Summary
Apresenta-se um protocolo para a utilização do método de coloração de Golgi-Cox em secções do cérebro de espessura, a fim de visualizar os neurónios com árvores dendriticas longos contidos dentro de amostras de tecidos individuais. Duas variantes deste protocolo são também apresentados que envolvem cresilo contracoloração violeta, e a congelação dos cérebros não transformadas, para o armazenamento a longo prazo.
Abstract
O método de Golgi-Cox neurónio de coloração foi utilizado para mais de duzentos anos para avançar a nossa compreensão dos neurónios morfologia dentro de amostras de cérebro histológicos. Embora seja preferível do ponto de vista prático para preparar secções de cérebro na maior espessura possível, a fim de aumentar a probabilidade de identificação de neurónios corados que estão totalmente contidos no interior de secções individuais, esta abordagem é limitada a partir de um ponto de vista técnico pela distância de trabalho de alta -magnification objetivos microscópio. Relatamos aqui um protocolo para corar neurónios usando o método de Golgi-Cox em secções de cérebro de rato que são cortadas a 500 de espessura? M, e de visualizar os neurónios em toda a profundidade destas secções utilizando um microscópio vertical equipado com uma alta resolução de 30X 1,05 NA silicone objectiva de imersão em óleo que tem uma distância de trabalho de 800? m. Nós também relatam duas variantes úteis deste protocolo que pode ser empregue para a superfície de contracoloraçãomontadas secções de cérebro com o corante de Nissl violeta de cresilo, ou a congelar cérebros inteiros para armazenamento a longo prazo antes de seccionamento e o processamento final. O protocolo principal e as suas duas variantes produzir secções de cérebro de espessura coradas, ao longo da qual árvores neurónio dendríticas completos e espinhos dendríticos podem ser fiavelmente visualizadas e quantificadas.
Introduction
A visualização dos neurónios individuais dentro de amostras de tecido permite a análise in si tu de características morfológicas de neurónios, que tem avançado de forma significativa a nossa compreensão do cérebro e como ela pode ser influenciada pela doença endógeno ou factores ambientais exógenos. O método de coloração de Golgi-Cox é um meio eficaz em termos de custos, relativamente simples de marcação de uma amostra aleatória de neurónios no cérebro. Primeiro desenvolvido por Golgi 1 e modificado por Cox 2 em 1800, os investigadores têm refinado ainda mais esta técnica ao longo dos anos para produzir neurónios claras, bem corados que podem ser utilizados para visualizar e quantificar tanto morfologia árvore dendrítica e densidade da coluna 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9.
Uma consideração importante técnica para a visualização dos neurónios corados nas secções do cérebro é a espessura máxima fatia, que é limitada pela distância de trabalho de objectivos disponíveis de elevada ampliação / de alta resolução de microscópio. objetivos de imersão em óleo comuns no 60 - 100X intervalo fornece excelente resolução, mas são limitados por suas distâncias de trabalho que são tipicamente não superior a 200 mm. Secções cerebrais cortados no pm gama 200 pode ser adequado para visualizar certos tipos neuronais que podem estar contidos dentro desta espessura da fatia, por exemplo, neurónios piramidais em camadas superficiais do córtex cerebral de 10, 11, 12, neurónios piramidais na região CA1 do hipocampo 13, 14, e as células granulares no giro dentado do hipocampo 15. Neurônios com relativamente mais longoárvores dendriticas, tais como os neurónios piramidais em camadas profundas do córtex cerebral que para o rato pode estender-se mais do que 800 um a partir do corpo da célula 16, proporcionam uma maior desafio porque os cérebros teriam de ser seccionados com um ângulo ideal para conter toda a árvore de dendrite dentro de 200? m fatias. Isso pode até não ser viável se um dendrite ou qualquer de seus ramos se estendem na direção rostral ou caudal. Embora seja possível para resolver esta limitação, traçando um neurônio em várias seções cerebrais adjacentes, esta abordagem apresenta um desafio técnico significativo em alinhar as secções com precisão para rastrear 17. Uma abordagem mais prática seria para visualizar os neurónios inteiras contidos dentro de secções do cérebro que são cortadas a uma espessura maior.
Relatamos aqui uma técnica para corar neurónios dentro 400-500 seces cerebrais de espessura de ratinhos, utilizando o método de Golgi-Cox, e para visualizar a sua morphology usando uma objectiva de silício de imersão em óleo de alta resolução que tem uma distância de trabalho de 800? m. A impregnação e o processamento do protocolo de Golgi-Cox que descrevemos é modificado a partir de um dos protocolos mais modernos-citados na literatura 6. A nossa abordagem com secções de cérebro de espessura proporciona a vantagem de aumentar a probabilidade de identificação de neurónios de qualquer tipo dos que são totalmente contida dentro da secção. Em adição ao protocolo principal, que também apresentam duas variações que fornecem vantagens únicas: (1) a coloração de Golgi-Cox com o contra-corante violeta de cresilo na superfície de secções montadas, de modo a definir os limites de regiões do cérebro e para identificar camadas da córtex cerebral, e (2) a coloração de Golgi-Cox com um passo de congelação intermédia para o armazenamento de longo prazo de impregnados cérebros inteiros antes do corte e o processamento final.
