, kalın beyin bölümlerinde, Golgi-Cox boyama yöntemi kullanılarak bir protokol mevcut. Bu protokolün iki varyantları da cresyl menekşe karşıtboyama ve uzun süreli depolama için işlenmemiş beyinleri dondurulmasını içerdiğini sunulmaktadır.
Abstract
nöron boyama Golgi-Cox yöntemi histolojik beyin numuneleri içinde nöron morfolojisi anlayışımızı ilerletmek için fazla iki yüz yıldan kullanılmıştır. tam olarak tek bir bölüm içinde bulunan lekeli nöronların tanımlama olasılığını arttırmak amacıyla, mümkün olan en büyük kalınlıkta beyin kesitler hazırlamak için pratik bir bakış açısından tercih edilir olsa da, bu yaklaşım, yüksek çalışma mesafesi ile teknik açıdan sınırlıdır -magnification mikroskop amaçları. Burada 500 um kalınlığında kesilir fare beyin bölümlerinde, Golgi-Cox yöntemiyle nöronlar leke ve yüksek çözünürlüklü 30X 1.05 NA silikon ile donatılmış dik bir mikroskop kullanarak bu bölümlerin derinliği boyunca nöronlar görselleştirmek için bir protokol rapor 800 um çalışma mesafesine sahip yağ daldırma objektif. Ayrıca yüzeyini counterstain için kullanılabilir bu protokolün iki faydalı varyantları raporkresil violet Nissl leke beyin bölümleri monte edilebilir veya önceden kesit ve son işlem uzun süreli depolama için bütün beyin dondurma. Ana protokolü ve iki varyantları, tam nöron dendritik ağaçları ve dendrit dikenleri güvenilir görüntülenmiştir ve sayısal edilebilen boyunca lekeli kalın beyin bölümleri üretir.
Introduction
Doku örnekleri içindeki tek tek nöronların görselleştirme beynin anlaşılmasını önemli ölçüde ve endojen hastalık veya eksojen çevresel faktörlerden etkilenebilir nasıl nöron morfolojik özelliklerinin yerinde analizi için izin verir. Golgi Cox boyama yöntemi beyin içindeki nöronların rasgele örnek boyama bir düşük maliyetli, nispeten basit bir yöntemdir. İlk 1800'lerde Golgi 1 tarafından geliştirilen ve Cox 2 modifiye araştırmacılar ayrıca, görselleştirmek ve dendritik bitkilerin morfolojik ve omurga yoğunluğu 3, 4, hem ölçmek için kullanılabilecek net, iyi boyanmış nöronlar üretmek için yılda bu tekniği rafine 5, 6, 7, 8, 9.
beyin bölümlerinde boyanan nöronların görüntülenmesi için önemli bir teknik göz mevcut olan, yüksek büyütme / yüksek çözünürlüklü mikroskop hedeflerin çalışma mesafesi ile sınırlıdır, maksimum kesit kalınlığı vardır. 60 ortak yağ daldırma amaçlar - 100X mükemmel çözünürlük temin aralığı, fakat tipik olarak 200 um daha büyük olan çalışma mesafesi ile sınırlıdır. 200 um aralığında kesilmiş beyin kesitleri serebral korteks 10, CA1 bölgesindeki 11, 12, piramidal nöronlar sığ tabakalarda, örneğin piramit nöronlar için bu dilim kalınlığı içinde ihtiva edilebilir bazı nöron türleri, görselleştirmek için yeterli olabilir hipokampus 15 dentat girus hipokampus 13, 14, ve granül hücreleri. Nispeten uzun olan NöronlarBu tür beyinler bütün dendrit ağaç içeren bir mükemmel bir açıyla kesitli olması gerekir, çünkü hücre gövdesi 16 'den fazla 800 um uzanabilir fare için, daha büyük bir meydan okuma sağlayan serebral korteksin derin katmanlannda içinde piramidal nöronlar gibi dendritik ağaçlar, 200 um dilimleri içinde. dendrit ya da dallarından herhangi rostral veya kaudal yönde uzanan, bu da mümkün olmayabilir. Birden çok bitişik beyin bölümleri arasında bir nöron takip ederek bu sınırlamayı ele almak mümkün olsa da, bu yaklaşım 17 izleme için doğru bölümlerini ayarlamak önemli bir teknik sorun tanıtır. Daha pratik bir yaklaşım, daha büyük bir kalınlıkta kesilir beyin kesitleri içinde bulunan tüm nöronlar görselleştirmek için olacaktır.
Golgi Cox yöntemi kullanılarak farelerin 500 um kalınlığında beyin bölümleri ve bunların mo görselleştirmek için - Burada 400 içindeki nöronlar leke bir teknik raporrphology 800 um çalışma mesafesine sahip bir yüksek çözünürlüklü silikon yağ daldırma objektif kullanarak. Bizim tarif Golgi Cox emdirme ve işleme protokol literatürde 6'da en çok atıf modern protokoller birinden modifiye edilir. Kalın beyin kesitleri ile Yaklaşımımız tam bölüm içinde yer alan herhangi bir tipte nöronları belirlenmesi ihtimalini arttırmaya yönelik bir avantaj sağlar. Ana protokole ek olarak, aynı zamanda eşsiz yararlar sağlar, bu iki varyasyon: sırayla monte kesitlerin yüzeyi üzerinde kresil menekşe karşıt (1) Golgi Cox boyama beyin bölgelerinin sınırları tayin ve tabakalarını tanımlamak için kesit ve son işlem öncesi emdirilmiş tüm beyinlerinden uzun süreli depolama için bir ara dondurma adımı ile serebral korteks, ve (2) Golgi Cox boyama.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yetişkin dişi CD1-türü fare Bu çalışmada kullanıldı. Benzer boyama çeşitli yaşlarda her iki cinsiyeti kullanılarak gerçekleştirilebilir. Deney hayvanları ilke ve Hayvan Bakımı Kanada Konseyi kurallarına uygun olarak bakıldı ve deneysel protokol Guelph Hayvan Bakım Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Golgi Cox Boyama
- Beyinlerin Golgi-Cox Emprenye
- ayrı ayrı, yüksek kaliteli su içine potasyum dikromat ve potasyum kromat eritilerek% 1 Golgi-Cox çözeltisi (ağırlık / hacim) potasyum dikromat,% 0.8 (ağırlık / hacim) potasyum kromat ve% 1 (ağırlık / hacim) cıva klorür yapmak . Çözeltiler karıştırın cıva klorür ekleyin ve sınıf 1 filtre kağıdı kullanılarak nihai çözelti filtre. en fazla bir ay süreyle karanlıkta çözüm saklayın.
