Summary
장 염증의 모델에서 murine 연구 중간 엽 줄기 세포 (MSC)의 작은 비율 (1 ~ 5%) 또는 정 맥 주입 intraperitoneally 집 염증이 콜론과1,2에 설명 했다. 이 연구는 MSCs의 초음파 유도 intracardiac 주사 소장을 증가 지역화 될 보여줍니다.
Abstract
Crohn의 질병 (CD) 작은의 일반적인 만성 염증 성 질환 이며 큰 창 자. Murine와 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 면역 잠재력 있고 비록 관리의 그들의 추적 및 효과 1 를 제한할 수 있습니다 마우스 모델 장 염증, 염증 억제를 보였다 , 3 , 4 , 5. 저 승 부상 모델 MSCs의 로컬 응용 프로그램 장황 결에 염증에 큰 효능을 보이고 있다. 그러나, 인간 골 수 유래 MSCs (hMSCs) 소장, SAMP-1/YitFc (SAMP) 모델 실험 Crohn의 질병의 염증의 사이트에의 현지화를 강화 하는 기술에 대 한 데이터의 부족이입니다. 이 작품 hMSCs SAMP 쥐에 만성 장 염증의 특징이 잘 자발적인 모델의 초음파 유도 intracardiac 주입에 대 한 새로운 기술을 설명합니다. 성별 및 나이-일치, 염증 없는 AKR/J (AKR) 마우스 컨트롤으로 사용 되었다. biodistribution와 지역화를 분석 하려면 hMSCs lentivirus 트리플 기자 포함으로 불리고 있었다. 트리플 기자 발광 영상; 대 한 반딧불 luciferase (fl)의 구성 단위체 빨간 형광 성 단백질 (mrfp), 셀 정렬; 그리고 잘린된 포진 심 플렉스 바이러스 티 미 딘 키 니 아 제 (ttk), 양전자 방출 단층 촬영 (애완 동물)에 대 한 이미징. 이 연구의 결과 hMSCs 염증 무료 AKR 마우스 반대 SAMP 쥐의 소장에 지역화 intracardiac 관리 후 그 24 시간을 보여줍니다. 이 소설, SAMP 쥐의 좌 심 실에서 hMSCs의 주입 초음파 유도 세포 배달, 최소한의 병 적 상태와 사망률 쥐의 급속 한 회복에 대 한 수의 높은 성공률을 보장 합니다. 이 기술은 TNFΔRE6등 작은 창 자 염증의 다른 모델에서 MSCs의 향상 된 지역화에 대 한 유용한 방법을 수 있습니다. 미래 연구는 간 동맥 배달에 의해 hMSCs의 증가 지역화 증가 치료 효능으로 이어질 수 있습니다 경우 결정 됩니다.
Introduction
Crohn의 질병 (CD) 작은의 일반적인 만성 염증 성 질환 이며 대형 창 고 장내 미생물7,8호스트 면역 시스템의 부적 절 한 응답 결과로 생각 된다. 최근 연구 murine와 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 창 자 염증1,3,,45의 마우스 모델에서 염증 억제 수 있습니다 나타났습니다. 선 동적인 장 질병 (IBD), CD9를 포함 하는 환자를 치료 하 골 또는 지방이 많은 직물에서 파생 된 인간의 MSCs를 사용 하는 여러 지속적인 임상 시험이 있다. MSC 치료에 대 한 두 개의 노선이 임상 시험에 사용 되었습니다: 하나 체계적 주입을 포함 한다 (즉, 정 맥) luminal IBD (CD 포함), 및 다른 MSCs의 지역화 된 응용 프로그램/는 누 관에 줄기 세포의 주입을 포함 한다. 항문 주위의 CD 환자의 요 로입니다. 최근 메타-분석에서 MSC IBD, 조직에 대 한 치료의 (즉, 정 맥) MSC luminal IBD (CD 포함)에 대 한 치료는 최대 40%에 효능 (95 %CI: 7-79%)의 환자, 효능은 61%에 훨씬 더 높은 반면 (95 %CI: 36-85%) 때 MSCs 병에 걸린 CD 누9에 로컬로 주입 했다. 최근 단계 III multicenter 무작위 위약 제어 재판 음부 fistulae, 치유의 통계적으로 중요 한 임상 및 방사선 증거를 보여주었다 CD 환자의 항문 주위 누 관에 직접 주입 하는 수용자 지방 줄기 세포의 10메타 분석 결과 확실 한지 알아보는. MSC 치료 정 맥 luminal CD에 대 한 주어진 낮은 효능에 대 한 이유는 부적당 하 게 조사 되었습니다, 하지만 이유 중 하나는 염증의 사이트에 MSCs의 불 충 분 한 수단은 될 수 있습니다. 장 염증의 모델에서 murine 연구만 MSCs (1-5%) 정 맥 주입의 작은 비율 도달 염증이 콜론과; 나머지 MSCs는 폐 (1 차 통과 효과)1,2에 의해 필터링 됩니다 증명 ,5,,1112. 