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Protocol
ratinhos fêmea adultos CD1-deformação foram utilizados neste estudo. coloração semelhante pode ser realizada utilizando ambos os sexos em várias idades. Os animais experimentais foram tratados de acordo com os princípios e diretrizes do Canadian Council on Animal Care, eo protocolo experimental foi aprovado pela Universidade do Comitê Animal Care Guelph.
1. Golgi-Cox Coloração
- Golgi-Cox impregnação de Brains
- Adicione a solução de Golgi-Cox de 1% (w / v) de dicromato de potássio, 0,8% (w / v) cromato de potássio e 1% (w / v) de cloreto de mercúrio dissolvendo o dicromato de potássio e de cromato de potássio em água de alta qualidade separadamente . Misturar as soluções, adicionar o cloreto de mercúrio e filtrar a solução final, utilizando um papel de filtro de grau. Guardar a solução no escuro por até um mês.
- Anestesiar o rato usando 5% de isoflurano.
- Euthanize o mouse por decapitação e remover rapidamente o cérebro.
- Coloque o cérebro em um frasco de cintilação de 20 mL glass contendo 17 mL de solução de Golgi-Cox e incubar no escuro à temperatura ambiente durante 25 d.
- Cryoprotect o cérebro, colocando-o para um tubo cónico de 50 ml contendo 40 ml de sacarose crioprotector (30% (w / v) de sacarose em tampão de fosfato 0,1 M, pH 7,4) no escuro a 4 ° C durante 24 h.
NOTA: Os seguintes passos opcionais três podem ser utilizadas como uma alternativa para o protocolo principal, a fim de congelar o cérebro, nesta fase, para o armazenamento a longo prazo. - Congelar todo o cérebro por imersão em 200 ml de isopentano que foi pré-arrefecido em gelo seco.
- Coloque o cérebro congelado para um tubo cónico de 50 ml e armazenar no escuro a -80 ° C.
- Quando pronto para prosseguir, descongelar o cérebro, colocando-o para um tubo cónico de 50 ml contendo 40 ml de crioprotector sacarose no escuro a 4 ° C durante 24 h.
- Seccionamento cérebro
- Remover o cérebro a partir da sacarose e blocok ele para o corte, cortando o cerebelo usando uma lâmina de barbear e deixando uma borda plana na extremidade caudal restante do cérebro.
- agar de calor (3% (w / v) em água) até que seja derretida e deixada arrefecer até que esteja ligeiramente acima do seu ponto de fusão.
- Coloque o cérebro em uma pequena descartável pesam prato com sua extremidade caudal de face para baixo e adicionar uma quantidade suficiente de agar derretido para cobrir o cérebro.
- Depois do agar ter solidificado, aparar o excesso de ágar deixando cerca de 2 - 4 milímetros em torno do cérebro e cola do cérebro para o estágio de um vibratome com a sua extremidade caudal de face para baixo usando uma pequena quantidade de acetato de cola de cianoacrilato.
- Preencher a área de estágio de vibratome com uma quantidade suficiente de agente crioprotector sacarose para cobrir o cérebro, e a secção do cérebro com uma espessura de fatia de 400-500? M (dependendo da região do cérebro a ser examinadas) usando uma frequência de 86 Hz vibração e uma velocidade de avanço da lâmina de 0,125 mm / s.
- Usando um pincel pequeno, Secções lugar cérebro em um poço de uma placa de cultura de tecidos de 6 cavidades contendo inserções de malha de fundo comercialmente disponíveis e pré-carregada com 10 mL de 6% (w / v) de sacarose em tampão de fosfato 0,1 M, pH 7,4.
- Incubar secções no escuro a 4 ° CO / N.
- Desenvolver seções do cérebro
- Usando as inserções de malha-inferior, transferir secções do cérebro para um novo poço contendo 5 ml de paraformaldeído a 2% (v / w) (PBD) em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4. Incubar num agitador rotativo em movimento a uma velocidade lenta no escuro à temperatura ambiente durante 15 min.
- Lavar duas vezes por secções transferindo-os para novos poços contendo 5 mL de água. Lavar num agitador rotativo em movimento a uma velocidade moderada, no escuro à temperatura ambiente durante 5 min.