- % 5 izofluran kullanılarak fare anestezisi.
- kafaları kesilmek suretiyle fare Euthanize ve hızlı bir şekilde beyin kaldırmak.
- Golgi Cox çözeltisi 17 mL içeren 20 mL'lik bir cam sintilasyon şişesi içine beyin yerleştirin ve 25 gün süreyle oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edilir.
- 24 saat boyunca 4 ° C'de karanlıkta (0.1 M fosfat tampon maddesi, pH 7.4 içinde / hacim) sukroz (% 30) sükroz, dondurarak saklama 40 mL içeren 50 ml konik bir tüp içine yerleştirerek beyin cryoprotect.
NOT: Aşağıdaki isteğe bağlı üç adım, uzun süreli depolama için bu aşamada beyin dondurmak amacıyla, ana protokol için bir alternatif olarak kullanılabilir. - kuru buz üzerinde soğutulmuş olan 200 ml izopentan içine daldırarak tüm beyin dondurun.
- -80 ° C'de karanlıkta, 50 ml konik bir tüp ve deposuna dondurulmuş beyin yerleştirin.
- Hazır devam etmek için zaman, 24 saat boyunca 4 ° C'de karanlıkta sükroz dondurarak saklama koruyucusunun 40 mL içeren 50 ml konik bir tüp içine yerleştirerek beyin Çözülme.
- Beyin Kesit
- sükroz ve bloktan beyin çıkarınBir ustura kullanılarak beyincik keserek ve beynin kalan kuyruk ucunda düz bir kenar bırakarak kesit için k.
- Isı agar (% 3 (w / v) su içinde) eritilmiş ve erime noktasının biraz üzerinde olduğu kadar soğuması kadar.
- onun kaudal ucu aşağı bakacak şekilde, küçük bir tek kullanımlık tartmak çanak içinde beyin yerleştirin ve beyin kapsayacak şekilde erimiş agar yeterli miktarda ekleyin.
- Agar katılaşmasından sonra, yaklaşık 2 ayrılan fazla agar Döşeme - beyni çevreleyen, 4 mm ve etil siyanoakrilat yapıştırıcı bir miktar kullanarak kuyruk tarafındaki ucu aşağı bakacak şekilde, bir vibratome aşamasına beyin tutkal.
- 400 bir dilim kalınlığında beyin ve bölüm beyin kapsayacak şekilde sükroz dondurarak saklama koruyucusunun yeterli bir miktarı ile vibratome sahne alanı doldurmak - 86 Hz'lik bir titreşim frekansı kullanılarak (incelenecek olan beyin bölgesine bağlı olarak) 500 um ve 0,125 mm / s bir bıçak ilerleme hızı.
- küçük bir boya fırçası kullanarak, Ticari olarak temin edilebilen ağ alt uçlar ihtiva eden bir 6-yuvalı doku kültür plakasının bir kuyuya yer beyin kesitleri önceden doldurulmuş 6 10 mL% 0.1 M fosfat tamponu, pH 7.4 (w / v) sakaroz ile.
- 4 ° de CO / N karanlıkta bölümleri inkübe edin.
- Beyin Bölümler Gelişmekte
- ağ-alt uçlar kullanılarak, 0.1 M fosfat tamponu, pH 7.4 içinde içinde% 2 5 mL paraformaldehid (w / v) (PBD) içeren yeni içine beyin bölümleri aktarın. 15 dakika süre ile karanlıkta, oda sıcaklığında yavaş bir hızda hareket eden bir rocker üzerinde inkübe edin.
- 5 mL su ihtiva eden yeni gözlere aktarılması iki kez bölümleri yıkayın. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta bir orta hızda hareket eden bir rocker yıkayın.
- % 2.7 (h / h) amonyum hidroksit, 5 ml ihtiva eden yeni bir kuyu içine aktarın bölümleri. 15 dakika süre ile karanlıkta, oda sıcaklığında yavaş bir hızda hareket eden bir rocker üzerinde inkübe edin.
- 5 mL su ihtiva eden yeni gözlere aktarılması iki kez bölümleri yıkayın. o yıkayın5 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta bir orta hızda hareket na külbütör.
- Iyi Sabitleme A'nın 5 mL içeren yeni içine aktarın bölümler orjinal satın konsantrasyona su 10x içinde seyreltilmiş olduğunu (Malzeme Tablo). 25 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta yavaş bir hızda hareket eden bir rocker üzerinde inkübe edin.
- 5 mL su ihtiva eden yeni gözlere aktarılması iki kez bölümleri yıkayın. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta bir orta hızda hareket eden bir rocker yıkayın.