여러 murine 연구 결과 따라서 MSC 관리4대 장 염 동물 모델에서 복 경로 (i.p.) 사용. 그러나, 그들은 또한 그만 셀의 극히 일부에 도달 하 고 콜론을 engraft와 효능은 관련이 녹는 paracrine 요인, 종양 괴 사 인자를 유도할 수 있는 유전자 6 단백질의 분 비 (TSG-6)2시연 했습니다. 면역 억제와 치유의 MSC 메커니즘 포함 paracrine;를 포함 하는 multipronged 접근 셀 근접에 독립적인 요인, TSG-6; 근접-종속 요소를 같은 세포 죽음-ligand (PD-L1); 1 프로그램 또는 가변 1입니다. 따라서, 염증의 사이트에 MSC 지역화 증가 효능9,13발생할 수 있습니다. 사실, 최근 연구는 저 승 상해의 사이트에 직접 이식 하는 MSCs 결과 신생 촉진 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF)를 은닉 하 여 치유에 나타났다. 다른 한편으로, 최소한의 치료 효과 주사5후 지적 했다. (즉, SAMP 쥐에서 소장) 염증의 사이트에 그들의 지 방화를 증가, 좌 심 실에 MSC 관리용이 intracardiac 주입 초음파 기반 기술 개발 되었습니다. 이미지 유도 주입 정확한 주입, 성공의 더 높은 속도로 리드 하 고 병 적 상태와 사망률 감소를 보장 합니다. 또한, 좌 심 실에 MSCs 주입 동맥 순환, 폐에서 덫을 놓아 되기 전에 염증이 소장 도달할 수 어디에 그들을 제공 합니다.
이 연구에서는 인간의 골 수 파생 된 MSCs (hMSCs) CD14SAMP-1/YitFc (SAMP) murine 모델에 주입을 위해 사용 되었다. SAMP 개발 거의 100% penetrance14작은 창 자 염증 만성 염증의 특징이 잘 자발적인 murine 모델 이다. 염증은 microflora 화학, 면역, 또는 유전 조작의 부재에서에 대 한 응답에서 개발 하 고 밀접 하 게 인간의 CD11. 성별 및 나이 일치 염증 무료 AKR/J (AKR) 쥐, SAMP, 보호자 제어 쥐가이 연구에 사용 되었다.
HMSCs는 고립 되었고 후 동의 사용 하 여 유효성을 검사 하 고 이전 프로토콜15,16게시 일반, 미확인 기증자 로부터 얻은 골 수 (BM) 샘플에서 실험실에서 확장. 격리 및 확장, MSC 능력 후에 osteogenic, adipogenic, chondrogenic 차별화는 여러 분석15실험실에서 평가 했다. Osteogenic 기능 분석 결과 피하 immunocompromised CB17-Prkdc SCID 쥐17에 hMSCs를 포함 하는 hydroxyapatite/tricalcium 인산 행렬의 세라믹 큐브를 이식 하 여 수행 되었다. 큐브 분석 결과 골 및 잠재적인 chondrogenesis 및 고 개별 MSC 준비17를 평가 하기 위한 궁극적인 시험으로 간주 됩니다. 주입 후 hMSCs에서 vivo에서 시각화 하기 lentivirus transduce 반딧불 luciferase (플로리다), 단위체 빨간 형광 성 단백질 (mRFP), 그리고 포진 심 플렉스 바이러스 성 티 미 딘 키 니 아 제 (ttk의 구성 된 트리플 리포터 유전자 구조와 hMSCs를 사용 되었다 ), 수정된 myeloproliferative 육 종 바이러스 (국방부) 발기인18에 의해 구동. 트리플 기자에 반딧불 luciferase 효소 hMSCs에서 oxyluciferin로 변환 하 여 주입된 소 그 고 광자/화이트 빛을 생성 한다. 이는 vivo에서 광학 이미징 시스템, 마우스에서 라이브 hMSCs의 시각화를 사용에 민감한 전 하 결합 소자 (CCD) 카메라 (생물 발광)에 의해 감지 됩니다. 생물 발광 영상 (BLI)는 셀을 추적 및 분석 비보 전 직렬로 사용 될 수 있는 중요 한 기술입니다. 강력한 국방부 발기인의 사용 트리플 퓨전 기자 유전자 구성의 연속 식 구동 하 고 16 주19이상 주입 된 hMSCs의 이미징에 대 한 수 있습니다. hMSCs는 transduce 고 낮은 변환 효율성에 어렵다. 최적화 된 프로토콜을 사용 하 여, hMSCs 변환 효율 향상 되었다 고 transgene 식 향상 된18살. Cytometry에 mRFP 식 (트리플 리포터 유전자 중 하나)를 사용 하 여, 최대 83%의 높은 효율으로 hMSCs transduce 능력 시연 했다. 차별화 분석 실험 및 큐브 분석 vivo에서 chondrocytes, adipocytes, 및 osteocytes17로 분화 transduced hMSCs의 능력을 설명 했다.