- secções de transferência para um novo poço contendo 5 mL de 2,7% (v / v) de hidróxido de amónio. Incubar num agitador rotativo em movimento a uma velocidade lenta no escuro à temperatura ambiente durante 15 min.
- Lavar duas vezes por secções transferindo-os para novos poços contendo 5 mL de água. Lave ond balancim movendo-se a uma velocidade moderada, no escuro à temperatura ambiente durante 5 min.
- Secções de transferência para um novo poço contendo 5 ml de fixador A (ver Tabela Materiais) que foi diluída em água 10x a partir da sua concentração original é comprada. Incubar num agitador rotativo em movimento a uma velocidade lenta no escuro à temperatura ambiente durante 25 min.
- Lavar duas vezes por secções transferindo-os para novos poços contendo 5 mL de água. Lavar num agitador rotativo em movimento a uma velocidade moderada, no escuro à temperatura ambiente durante 5 min.
- Montagem seções do cérebro
- Usando um pincel pequeno, montar secções em lâminas de microscópio. Remover o excesso de água e ágar usando uma pinça e um pequeno tecido. Certifique-se de que todos agar é removido antes de prosseguir com a desidratação.
- Permitir secções para secar ao ar à temperatura ambiente durante cerca de 45 min (400 seces) ou 90 min (500 seces).
Observação: O nível de temporização e adequado de secura é crítico, e pode necessitar de ser determinada em cadalaboratório dependendo da temperatura ambiente e grau de humidade. Um tempo muito curto de secagem leva a seções caindo de slides durante passos de desidratação subsequentes e um tempo muito longo de secagem leva a seções de cracking. Seções ainda aparecerá para ser brilhante ao nível adequado de secura. - secções de mancha com violeta de cresilo por colocação desliza para tinas de coloração Coplin como indicado.
NOTA: Este passo opcional pode ser utilizado para seções que nunca tinham sido congeladas, para manchar núcleos neuronais com cresil violeta. Nós descobrimos que a compensação e reidratação seções antes da incubação em violeta cresil leva a ainda coloração e baixo fundo através seções.- Colocar em agente de compensação, durante 5 min. Repetir uma vez.
- Colocar em etanol a 100% durante 5 min. Repetir uma vez.
- Colocar em 95% de etanol em água, depois 75% de etanol em água, e, em seguida, 50% de etanol em água durante 2 minutos cada.
- Colocar em água durante 5 minutos.
- Colocar em 0,5% (w / v) cresyl violeta em água durante 7 minutos.
- Colocar em água durante 2 min. Repetir uma vez.
- Desidratar secções colocando desliza para tinas de coloração Coplin como indicado.
- Colocar em 50% de etanol em água, depois 75% de etanol em água, e, em seguida, 95% de etanol em água durante 2 minutos cada.
- Colocar em etanol a 100% durante 5 min. Repetir uma vez.
- Colocar em agente de compensação, durante 5 min. Repetir uma vez.
Nota: Estes desidratação e de compensação vezes são suficientes para processar cérebro do rato, conforme descrito neste manuscrito. No entanto, temos observado para outras espécies, incluindo ratos e cuco, que o passo de limpeza final, pode ter de ser alargada até 15 min total.
- secções lamela utilizando um meio de montagem anidro.
- Permitir que as lâminas secar horizontalmente no escuro à temperatura ambiente durante, pelo menos, 5 d.
2. Imagiologia manchado neurônios dentro de espessura de seções do cérebro
- Capturando Pilhas de imagens
- Ligue a lâmpada microscópio, câmera e controlador de palco.
- Abra o software microscópio (por exemplo, Neurolucida).
- Coloque um slide no palco microscópio.
- Capturar uma imagem de toda a vista 2D da secção de cérebro utilizando uma objectiva de ampliação baixa, tais como 1,25X 0,4 NA PlanAPO ou 4X 0,16 NA
- Concentre-se imagem e ajustar as configurações da câmera, incluindo o tempo de exposição e balanço de branco.
- Criar um ponto de referência clicando com o botão esquerdo em qualquer lugar na seção
- Capturar a imagem, selecionando "adquirir uma única imagem" dentro da janela de aquisição de imagem.
- Capturar pilhas de imagens meio-resolução da área que contém os neurónios (s) de interesse, usando uma 10X 0,3 NA uPlan FL N objectivo.
- Focar a imagem e ajustar as configurações da câmera, incluindo a exposição e balanço de branco.
- Definir os limites superior e inferior para a pilha de imagens, concentrando-se ao topo da seção de umnd selecionar "set" ao lado de "topo da pilha" dentro da janela de aquisição da imagem e, em seguida, com foco para a parte inferior da seção e selecionar "set" ao lado de "fundo da pilha" dentro da janela de aquisição de imagem.