- Beyin Bölümler Montaj
- Küçük bir boya fırçası kullanarak, mikroskop lamı üzerine bölümleri monte. fazla suyu çıkarın ve cımbız ve küçük bir doku kullanılarak agar. Tüm Agar dehidratasyon devam etmeden önce kaldırılmış olduğundan emin olun.
- yaklaşık 45 dakika boyunca (400 um'lik kesitler) ya da 90 dakika (500 um bölümler), oda sıcaklığında hava içinde kurumasına bölümleri izin verin.
Not: kuruyana zamanlaması ve uygun seviye kritiktir ve her tespit edilmesi gerekebilirLaboratuar ortam sıcaklığı ve nem miktarına göre değişir. Çok kısa bir kurutma süresi müteakip dehidrasyon adımları sırasında slaytların düşme bölümlere yol açar ve çok uzun bir kurutma süresi çatlama bölümlere yol açar. Bölümler hala kuruluk uygun düzeyde parlak olmasını görünecektir. - belirtildiği gibi Coplin boyama kavanoz içine slaytlar koyarak, kresil moru ile Leke bölümleri.
NOT: Bu isteğe bağlı adım kresil moru ile nöronal çekirdekleri leke amacıyla, dondurulmuş asla bölümler için kullanılabilir. Biz temizlenmesi ve kresil menekşe inkübasyon öncesi bölümler cildimizi hatta boyama ve bölümleri arasında düşük arka plan yol bulduk.- 5 dakika boyunca madde temizleme yerleştirin. bir kez tekrarlayın.
- 5 dakika boyunca% 100 etanol içinde yerleştirin. bir kez tekrarlayın.
- su içinde, daha sonra su içinde% 95 etanol içinde% 75 etanol yerleştirin ve 2 dakika her biri için daha sonra su içerisinde% 50 etanol.
- 5 dakika su içinde yerleştirin.
- % 0.5 koyun CRE (w / v)7 dakika su içinde Syl mor.
- 2 dakika için su içinde yerleştirin. bir kez tekrarlayın.
- belirtildiği gibi Coplin boyama kavanoz içine slaytlar koyarak bölümleri kurutmak.
- su içinde, daha sonra su içinde% 50 etanol içinde% 75 etanol yerleştirin ve 2 dakika her biri için daha sonra su içerisinde% 95 etanol.
- 5 dakika boyunca% 100 etanol içinde yerleştirin. bir kez tekrarlayın.
- 5 dakika boyunca madde temizleme yerleştirin. bir kez tekrarlayın.
NOT: Bu dehidratasyon ve takas süreleri Bu yazıda anlatılan şekilde fare beyinleri işlemek için yeterlidir. Bununla birlikte, son temizleme aşaması 15 dakika toplam kadar uzatılabilir gerekebilir, sıçan ve inek kuşu dahil olmak üzere diğer türler için gözlenmiştir.
- susuz bir montaj ortamı kullanılarak Lamel bölümleri.
- slaytlar en az 5 gün süreyle karanlıkta oda sıcaklığında yatay kurumaya bırakın.
Kalın Beyin Bölümler içinde 2. Görüntüleme Vitray Nöronlar
- Görüntü Yığınları yakalama
- Mikroskop ampul, kamera ve sahne kontrolörü açın.
- Mikroskop yazılımı (örneğin Neurolucida) açın.
- Mikroskop sahnede bir slayt yerleştirin.
- Bu tür 1.25x 0.4 NA PlanAPO veya 4X 0.16 NA gibi düşük büyütme objektif kullanarak beyin kesitinin bir 2D geniş açılı görüntü yakalama
- Görüntüyü odaklayın ve maruz kalma süresi ve beyaz dengesi gibi kamera ayarlarını yapın.
- bölümünde herhangi bir yerinde sol tıklayarak bir referans noktası oluştur
- görüntü elde etme penceresinde "tek görüntü elde" seçerek görüntüyü yakalama.
- 10X 0.3 NA UPlan FL, N objektif kullanılarak, ilgi konusu nöronlar (ler) i ihtiva eden alanın orta çözünürlükte görüntü yığınları çeker.
- Görüntüyü odaklayın ve maruz kalma ve beyaz dengesi gibi kamera ayarlarını yapın.
- Bölüm A üstüne odaklanarak görüntü yığını için üst ve alt sınırları ayarlamand seçerek görüntü elde etme penceresinde "yığının en üstüne" yanında, sonra da bölümün altına odaklama ve görüntü elde etme penceresi içinde yanında "alt yığının" "set" seçerek "set".
- görüntü elde etme penceresinde "görüntü arasındaki mesafeye" nın yanındaki "5 mikron" girerek 5 um adım uzaklığını ayarlayın.
- görüntü elde etme penceresinde "acquire görüntü yığınını" seçerek görüntü yığını yakalama.
- Tüm görüntü yığınları X ve Y eksenlerinde en az% 10 üst üste emin, ilgi konusu tüm alanı yakalamak için yukarıdaki adımları tekrarlayın.
- bir 30X 1.05 NA silikon yağ daldırma objektif kullanarak, ilgi konusu nöron içeren bölgenin yüksek çözünürlüklü görüntü yığınları çeker.
- objektif ve oi ile ilişki kurmak için sağlanması, sürgünün silikon immersiyon 4 damla ve slayt üzerinde amacı yer - 3 uygulal.
- Görüntüyü odaklayın ve maruz kalma ve beyaz dengesi gibi kamera ayarlarını yapın.
- bölümün üstüne odaklanan ve "set" seçerek görüntü yığını için üst ve alt sınırları ayarlayın sonraki ardından görüntü elde etme penceresi içinde ve "yığının üst" bölümünün altına odaklama ve seçmenin "set" görüntü elde etme penceresinde "yığının altında" yanında yer almaktadır.