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Protocol
모든 쥐 실험에서에서 및 절차 연구 케이스 서쪽 예비 대학에 의해 승인 되었다 ' 기관 동물 관리 및 사용 위원회. 절차는 평가 대 한 협회에서 실시 됐다 그리고 실험실 동물 배려 (AAALAC)의 인증 인증 시설. BM 동의 후 케이스 서쪽 예비 대학에서 줄기 세포 핵심 시설에서 대학 병원 기관 검토 위원회 승인 프로토콜에서 발음 되었다.
1. 문화와 변환 인간 골 수 유래 중간 엽 줄기 세포 (hMSCs)
참고: hMSCs의 이전 간행물 15에서 자세히 설명 되어 , 20.
- 절연 Dulbecco에서 hMSCs ' s이 글 수정 낮음 포도 (DMEM-LG) 매체 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보충. 37 ° C, 95% 습도, 그리고 성장 매체의 25 mL로 플라스 크 T175에서에서 5% CO 2 셀 문화. 매체를 3-4 일 마다 교체 합니다. 14 일에 hMSCs의 주 통로 수행 합니다.
- 때 셀 80% 합류에 도달, 완전히 제거 하는 오래 된 매체 및 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수의 5 mL로 세포를 부드럽게 씻어 (PBS, 75 cm 조직 배양 플라스 크).
- 는 플라스 크에서 PBS를 제거 하 고 0.25% trypsin ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 4 개 mL를 추가 합니다. 장소 플라스 크 5-10 분에 대 한 37 ° c 배양 기에 다시 노출의 시간을 최대한 간단한 유지.
- 셀의 대다수 다방면 되고있다 또는 문화 접시에서 분리는 때 소 송아지 혈 청 크거나 trypsin의 절반 볼륨의 볼륨을 추가 하 여 반응을 중지.
- 적절 한 크기 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 5 분에 대 한 400 x g에서 세포를 원심과 상쾌한을 조심 스럽게 제거.
- Resuspend 매체의 5 mL에 셀 (DMEM LG + 10 %FBS)과 hemocytometer 가진 셀.
참고:이 시점에서 셀 수 subcultured 또는 트리플 기자와 불리고.
- 플라스 크. 37 ° C, 95%, 습도, 5% CO 2 성장 매체의 25 mL에 셀 문화. 연결할 셀에 대 한 24 시간을 기다립니다.
- 는 물에서 37 ° C에서 녹여 lentivirus
- 목욕. Dulbecco에 5 mg/mL proteamine 황산 솔루션의 160 µ L를 추가 ' s 문화 매체의 8 mL를 수정이 글 매체 (DMEM) (DMEM LG + 10 %FBS) 100 µ g/mL의 최종 농도 대 한. 3 미 추가 5의 감염 (MOI)의 바이러스 다양성에 대 한 소용돌이 (1 시간 해 동) .
참고: 여기, 불리고 했다 hMSCs 65% 이상 효율 이용 되었다.
2. 왼쪽 심 실에 hMSCs의 Intracardiac 주입 초음파 유도
참고: 설립된 작은 창 자 염증 및 나이 및 성별 일치 AKR/J 쥐 실험에 대 한 함께 사용 하 여 SAMP1/YitFc. 특정 병원 체 자유로운 조건에서 SAMP와 AKR 마우스를 유지 하 고 그들을 먹 여 표준 실험실 차 우, 명암 주기 12 h에 그들을 유지. 여기, 살 균 제와 함께 소 각 되었고 70% 알코올로 씻어 서 CWRU 동물 연구 시설에 위치한 전용된 병원 무료 심장 초음파 실에서 초음파-유도 심장 주사 수행 했다. 실험실 연구 요원 intracardiac 주사 중 가운, 얼굴 마스크와 눈 방패와 멸 균 장갑 등 개인 보호 장비를 착용 해야 합니다. 절차 동안 마우스의 체온을 유지 해야 한다.