- Defina a distância passo para 5 mm, digitando "5 m" ao lado de "distância entre imagens" dentro da janela de aquisição de imagem.
- Capturar a pilha de imagens, selecionando "pilha de adquirir" dentro da janela de aquisição de imagem.
- Repetir as etapas acima para captar toda a área de interesse, certificando-se de que todas as pilhas de imagens se sobrepõem, pelo menos, 10% na eixos X e Y.
- Capturar pilhas de imagens de alta-resolução da zona contendo o neurónio de interesse, usando uma NA de silicone objectiva de imersão em óleo de 30X 1,05.
- Aplicar 3 - 4 gotas de óleo de silicone de imersão para o slide e coloque o objetivo sobre o slide, garantindo a fazer contato entre o objetivo e oieu.
- Focar a imagem e ajustar as configurações da câmera, incluindo a exposição e balanço de branco.
- Definir os limites superior e inferior para a pilha de imagens, concentrando-se ao topo da seção e selecionar "set" ao lado de "topo da pilha" dentro da janela de aquisição de imagem, e em seguida, com foco para a parte inferior da seção e selecionar "set" ao lado de "fundo da pilha" dentro da janela de aquisição de imagem.
- Defina a distância passo para 1 mm, digitando "1 mm" ao lado de "distância entre imagens" dentro da janela de aquisição de imagem.
- Capturar a pilha de imagens, selecionando "pilha de adquirir" dentro da janela de aquisição de imagem.
- Repetir as etapas acima para captar toda a área de interesse, certificando-se de que todas as pilhas de imagens se sobrepõem, pelo menos, 10% na eixos X e Y.
- Salve o arquivo de dados e salvar todos os arquivos de imagem em formato TIFF para processamento externo.
- Criar imagens Z-projecção em ImageJ
- software ImageJ aberto que tem o plugin Bio-Formatos instalado.
- Selecione "Plugins" -> "Bio-Formatos" -> "Bio-Formatos Importador".
- Selecione o arquivo de pilha para ser aberto.
- Uma vez que o arquivo é aberto, alterar o formato para RGB, selecionando "Imagem" -> "Type" -> "Cor RGB".
- Criar o Z-projeção, selecionando "Imagem" -> "Stacks" -> "Z Project ...".
- Salvar a imagem Z-projeção bidimensional como um arquivo TIFF.
- Criar uma montagem imagem bidimensional de toda a área de interesse.
- Abra o software (por exemplo, Adobe Photoshop).
- Selecione "Arquivo" -> "Automatizar" -> "Photomerge".
- Selecione "Procurar" e, em seguida, adicionar todos imagarquivos es a serem incorporadas.
- Certifique-se de que "Blend Images Together" é selecionada e, em seguida, selecione "OK".
- Salve a imagem montagem resultante de toda a área de interesse como um arquivo TIFF.
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Representative Results
Este protocolo de coloração de Golgi-Cox e suas duas variantes descritas opcionais podem ser utilizados para visualizar os neurónios individuais dentro de 400 - 500? M de espessura secções do cérebro. Montagens de imagem representativos de dois-dimensional Z-projecções capturados utilizando uma objectiva de 10X e 5? M passos no eixo Z são mostrados na Figura 1: A1 - C1 para uma grande área de secções cerebrais coronais, que inclui a área de córtex cingulado anterior 1 e o córtex motor secundário 18. As secções foram cortadas em 500 mm. Note-se que a variante do protocolo que inclui coloração violeta de cresilo permite a identificação de camadas de células corticais, por exemplo, como pode ser visto por uma camada cortical ao longo da superfície pial das secções na Figura 1B1. Note-se também a aparência semelhante de secções coradas quando se usa o protocolo principal usando todo-tecido fresco (Figura 1A1) e a variante de protocolo no qualcérebros são congelados a meio para o armazenamento a longo prazo (Figura 1C1).