- görüntü elde etme penceresinde "görüntü arasındaki mesafeye" nın yanındaki "1 mikron" girerek 1 um adım uzaklığını ayarlayın.
- görüntü elde etme penceresinde "acquire görüntü yığınını" seçerek görüntü yığını yakalama.
- Tüm görüntü yığınları X ve Y eksenlerinde en az% 10 üst üste emin, ilgi konusu tüm alanı yakalamak için yukarıdaki adımları tekrarlayın.
- veri dosyasını kaydedin ve dış işleme için TIFF formatında tüm resim dosyalarını kaydedin.
- ImageJ Z-projeksiyon görüntüler oluşturun
- Biyo-Biçimleri eklentisi yüklü olan Açık ImageJ yazılımı.
- "Plugins" Seç -> "Biyo-Biçimleri" -> "Biyo-Biçimleri İthalatçı".
- Görüntü yığını dosyasını seçin açılacak.
- > "Tür" - -> "RGB Renk" dosya açıldığında, "Resim" i seçerek RGB'ye biçimini değiştirmek.
- "Image" seçeneğini seçerek Z-projeksiyon oluşturma -> "Yığınlar" -> "Z Projesi ...".
- TIFF dosyası olarak iki boyutlu Z-projeksiyon görüntüsünü kaydedin.
- bütün ilgilendiren alanın iki boyutlu görüntü montaj oluşturun.
- (Örneğin, Adobe Photoshop) yazılımını açın.
- "Dosya" seçin -> "Otomatik" -> "Photomerge".
- Seç "Gözat" ve sonra tüm imag eklemekes dosyalar birleştirilecek.
- "Birlikte Görüntüleri Blend" seçilirse ve ardından "Tamam" seçeneğini emin olun.
- TIFF dosyası olarak ilgilenilen bölgenin tamamını çıkan montaj görüntüsünü kaydedin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
500 um kalınlığında beyin kesitleri - Bu Golgi Cox boyama protokolü ve iki tarif edilen isteğe bağlı varyantları 400 içindeki tek tek nöronlar görselleştirmek için kullanılabilmektedir. 10X objektif ve Z ekseninde 5 um adımlar kullanılarak çekilen iki boyutlu Z çıkıntıların Örnek görüntü montajları, Şekil 1 'de gösterilmiştir: A1 - ön singulat kortekste alanı 1 ve şunları içerir koronal beyin kesitleri büyük bir alan için C1- İkinci motor korteks 18. Bölümler 500 um kesilmiştir. Şekil 1B1 bölümlerin Pial yüzeyi boyunca kortikal Katı 1 için görüldüğü gibi kresil menekşe boyama içeren protokol varyantı, örneğin kortikal hücre katmanlarının belirlenmesine izin veren unutmayın. Tüm taze doku (Şekil 1A1) ve protokol varyantı kullanarak ana protokolü kullanarak da lekeli bölümlerinin benzer bir görünümü not hangibeyin, uzun süreli depolama (Şekil 1C1) için doğru yarı dondurulur.
yüksek çözünürlüklü 30X 1.05 NA silikon yağ daldırma objektif kullanımı, böylece, belirli bir resim için daha az toplam yığın gerektiren, X büyük olan ve Y, daha yüksek büyütmeli objektif kullanılarak çekilen daha eksenleri görüntü yığınlarının yakalanmasına imkan verir ilgi alanı. kullanılan özel amacı, görüntü kalınlığında beyin bölümlerine göre daha yeterli olan bir 800 um çalışma mesafesi vardır. Iki boyutlu Z çıkıntıların görüntü montajları ön singulat kortekste bölgesi 1, Şekil 1 '(A2-C2) gösterilmiştir, bu amaç ve Z ekseninde 1 um adımlar kullanılarak yakalandı ve trasların iki boyutlu Z çıkıntılar için C3 - A3: belirtilen nöronlar, Şekil 1 'de gösterilmiştir. aracılığıyla yüksek çözünürlüklü nöronların görünüm için izin görüntüleri ve bunların dendrit NotHer bir görüntü yığını derinliği. cresyl viyole kullanarak protokol varyant parametreleri bu hücresel boyanma sadece dilimin üstüne yakın gözlenir istihdam Ancak ile, dilim karşısında mor Nissl boyanmasını ekler. isteğe bağlı dondurma adımı içeren protokol varyantı, ancak aynı zamanda dilim yüzeyinin altında bir ışık kırıcı ile bulanıklık görünümünü oluşturan bir yaygın arka plan boyaması getirmektedir, ana protokol benzer nöron lekeleme üretir. Bu pus, dilim daha derin görüntülerken, belirli en belirgin ve Şekil 1C2 Z-projeksiyon görüntüsünde görülür. 30X objektif kullanarak çekilen fotoğraflar da görselleştirmek ve dendritik dikenler olarak ince nöronal yapılar ölçmek için kullanılabilir. Tek düzlemli görüntü bölümünün üst kısmında alınan bir görüntü ve bölümünün alt kısmına doğru çekilen bir görüntü ile, ana protokolü ve iki varyantları kullanılarak boyandı dendritler için Şekil 2 'de gösterilmiştir. purpl NotŞekil 2B2 bölümün altına yakın olarak yaygın mor arka plan / dağınık ışık görülmektedir Şekil 2B1, bölümün üst tarafında tek tek nöronal çekirdeklerin içinde Nissl maddenin e kresil moru boyama. Ayrıca, dikkat dendrit ve omurgaları soğutma aşamasında, Şekil 2C2 dilimin altına yakın belirgindir daha zor arasındaki kontrastı sınırlayarak dikenleri görselleştirmek için yapar, daha önce sözü edilen arka plan ve puslu protokolü kullanılarak, iyi boyanmış rağmen bunları bitişik bir arka plan. Daha yüksek büyütme amaçları aynı zamanda Şekil 2'de de gösterildiği üzere, dendritik omurga morfolojisi karakterize etmek için kullanılabilir: A3 - C3 tipleri, farklı omurgalar üç protokol her biri kullanılarak boyanmış bölümlerinde de açıkça görünür olduğu yere. Burada, 60X 1.42 NA yağ daldırma objektif kullanılmıştır. Ayrıca hippoc içinde nöronlar leke için bu boyama protokolü ve türevleri istihdambölümlerin Ampus 400 um kesilir. Ve bölüm daha yanal alanlarda (örneğin: - Şekil 3'te gösterildiği gibi, nöron dendritler ve omurgaları bölümünün daha medial alanlar (C2-A2 örneğin, Şekil 3'te hipokampus dentat girus bölge) doğru her iki görselleştirilebilir Şekil 3'de hipokampus CA3 bölgesi A3 - C3 alkil). Aynı zamanda, her bir boyama durumu, Şekil serebral korteks için 1 ve 2'de gösterilenlere benzer sonuçlar, avantajları ve dezavantajları ürettiği unutulmamalıdır.