- 마우스 마비 전에 이미징 시스템 초음파를 설정 합니다. 이 프로토콜에 대 한 마우스 echocardiogram 위한 초음파 기계를 사용 합니다.
- 새로운 연구를 설정 파워와 초기화 변환기 (30 MHz).
- 0.2의 비율로 100% 산소에 3-4 %isoflurane 사용 하 여 유도 실에서 마우스 anesthetize-0.5 L/분 유지 코 콘을 통해 100% 산소에서 2 %isoflurane 전체 절차에 대 한 동물. 이미지를 수행 하기 전에 적절 한 anesthetization 확인 발가락 곤란 하 여 마우스를 압 연 하 고 운동의 부재 관찰.
참고: 안과 연 고 각 막 건조 방지 하기 위해 마 취의 유도 따라 눈에 적용 되어야 한다. 전송 마 취 쥐 이미징 기계 (즉, 생물 발광 영상 시스템 및 초음파), 그들은 마 취 isoflurane의 유지 보수 복용량을 받게 됩니다. 꼬리에 pinches 반응의 부족을 관찰 하 여 마 취 시작 시간 및 마 취의 깊이 발 패드를 마 취의 전체 기간에 대 한 모든 10 분 확인. - 37 이미징 테이블 및 초음파 젤의 온도 설정 ° c.
- 완전히 제거 하는 모피 머리 제거 크림을 사용 하 여 마 취 마우스의 가슴 영역.
- 부정사 위치에 이미징 테이블에 마우스 놓고 절차 동안 몸 움직임을 피하기 위해 접착 테이프를 가진 위와 더 낮은 사지를 확보 합니다. 절차 동안 심전도 모니터를 사용 하 여 모든 마우스.
- 70% 에탄올 면봉 뒤 10 %povidone / 요오드 면봉을 사용 하 여 가슴의 피부를 청소. 마우스의 가슴 영역에 젤의 두꺼운 층을 적용.
- 홀더에 트랜스듀서를 탑재 하 고 좌 심 실 명확 하 게 보기의 필드에 표시 될 때까지 그것의 위치를 조정.
- 불리고 hMSC 세포 현 탁 액 (멸 균 PBS의 150 µ L에 2 x 10 6 hMSCs) 28 g 1 mL 주사기로의 부하 150 µ L 바늘 하 고 적절 한 소유자에 게 주사기를 확보. Pulsating 혈액을 시각화, 주사기에 작은 공기 열을 유지 합니다. 응집을 방지 하려면 일시 주사 하기 전에 셀.
- 마우스 흉부 쪽으로 주사기, 바늘 궤적 초음파 지도 사용 하 여 조정 고 왼쪽된 심 실 입력.
- 초음파 이미징의 지도 따라 침투 및 마우스의 좌 심 실에 있는 공간을 통해 주사기 바늘.
참고: 주사기 바늘 팁 ultrasonographic 이미지에 좌 심 실에 명확 하 게 볼 수 있어야 합니다. 적절 한 배치는 주사기에 신선한 동맥 혈액 유출에 의해 더 확인 한다. 이들은 성공적인 삽입의 흔적. - 주사 hMSC 세포 현 탁 액 매우 느리게 2 분 이상, 부드러운 사전 적용ssure.
- 정지 세포의 주입, 다음 부드럽게 초음파 젤에서 깨끗 한 바늘, 철회 및 테이프 억제에서 마우스를 놓습니다.
- Preheated 패드와 함께 새로운, 깨끗 한 장에 동물 장소.
참고: 절차 완료 후 따뜻한 환경 제공 되어야 한다 쥐에 복구 될 때까지. 주변 혈관 손상 복구 이후 과열을 피해 야 한다. 쥐를 밀접 하 게 모니터링 및 sternal recumbency를 유지 하는 그들의 기능에 의해 표시 된 그들의 전체 복구까지 다른 마우스에서 격리 보관 한다. - 마 취와 실험의 끝까지 매일의 완전 한 복구를 얻을 때까지 동물을 모니터링.
3. HMSCs의 생물 (BLI) 발광 영상
- 이미징 시스템 생물 발광 intracardiac 주사 후 24 h 마우스 이미지. vivo에서 화상 진 찰 소프트웨어 시작. 이미징 시스템을 초기화 하 고 새로운 연구를 엽니다.