O uso de uma alta resolução 30X 1,05 NA silicone objectiva de imersão em óleo permite a captura de pilhas de imagens que são maiores no eixo X e Y do que aqueles que são capturados usando um objectivo de uma ampliação maior, exigindo assim menos pilhas totais a imagem de um determinado área de interesse. O objectivo particular empregue tem uma distância de trabalho de 800? M, o que é mais do que suficiente para a imagem do cérebro secções espessas. Montagens de imagem de duas dimensões Z-projecções capturado usando este objectivo e 1? M passos no eixo Z são mostrados na Figura 1 (A2-C2) dentro da área do córtex cingulado anterior 1, e bidimensionais Z-projecções de traçados para o neurónios indicados são mostrados na Figura 1: A3 - C3. Observe as imagens de alta resolução que permitem a visualização de neurônios e suas dendrites através doprofundidade de cada pilha de imagens. A variante do protocolo utilizando violeta de cresilo adiciona coloração púrpura de Nissl em toda a fatia, no entanto, com os parâmetros utilizados neste coloração celular é observado apenas perto do topo da fatia. A variante do protocolo que inclui o passo de congelamento opcional produz coloração neurónio que é semelhante ao protocolo principal, no entanto, também introduz uma coloração de fundo difusa que cria a aparência de névoa por difracção da luz por baixo da superfície da fatia. Esta névoa é mais aparente quando imagiologia mais profundamente na fatia e é aparente na imagem Z-projecção na Figura 1C2. As imagens capturadas usando o objetivo 30X também pode ser usado para visualizar e quantificar estruturas neuronais finos, como espinhas dendríticas. Imagens de plano único estão apresentados na Figura 2 para os dendritos coradas utilizando o protocolo principal e as suas duas variantes, com uma imagem feita perto da parte superior da secção e uma imagem feita perto da parte inferior da secção. Observe o purple cresilo coloração violeta de substância de Nissl dentro núcleos neuronais individuais perto do topo da secção na Figura 2B1, que é visto fundo roxo / luz difusa como espalhados perto da parte inferior da secção na Figura 2B2. Note-se também que embora os dendritos e suas espinhas são bem coradas utilizando o protocolo com o passo de congelação, a neblina fundo anteriormente mencionado que é evidente perto da parte inferior da fatia na Figura 2C2 torna mais difícil de visualizar espinhas, limitando o contraste entre eles e o fundo adjacente. Objectivos de maior ampliação também pode ser usado para caracterizar a morfologia das espinhas dendríticas, como mostrado na Figura 2: A3 - C3 onde espinhas de diferentes tipos são claramente visíveis em secções coradas usando cada um dos três protocolos. Aqui, foi utilizado um 60X 1,42 NA objetivo de imersão em óleo. Nós também empregue este protocolo de coloração e as suas variantes para corar os neurónios no interior do hippocAmpus de secções cortadas a 400? m. Como mostrado na Figura 3, as dendrites de neurónios e espinhas pode ser visualizado tanto para as áreas mais-medial da secção (por exemplo, hipocampo região giro denteado na Figura 3: A2 - C2) e as áreas mais-laterais da secção (por exemplo, , região CA3 do hipocampo na Figura 3: A3 - C3). Deve também ser notado que cada uma das condições de coloração produzido resultados semelhantes, vantagens e desvantagens para os mostrados nas Figuras 1 e 2 para o córtex cerebral.
A espessura final de secções de cérebro processados depende da variante protocolo específico empregue. Como mostrado na Figura 4A para as secções que contêm o córtex cerebral e cortar a 500 um, houve um efeito significativo da variante de protocolo sobre a espessura medida da processadas e montadas / secções cobertas com lamelas (one-way ANOVA, p <0,0001). Aqui, a espessura das secções feitas utilizando o protocolo principal (251,0 ± 12,5 (SEM) m (n = 6)) e a variante protocolo envolvendo violeta de cresilo (219,3 ± 8,5 uM (n = 6)) foi menor do que a espessura das secções feito usando a variante do protocolo envolvendo o passo de congelação (340,6 ± 17,1? m (n = 6)) (teste de Bonferroni post-hoc, cada comparação p ≤ 0,0006). Foram observados efeitos muito semelhantes de variante protocolo para as secções que contêm o hipocampo e cortar a 400? M (Figura 4B, ANOVA de uma via, p <0,0001). Aqui, a espessura das secções feitas utilizando o protocolo principal (217,6 ± 19,2? M (n = 6)) e o violeta de cresilo variante protocolo envolvendo (198,0 ± 14,8? M (n = 6)) foi menor do que a espessura das secções feitas usando o variante protocolo envolvendo o passo de congelação (313,5 ± 8,4 uM (n = 6)) (teste de Bonferroni post-hoc, cada comparação p ≤ 0,001).