işlenmiş beyin kesitlerinin son kalınlığı kullanılan spesifik protokol tipine bağlıdır. Serebral korteks içeren bölümler için, Şekil 4A'da gösterilen ve 500 um kesilmiş olarak, 0.000 <işlenip ölçülen kalınlığına protokol varyantının önemli bir etkisi olduğu ve / lamel bölümler (tek yönlü ANOVA, p monte1). Burada, bölümlerin kalınlığının ((n = 6) 251,0 ± 12,5 (SEM) um) ve kresil menekşe içeren protokol varyantı ((n = 6) 219,3 ± 8.5 um) bölümlerinin kalınlığından daha küçük olan ana protokol kullanılarak yapılan dondurma adımı (340,6 ± 17,1 um (n = 6)) (Bonferroni post-hoc testi, 0.0006 ≤ her karşılaştırma p) içeren protokol varyantı kullanılarak yapılır. Protokol varyantının çok benzer etkiler hipokampus içeren bölümler için gözlendi ve 400 um (Şekil 4B, tek yönlü ANOVA, p <0.0001) ile kesilmiştir. Burada, bölümlerin kalınlığının temel protokol kullanılarak yapılan (217.6 ± 19.2 um (n = 6)) ve protokol varyantı içeren kresil menekşe (198.0 ± 14.8 um (n = 6)) bölümlerinin kalınlığından daha küçük olduğu kullanılarak yapılan dondurma adımı (313.5 ± 8.4 um (n = 6)) (Bonferroni post-hoc testi, 0.001 ≤ her karşılaştırma p) içeren protokol varyantı.
Şekil 1. ön singulat Bölgesindeki Lekeli Nöronlar Örnek fotomikrografları 1. A1 - C1 10X objektif kullanılarak alınan görüntü yığınlarının birleştirilmiş Z çıkıntıların ön singulat kortekste alanı 1 ve ikincil içeren serebral korteksin bir yarım küre için gösterilmiştir motor korteks, yaklaşık bregma 1,18 mm 18. Bu bölümler, 500 um kesilmiştir. Fotomikrograflar, kresil moru boyama (B1) ile taze protokol varyant için ve beyinleri, Golgi-Cox emprenye (C1) aşağıdaki dondurulmuş olan protokol varyant için, ana tüm taze protokolü (A1) kullanılarak gösterilir. Ölçek çubukları 500 mikron. Kırmızı kare ile gösterilen her bölge için C2 - Daha yüksek çözünürlüklü Z projeksiyon görüntüsü A2 gösterilmiştir bir 30X silikon yağ daldırma objektif kullanılarak elde edilen yığınları birleştirilmişA1 fotomikrografilerinde uare - C1. Ölçek çubukları 100 mikron. Nöron trasların 2D Z çıkıntılar A3 gösterilmiştir - C2 - A2 fotomikrografilerinde kırmızı ok ile gösterilen nöronlar için C3. Tüm dendritler çapı gösterim kolaylığı için 2 um ayarlanmıştır. Ölçek çubukları 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. Lekeli nöronlar için dendritik dikenler Örnek fotomikrografları. bir 30X silikon yağ daldırma objektif kullanılarak çekilen fotomikrografları Bu bölümler 500 um olarak kesilmiştir ön singulat kortekste alan 1. katman 1 içinde yer alan nöron dendritler için bir odak düzlemi gösterilmiştir. Nöronlar f kullanılarak boyandı resh protokolü (A1, A2), kresil moru boyama (B1, B2) ve beyin, Golgi-Cox emprenye (C1, C2), aşağıdaki dondurulmuş olan protokol varyant için protokol varyantı. Fotomikrograflar, dilim üst kısmına yakın bir alındı (A1 - C1) ve sonraki mikroskop lamı dilim alt kısmına yakın (A2 - C2). A1-2, B1-2 ve C1-2'nin için Ölçek çubukları 50 mikron. Fotomikrograflar, farklı omurga tiplerini tespit etmek amacıyla, A3, daha yüksek bir büyütme 60X yağa daldırma objektif kullanarak bir odak düzlemi B3 ve C3 'de gösterilmiştir. A3, B3 ve C3 için Ölçek çubukları 10 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
55358 / 55358fig3.jpg"/>
Şekil 3. Hippocampus Lekeli Nöronlar Örnek fotomikrografları. C1-(4x objektif kullanılarak çekilen fotomikrografları taze protokolü (A-1), kresil moru boyama (B1) ile bir protokol varyantı kullanılarak boyandı nöronlar için bir odak düzlemi gösterilmiştir ve protokol varyantı için olan beyinleri, Golgi-Cox emprenye aşağıdaki dondurulur ). Bölümler 400 um kesildi ve yaklaşık bregma -2,18 mm 18'de gösterilmektedir. Ölçek çubukları A1 için 500 um olan - C1. Daha yüksek büyütme fotomikrografları 30X silikon yağ daldırma objektif kullanılarak yakalandı ve hipokampus dentat girus bölgesi içinde yer alan dendrit bir nöron için bir odak düzlemi gösterilmiştir (A2 - C2) ve CA3'e bölgesi (A3 - C3 alkil). Ölçek çubukları A2 50 um olan - C2ve A3 - C3 alkil. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Monte edilmiş Bölümlerin 4. kalınlığı Şekil. Monte edilen bölümlerin ölçülen kalınlık yaklaşık serebral korteks bregma 1,18 mm 18 ihtiva eden bölümler için A'da gösterilen ve 500 um kalınlığında kesildi ve yaklaşık hipokampus bregma -2,18 mm 18 ihtiva eden bölümler için B ve 400 um kesilir kalınlık. Ölçülen bölümler taze protokol, kresil moru boyama protokolü varyantı veya beyin Golgi Cox emprenye aşağıdaki dondurulmuş olan protokol varyantı kullanılarak boyandı. Her iki beyin bölgeleri için, işleme protokolünün önemli bir etkisi vardı(Tek yönlü ANOVA, p <0.0001), protokol ile dondurulmuş kısmen yol olan beyinlerinden bölümleri dondurulmamış olduğu önemli ölçüde daha kalın olduğu, burada (Bonferroni post-hoc testi, tüm p <0.001). Veriler her grupta altı bölümler için ortalama ± SEM gösterilir ve farklı harflerle veri setleri önemli farklılıklar göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz kalın beyin bölümlerinde nöronların görselleştirilmesi için burada Golgi-Cox boyama protokolü iki yararlı varyantları ile birlikte açıklar. Temsili Sonuçlar gösterildiği gibi, uzun bir 800 mikron çalışma mesafesine sahip yüksek çözünürlüklü hedefi kullanımı 500 um kesilerek beyin bölümlerinin derinliği boyunca tüm nöronların güvenilir olarak gösterebilir. nispeten kalın beyin kesitlerinin Bu çalışma, her tür lekeli nöronlar olarak uzun ve karmaşık apikal dendrit ağaçlar piramidal nöronlar için özellikle önemlidir dilim içinde bulunan olasılığını arttırır. Örneğin, kemirgen beyin koronal bölümlerinde bu rostral veya kaudal yönde daha büyük kapsamda nöron dahil edilmesi için izin verir ve kesit aşamasında kare beyin engellerken, aynı zamanda hata için yer arttırır. Biz sadece, bu protokol, diğer pl kesit için uyarlanabilir koronal düzlemde kesit beyin tarif rağmengerektiği gibi anes tamamen tek bölümleri içinde nöronlar etiketli ihtiva etmek. Kullanılan Kesit düzlemi soruşturma altında nöron popülasyonunun morfolojik özelliklerine bağlı olacaktır. Dendritik dikenler görünür hale getirildi ve daha yüksek bir büyütme amaçları omurga tipi / Şekil 2'de fotomikrografları üretilmesi için kullanılan 60X yağa batırılmış objektif gibi morfoloji değerlendirmek için gerekli olmasına rağmen, bu protokol kullanılarak tayin edilebilir: A3 - C3 alkil. Bu kalın bölümlerinde kullanılabilir, ancak amaç çalışma mesafesi dilimin en sınırlıdır. Biz fazla spesifik olmayan boyama veya arka yol açmadan bir standart 25 günlük bir emdirme süresi tamamen fare, sıçan ve inek kuşu beyinde nöronları leke olacağını bulduk gibi bu protokol, aynı zamanda, benzer bir beyin boyutu farklı türlerinde kullanım için uyarlanabilir bir aylık ötesinde emprenye dönemleri ile ortaya çıkabilir. Daha kısa emprenye süreleri s türler için yeterli olabilirmaller beyinleri veya bireysel araştırmacı tarafından optimize edilebilir, yukarıda belirtilen türden, elde edilen beyinlerin disekte örneklerinde.
Bu boyama protokolü için sunulan üç varyant, karşıt değildir taze beyin numuneleri kullanarak ana protokol en iyi sonuçları verir. Şekil 2, A fotomikrografları, bu ana protokolü kolay üst ve monte kalınlığında kesitler altına yakın görebilir de etiketli dendrit ve dikenleri ürettiğini göstermektedir. kresil menekşe counterstain ekleme beyin bölgelerinde ve serebral korteks tabakalarının tanımı kolaylaştırma avantajına sahiptir, ancak kalın bölüme derin imgelerken da yaygın mor bir arka plan eklenmiştir. Bu protokol, varyant, sadece leke Ancak, kresil moru, dendrit ve vücutlarının monte kalın bölümlerin yüzey bölümlerinin alt (Şekil 2 B) yakınında açık bir şekilde görülebildi. Bu aynı zamanda süreden görünüyorDaha önce daha ince bölümleri 19, 20, 21 kullanıldığında bile, rapor gösterilenden daha kalın bölümlerin yüzeyine yakın Nissl boyama daha net bir desen ce. dondurma adımı içeren protokol varyantı dendritik ağaç morfoloji analizi için kabul edilebilir sonuçlar elde edilir. Bununla birlikte, arka plan renklenmesi daha zor görselleştirmek ve dendrit dikenleri (Şekil 2C) ölçmek için yapım ve böylece dilim daha derin görüntüleme farkedilirler taze dokuda çok daha koyudur. Biz dondurulmuş beyinlerinden bölümlerde cresyl menekşe counterstain teşebbüs ve bu son derece zor bölümünün alt kısmına doğru dikenler görselleştirmek ve ölçmek için yapılan bir çift koyu mor arka plan pus üretti (veriler gösterilmemiştir). Golgi-Cox yedirilmesi önce fare beyinleri dondurma dahil değerlendirildi başka başarısız protokol varyantıtirme. Bu edilmiş glia sahip hücresel nesnelerin boyama ile sonuçlandı ancak nöron herhangi bir tür leke (veriler gösterilmemiştir).