Figura 1. Fotomicrografias de Exemplar manchado neurônios na área da cingulado anterior 1. A1 - C1, Incorporadas Z-projecções de pilhas de imagens adquiridas utilizando uma objectiva de 10X são mostrados para um hemisfério do córtex cerebral, que inclui a área de córtex cingulado anterior 1 e secundária córtex motor a cerca de 1,18 milímetro 18 bregma. Estas secções foram cortadas em 500 mm. Fotomicrografias são mostrados usando a principal todo-fresco protocolo (A1), para a variante do protocolo de fresco com coloração de violeta de cresilo (B1) e para a variante de protocolo no qual cérebros são congelados seguinte Golgi-Cox impregnação (C1). As barras de escala são 500. Com resolução superior fundiu pilhas de imagens de projecção Z-adquiridos utilizando uma objectiva de silício de imersão em óleo de 30X são mostrados na A2 - C2 para cada área indicada pela sq vermelhouare nas fotomicrografias em A1 - C1. As barras de escala são de 100 um. 2D-Z projecções de neurónios de traçados são mostrados na A3 - C3 para os neurónios indicados pela seta vermelha nas fotomicrografias em A2 - C2. O diâmetro de todos os dendritos foram ajustados para 2? M, para facilidade de ilustração. As barras de escala são de 100 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Exemplos de Fotomicrografias de espinhas dendríticas para manchados Neurons. Fotomicrografias capturados usando um 30X silício objectiva de imersão em óleo são mostrados em um plano focal para neuronais dendritos localizados dentro de uma camada de região do córtex cingulado anterior 1. Estas secções foram cortadas em 500 mm. Os neurónios foram coradas utilizando o f protocolo resh (A1, A2), a variante do protocolo de coloração com violeta de cresilo (B1, B2) e para a variante de protocolo no qual cérebros são congelados seguinte Golgi-Cox impregnação (C1, C2). Foram tiradas fotomicrografias perto do topo da fatia (A1 - C1) e perto da parte inferior da fatia seguinte para a lâmina de microscópio (A2 - C2). As barras de escala para A1-2, B1-2 e C1-2 são de 50? M. Fotomicrografias são mostrados em A3, B3 e C3 para um plano focal usando um de maior ampliação 60X objectiva de imersão em óleo, de forma a identificar diferentes tipos de coluna. As barras de escala para A3, B3 e C3 são de 10? M. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3. Exemplos de Fotomicrografias de manchado neurónios no hipocampo. Fotomicrografias capturados utilizando uma objectiva de 4X são mostrados em um plano focal para neurónios corados usando o protocolo de fresco (A1), a variante do protocolo com coloração de violeta de cresilo (B1) e para a variante de protocolo no qual cérebros são congelados seguinte Golgi-Cox impregnação (C1 ). As secções foram cortadas a 400? M e são mostrados em aproximadamente -2,18 milímetros Bregma 18. As barras de escala são 500 mm para A1 - C1. Fotomicrografias maior ampliação foram capturadas usando uma 30X silício objectiva de imersão em óleo e são mostrados em um plano focal para neurónio dendritos localizada dentro da região giro dentado do hipocampo (A2 - C2) e região CA3 do hipocampo (A3 - C3). As barras de escala são 50 um para A2 - C2e A3 - C3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. A espessura das secções montadas. A espessura medida de secções montadas é mostrado em A para as secções que contêm o córtex cerebral a cerca de 1,18 milímetros Bregma 18 e cortar a 500 um de espessura, e em B para as secções que contêm o hipocampo a aproximadamente -2,18 milímetros Bregma 18 e cortar a 400? M espessura. secções medidos foram coradas utilizando quer o protocolo de fresco, a variante do protocolo de coloração com violeta de cresilo, ou a variante de protocolo no qual cérebros são congelados seguinte Golgi-Cox impregnação. Para ambas as regiões do cérebro, houve um efeito significativo do protocolo de processamento(One-way ANOVA, p <0,0001), onde secções de cérebros que foram maneira parte congelada através do protocolo foram significativamente mais espessa do que aqueles que não foram congelados (teste de Bonferroni post-hoc, todos p <0,001). Os dados são apresentados como média ± SEM para seis secções em cada grupo, e os conjuntos de dados com diferentes letras indicam diferenças significativas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Descrevemos aqui um protocolo de coloração de Golgi-Cox, juntamente com duas variantes úteis para visualizar os neurónios do cérebro dentro de secções espessas. Como mostrado nos resultados representativos, a utilização de uma objectiva de alta resolução que tem uma longa distância 800? M de trabalho permite a visualização dos neurónios de confiança inteiras ao longo da profundidade das secções de cérebro cortadas em 500 mm. Este estudo de secções de cérebro relativamente espessas aumenta a probabilidade de que os neurónios corados de qualquer tipo estão totalmente contidas dentro da fatia, o que é especialmente importante para os neurónios piramidais com árvores de dendrites apicais longas e complicadas. Por exemplo, em secções coronais de cérebro de roedores, isto permite a inclusão de neurónios que se estendem mais longe no sentido rostral ou caudal, e aumenta também o espaço para o erro ao bloquear o cérebro diretamente no passo de seccionamento. Embora nós descrevemos cérebro de corte no plano coronal única, este protocolo pode ser adaptado para o seccionamento em outros planes, conforme necessário para totalmente contêm neurónios marcados no interior de secções individuais. O plano de seccionamento utilizada irá depender das propriedades morfológicas da população neurónio sob investigação. Espinhas dendriticas podem ser visualizadas e quantificadas utilizando este protocolo, embora os objectivos de maior ampliação são necessárias para avaliar tipo espinha / morfologia, tais como o objectivo de imersão em óleo de 60X usadas para produzir as fotomicrografias na Figura 2: A3 - C3. Isso pode ser empregado em seções espessas, mas é limitado ao topo da fatia dentro da distância de trabalho do objectivo. Este protocolo pode também ser adaptado para utilização em diferentes espécies de tamanho cérebro semelhante, como verificou-se que um período de impregnação padrão de 25 dias será totalmente neurónios em todo o ratinho, rato e cérebro cuco manchar, sem conduzir a coloração ou o fundo não específico excesso que pode ocorrer com períodos de impregnação para além de um mês. períodos de impregnação mais curtos podem ser suficientes para espécies com scérebros Maller ou em amostras de cérebros dissecadas a partir das espécies acima mencionadas, que podem ser optimizadas pelo investigador indivíduo.
Dos três variantes apresentadas por este protocolo de coloração, o principal protocolo utilizando amostras de cérebro fresco que não são contrastadas produz os melhores resultados. As fotomicrografias da Figura 2 Um demonstrar que este protocolo principal produz dendritos bem marcadas e espinhas que são facilmente visíveis na parte superior e na parte inferior das secções espessas montados. Adicionando o contra-corante violeta de cresilo tem a vantagem de facilitar a definição de regiões do cérebro e camadas do córtex cerebral, mas também adicionado um fundo púrpura difusa ao visualizar profundamente em secções espessas. No entanto, uma vez que esta variante protocolo única mancha a superfície de secções espessas montados com violeta de cresilo, dendritos e suas espinhas eram claramente visível perto da parte inferior das secções (Figura 2 B). Isso também parece produce um padrão mais claro de coloração de Nissl, perto da superfície de secções espessas do que aquela mostrada nos relatórios anteriormente, mesmo quando utilizando secções muito finas 19, 20, 21. A variante do protocolo que inclui o passo de congelação produz resultados aceitáveis para a análise de morfologia dendrítica árvore. No entanto, a coloração de fundo é muito mais escuro do que em tecido fresco, que é mais perceptível quando imagiologia mais profundamente na fatia, assim tornando-o mais difícil de visualizar e quantificar as espinhas dendríticos (Figura 2 C). Nós tentou o contra-corante violeta cresil nas seções de cérebros que tinham sido congelados, e isso produziu um fundo roxo neblina ainda-mais escuro que tornou extremamente difícil de visualizar e quantificar espinhos perto da parte inferior da seção (dados não mostrados). Outra variante do protocolo sem sucesso que foi avaliada incluído congelação cérebro do rato antes de Golgi-Cox impregnção. Isto resultou na marcação de objectos celulares que podem ter sido glia, mas não coraram qualquer tipo de neurónios (dados não mostrados).
Existem dois passos críticos neste protocolo que tem de ser seguido para se obter bons resultados. (1) É crítico para verificar o tempo de secagem de secções dentro de cada laboratório, porque este é altamente dependente da temperatura e da humidade. Se o tempo de secagem é muito curto, seções vão cair os slides durante o processo de desidratação; se o tempo de secagem é muito longo, seções vai rachar. Seria vantajoso para verificar o tempo de secagem em um conjunto de cérebros "testar" apenas antes da pré-forma um estudo de pesquisa, pois isso pode variar de acordo com temporada mesmo com o mesmo laboratório. (2) Todos excesso de ágar deve ser removido a partir da secção e lâmina de microscópio antes dos passos de desidratação. Se isso não for feito, o agar irá deformar e pode puxar a seção fora do slide.
Outro factor importante para o histológicaanálise al de amostras biológicas é encolhimento do tecido. Descobrimos que, após o processamento, de montagem, de desidratação e de montagem de lâminas secções do cérebro utilizando o principal protocolo de Golgi-Cox que a espessura da secção final foi reduzida em cerca de metade do valor original do corte (Figura 4). De referir ainda que as secções processadas utilizando o protocolo variante que incluiu o passo de congelação foram significativamente mais espessa do que as secções frescas que foram transformados através do protocolo principal (Figura 4). Este foi interessante e inesperado porque ambos os protocolos envolveram os mesmos passos crioproteção e processamento, e só diferiam pelo congelamento real de cérebros. É, por conseguinte, é crítico para ter em conta as diferenças de potencial em protocolos quando se comparam dados de morfologia neurónio gerados utilizando coloração de Golgi-Cox ou a partir de diferentes estudos a partir de diferentes laboratórios. Embora não fomos capazes de encontrar dados para espessura de corte final na literatura, seria benéficopara os investigadores a comunicar esses dados e / ou correto para encolhimento do tecido ao relatar medidas de neurônio morfologia. Também deve-se notar que, embora a espessura final de> 200 mm para secções cortadas em 500 mm é maior do que a distância de trabalho da maioria dos objetivos de alta ampliação, este ainda está bem dentro da distância de trabalho do objectivo 30X utilizado em nosso laboratório. Uma vez que os dendritos e espinhas são claramente visível perto da parte inferior destas fatias utilizando o principal protocolo de Golgi-Cox, pode ser possível visualizar os neurónios contidos dentro de secções cortadas em uma muito maior espessura até e incluindo o intervalo de 1 mm.