başarılı sonuçlar elde etmek için izlenmesi gereken bu protokolde iki kritik adım vardır. bu sıcaklık ve nemde son derece bağımlı olduğu için (1), her bir laboratuar içindeki bölümler kuruma süresini kontrol etmek için kritiktir. Kurutma süresi çok kısa olursa, bölümler dehidrasyon işlemi sırasında slaytlar düşecek; kurutma süresi çok uzunsa, bölümler çatlar. Bu hatta aynı laboratuvarda ile sezonu ile değişebilir gibi, bir araştırma-şekillendirilmeye hemen önce "test" beyinlerin bir dizi kuruma süresini doğrulamak için avantajlı olacaktır. (2) Bütün fazla agar dehidrasyon aşamasından önce bölümü ve bir mikroskop lamı çıkarılmalıdır. Bu yapılmazsa, Agar deforme olacaktır ve slayt kapalı bölümüne çekebilir.
histolojik için bir diğer önemli faktörBiyolojik numunelerin el analizi doku çekmedir. Bu işlem sonrası, dehidrasyon ve son kesit kalınlığı orijinal kesme değerinin yaklaşık yansı kadar azaltılır, ana Golgi Cox protokolü (Şekil 4) kullanılarak, beyin bölmelerinin coverslipping, montaj tespit ettik. Ayrıca donma adımı dahil protokol varyantı kullanarak işlemden bölümler, ana protokolü (Şekil 4) ile işlenmiştir taze bölümlerden daha belirgin olarak daha kalın olduğunu not edin. Her iki protokol aynı donmaya karşı koruma ve işleme aşamaları dahil ve sadece beyinleri gerçek donma tarafından farklılık çünkü bu ilginç ve beklenmedik hem de oldu. Nedenle, farklı çalışmalarda ya da farklı laboratuarlardan Golgi Cox lekeleme kullanılarak üretilen nöron morfolojisi veri karşılaştırırken protokollerde potansiyel farklılıkları hesaba için kritik öneme sahiptir. Biz literatürde son bölümü kalınlığı için verileri bulmak mümkün değildi rağmen, faydalı olacağınınöron morfolojisinin önlemleri bildirirken araştırmacılar doku büzülmesi ve / veya doğru bu verileri bildirmek için. Ayrıca, 500 um kesilmiş bölümler için> 200 um son kalınlığı en yüksek büyütme hedeflerin çalışma mesafesinden daha büyük olduğu, ancak, bu laboratuvarda kullanılan 30X objektif çalışma mesafesinde de hala olduğunu belirtmek gerekir. dendritler ve omurgaları ana Golgi Cox protokolü kullanılarak, bu dilimlerin altına yakın açıkça görülebilir olduğu için, ve 1 mm aralığı dahil olmak üzere çok daha büyük bir kalınlıkta kesilmiş bölümleri içinde ihtiva edilen nöronlar görselleştirmek için mümkün olabilir.
Bu protokol tek bölümlerinde uzun dendritik milleri iz yeteneği dahil olmak üzere bir dizi avantaj sunmasına rağmen, opsiyon dilimleme ve emprenye beyinleri işlenmesini ve daha iyi beyin yapılarını tespit etmek cresyl menekşe ile karşıt seçeneği geciktirmek için bazı dezavantajları vardır melikabul edilebilir. 25 günlük kuluçka dönemi bazı araştırmacılar için çok uzun düşünülebilir. Derin monte bölüme görüntüye yeteneği nispeten pahalı uzun bir çalışma mesafesi ile yüksek çözünürlüklü daldırma hedefi erişime bağlıdır. Buna ek olarak, yüksek çözünürlükte, hassas yapıya görselleştirmek için yeteneği monte dilim alt kısmına yakın bir görüntü olarak azalır. Bu protokolün uygulanması dolayısıyla incelenecek nöronlar ve beyin bölgenin morfolojik özelliklerine bağlıdır ve araştırmacı tarafından kullanılabilir donanımları. Önceden beyin ve ilgili bölgenin boyutu için Golgi-Cox emprenye süresi olarak bir araştırma, çalışan protokol değişkenleri optimize etmek için "test" numunelerin kullanımını, ve dendritik mili için kesit düzlemine ve kalınlığı tavsiye görüntülenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma Doğa Bilimleri ve Kanada'nın (NSERC) Mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada Yenilik Vakfı (CFI proje numarası 30381) den CDCB bir John R. Evans Liderler Fonu araştırma altyapısını hibe ve tarafından gelen CDCB bir Discovery Grant tarafından desteklenmiştir NSERC dan NJM bir Discovery Grant. ELL bir Ontario Yüksek Lisans Bursu ile ve Guelph Üniversitesi'nde Ontario Veteriner College'dan ovc Burs tarafından desteklendi. CDS NSERC bir Lisans Öğrencisi Araştırma ASİSTANLIK tarafından desteklenmiştir. ALM NSERC bir Alexander Graham Bell Burs tarafından ve Guelph Üniversitesi'nde Ontario Veteriner College'dan ovc Burs tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| potassium dichromate | Fisher Scientific | P188-100 | Hazardous |
| potassium chromate | Fisher Scientific | P220-100 | Hazardous |
| mercuric chloride | Fisher Scientific | S25423 | Hazardous |
| Whatman grade 1 filter paper | Fisher Scientific | 1001-185 | |
| isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | CP0406V2 | |
| 20 mL scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| sucrose | Bioshop Canada | SUC700.1 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S5011-500G | |
| sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9390-500G | |
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| isopentane | Fisher Scientific | AC126470010 | Also known as 2-methylbutane; hazardous |