Embora este protocolo oferece um número de vantagens, incluindo a capacidade para rastrear mandris dendríticas longos dentro de secções individuais, a opção para atrasar o corte e processamento de cérebros impregnados, e a opção de contracoloração com violeta de cresilo para melhor identificar estruturas cerebrais, existem algumas desvantagens que devemosser considerado. O período de incubação de 25 dias pode ser considerado muito longo para alguns investigadores. A capacidade de imagem profundo em seções montadas depende do acesso a uma objetiva de imersão de alta resolução com uma distância de trabalho longa, que é relativamente caro. Além disso, a capacidade de visualizar estruturas finas com alta resolução diminui à medida que um imagens perto da parte inferior da fatia montado. A aplicação deste protocolo, por conseguinte, depende das propriedades morfológicas dos neurónios e região do cérebro a ser estudado, e o equipamento disponível para o investigador. Sugerimos que o uso de amostras de "teste" para optimizar variáveis protocolo antes de executar um estudo de pesquisa, tais como Golgi-Cox tempo de impregnação para o tamanho do cérebro e região de interesse, e o plano e a espessura de seccionamento para o mandril dendrítica de ser visualizados.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa Discovery para CDCB das Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Investigação do Canadá (NSERC), um Fundo de Líderes concessão infraestrutura de pesquisa John R. Evans para CDCB da Fundação Canadense para a Inovação (CFI número do projeto 30381), e por uma Descoberta Grant para NJM de NSERC. ELL foi apoiado por uma bolsa de estudo Ontário Pós-graduação e por uma bolsa de estudo OVC do Ontario Veterinary College da Universidade de Guelph. CDS foi apoiado por uma Graduação Student Research Assistantship de NSERC. ALM foi apoiado por uma bolsa de estudo Alexander Graham Bell do NSERC e por uma bolsa de estudo OVC do Ontario Veterinary College da Universidade de Guelph.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| potassium dichromate | Fisher Scientific | P188-100 | Hazardous |
| potassium chromate | Fisher Scientific | P220-100 | Hazardous |
| mercuric chloride | Fisher Scientific | S25423 | Hazardous |
| Whatman grade 1 filter paper | Fisher Scientific | 1001-185 | |
| isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | CP0406V2 | |
| 20 mL scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| sucrose | Bioshop Canada | SUC700.1 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S5011-500G | |
| sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9390-500G | |
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| isopentane | Fisher Scientific | AC126470010 | Also known as 2-methylbutane; hazardous |
| agar | Sigma Aldrich | A1296-100G | |
| small weigh dish | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 6-well tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1b | |
| mesh bottom tissue culture inserts | Fisher Scientific | 07-200-214 | |
| paraformadelhyde (PFA), 16% | Electron Microscope Sciences | 15710-S | Hazardous |
| ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | Hazardous |
| Kodak Fixative A | Sigma Aldrich | P7542 | |
| superfrost plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| CitroSolv clearing agent | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| anhydrous ethyl alcohol | Commercial Alcohols | N/A | |
| cresyl violet | Sigma Aldrich | C1791 | |
| permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| upright microscope | Olympus | BX53 model | |
| colour camera, 12 bit | MBF Biosciences | DV-47d | QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12 |
| 3D motorized microscope stage, controller and enoders | MBF Biosciences | N/A | Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences |
| 4X microscope objective | Olympus | 4x 0.16 N.A. UplanSApo | |
| 10X microscope objective | Olympus | 10x 0.3 N.A. UPlan FL N | |
| 30X microscope objective | Olympus | 30x 1.05 N.A. UPlanSApo | |
| 60X microscope objective | Olympus | 60x 1.42 N.A. PlanAPO N | |
| silicone immersion oil | Olympus | Z-81114 | |
| Neurolucida software | MBF Biosciences | Version 10 | |
| ImageJ software | U. S. National Institutes of Health | Current version | With the OME Bio-Formats plugin installed |
| Photoshop software | Adobe | version CS6 |
References
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