| agar | Sigma Aldrich | A1296-100G | |
| small weigh dish | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 6-well tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1b | |
| mesh bottom tissue culture inserts | Fisher Scientific | 07-200-214 | |
| paraformadelhyde (PFA), 16% | Electron Microscope Sciences | 15710-S | Hazardous |
| ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | Hazardous |
| Kodak Fixative A | Sigma Aldrich | P7542 | |
| superfrost plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| CitroSolv clearing agent | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| anhydrous ethyl alcohol | Commercial Alcohols | N/A | |
| cresyl violet | Sigma Aldrich | C1791 | |
| permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| upright microscope | Olympus | BX53 model | |
| colour camera, 12 bit | MBF Biosciences | DV-47d | QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12 |
| 3D motorized microscope stage, controller and enoders | MBF Biosciences | N/A | Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences |
| 4X microscope objective | Olympus | 4x 0.16 N.A. UplanSApo | |
| 10X microscope objective | Olympus | 10x 0.3 N.A. UPlan FL N | |
| 30X microscope objective | Olympus | 30x 1.05 N.A. UPlanSApo | |
| 60X microscope objective | Olympus | 60x 1.42 N.A. PlanAPO N | |
| silicone immersion oil | Olympus | Z-81114 | |
| Neurolucida software | MBF Biosciences | Version 10 | |
| ImageJ software | U. S. National Institutes of Health | Current version | With the OME Bio-Formats plugin installed |
| Photoshop software | Adobe | version CS6 |
References
- Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia del cervello. Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).
- Cox, W. H. Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen. Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).
- Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox Staining Step by Step. Front Neuroanat. 10, 38 (2016).
- Levine, N. D., et al. Advances in thin tissue Golgi-Cox impregnation: fast, reliable methods for multi-assay analyses in rodent and non-human primate brain. J Neurosci Methods. 213 (2), 214-227 (2013).
- Ranjan, A., Mallick, B. N. A modified method for consistent and reliable Golgi-Cox staining in significantly reduced time. Front Neurosci. 1, 157 (2010).
- Gibb, R., Kolb, B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods. 79 (1), 1-4 (1998).
- Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
- Narayanan, S. N., et al. Appraisal of the effect of brain impregnation duration on neuronal staining and morphology in a modified Golgi-Cox method. J Neurosci Methods. 235, 193-207 (2014).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Sutherland, R., Gibb, R., Kolb, B. The hippocampus makes a significant contribution to experience-dependent neocortical plasticity. Behav Brain Res. 214 (1), 121-124 (2010).
- Hamilton, G. F., Whitcher, L. T., Klintsova, A. Y. Postnatal binge-like alcohol exposure decreases dendritic complexity while increasing the density of mature spines in mPFC Layer II/III pyramidal neurons. Synapse. 64 (2), 127-135 (2010).
- Nashed, M. G., Seidlitz, E. P., Frey, B. N., Singh, G. Depressive-like behaviours and decreased dendritic branching in the medial prefrontal cortex of mice with tumors: A novel validated model of cancer-induced depression. Behav Brain Res. 294, 25-35 (2015).
- Frauenknecht, K., et al. Mice with experimental antiphospholipid syndrome display hippocampal dysfunction and a reduction of dendritic complexity in hippocampal CA1 neurones. Neuropathol Appl Neurobiol. 41 (5), 657-671 (2015).
- Camacho-Abrego, I., et al. Rearrangement of the dendritic morphology of the neurons from prefrontal cortex and hippocampus after subthalamic lesion in Sprague-Dawley rats. Synapse. 68 (3), 114-126 (2014).
- Redila, V. A., Christie, B. R. Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus. Neuroscience. 137 (4), 1299-1307 (2006).
- Bailey, C. D., Alves, N. C., Nashmi, R., De Biasi, M., Lambe, E. K. Nicotinic alpha5 subunits drive developmental changes in the activation and morphology of prefrontal cortex layer VI neurons. Biol Psychiatry. 71 (2), 120-128 (2012).
- Lytton, W. W. From computer to brain : foundations of computational neuroscience. , Springer. (2002).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd, Academic. (2001).
- Ha, H. A modified Golgi-Cox method with counterstain for the study of synapses. Anat Rec. 155 (1), 59-64 (1966).
- Swanson, L. W. The locus coeruleus: a cytoarchitectonic, Golgi and immunohistochemical study in the albino rat. Brain Res. 110 (1), 39-56 (1976).
- Pilati, N., Barker, M., Panteleimonitis, S., Donga, R., Hamann, M. A rapid method combining Golgi and Nissl staining to study neuronal morphology and cytoarchitecture. J Histochem Cytochem. 56 (6), 539-550 (2008).