- [컨트롤] 패널에서 클릭 하 여 이미지 매개 변수를 설정 " 시퀀스 설정. " 이미징 모드에서 선택 " 발광 " 및 " 사진. " 0.5에서 노출 시간을 설정 10 분 s 설정에서 binning " 매체 " 및 F 중지/" 1. " 여기 필터를 설정 " 블록 " 및 방출 필터를 " 오픈. " 보기의 필드를 설정 " C " 두 마우스. 수집 컨트롤 패널을 클릭 하 여 이미지 마법사 시퀀스 설정 추가.
- 유도 챔버와 컴퓨터 내부 원뿔에 2.5% 산소 펌프 세트는 isoflurane에 스위치.
- 마우스 i.p. 300 µ L D-소 (12.5 mg/mL)의 주입.
- 마 취 유도 실에서 마우스를 놓습니다.
- 2-3 분 후는 vivo에서 이미징 챔버, 마 취 매니폴드에 원뿔에 그것의 머리에 마우스를 전송. 광 연 고 이미징 동안 눈을 보호 하기 위해 적용 됩니다. 여러 마우스를 이미지를 사용 하 여 검은 빛 배플 인접 한 쥐에 빛의 반사를 방지 하기 위해.
- 클릭는 " 취득 " D 소 주사 후 이미지 수집 10 분 시작 하는 버튼.
- 3.3-3.5 이미지 더 많은 쥐를 단계를 반복.
- Vivo에서 이미지 수집 후 CO 2 흡입 뒤에 자 궁 경부 전위, 죽음을 확인 하 여 쥐를 안락사. Ex vivo 분석을 수행 합니다.
- 쥐; 희생 하기 전에 소 주입 (3.3 단계)를 반복 하는 20 분 후 비보 전 분석을 수행한 경우 라스 신호 소 주사 후 20 분을 저하 될 수 있습니다.
- 전체 위장 (즉, 위에서 항문에), mesenteric 림프 노드 (MLN), 폐, 비장, 그리고 간 제거 하 쥐를 해 부. 집게와가 위 2 , 4를 사용 하 여 접시에 그들을 배치.
- 이미징 챔버에 explanted 장기를 포함 하는 배양 접시를 놓고 단계 3.1-3.6 당 씨 이미지.
- 이미지 수집 후 최적의 절삭 온도 (10 월) 화합물을 포함 하는 견본 금형 explanted 장기 전송. Cryofreeze-80 ° c에서 드라이 아이스를 사용 하 여 금형. Immunohistochemistry hMSCs 16의 존재를 확인 하기 위해 냉동된 섹션에 안티 luciferase 항 체를 사용 하 여 수행.
- 빛의 강도의 정량화에 대 한 관심 (ROI) 도구를 도구 팔레트 16 , 19의 영역을 사용. 투자 수익 프레임 선택한 이미지에 관심 영역을 이동 합니다. 클릭 " ROI 측정 " SEQ 파일 형식에서 데이터를 저장. .Txt 파일로 데이터를 내보내고 통계 소프트웨어를 사용 하 여 정량화 16에 대 한 기본 통계 시험을 수행.
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Representative Results
그림 1 에서는 그들의 줄기 세포 특성을 유지 하는 높은 효율에서 트리플 기자와 hMSCs를 불리고 있습니다. 불리고 hMSCs 씨 (그림 1C, 그림 3)에 의해 실시간으로 구상 될 수 있다. 이 소설, SAMP 쥐의 좌 심 실에 hMSCs의 초음파 유도 주입 주입, 최소한의 병 적 상태와 사망률 (그림 2) 쥐의 빠른 복구에 대 한 수의 매우 높은 성공률을 보장 합니다. HMSCs 한 마우스 주입에 대 한 평균 시간은 약 10 분, 그리고 8-9% 병 적 상태와 사망률 보다이 기술 관찰 했다. 사망률에 대 한 주요 이유는 뇌졸중과 출혈 pericardial 유출에서 심장 tamponade 이다. Ex vivo 분석 수행 24 h hMSC의 intracardiac (간 동맥) 관리는 확인 후 관리 결과의이 경로 염증-무료 반대로 SAMP 쥐의 염증이 작은 창 자에 hMSCs의 유도에 (그림 3C 와 D) 마우스를 제어 합니다. 또한, hMSCs 않는 경향이 있다 염증 무료 AKR 마우스의 작은 창 자에서 체재 하 고 축적 또는 (그림 3B) 폐가에 갇혀 지 고 시작.
그림 1 . hMSCs Vivo에서 시각화와 함께 보존의 줄기 세포 속성에 대 한 높은 효율으로 불리고 있습니다. (A) 불리고 hMSCs의 현미경 이미지. (B) 및 씨 (C)결정 mRFP 식으로 인간의 MSCs의 성공적인 변환 cytometry로 평가. Chondrocytes, adipocytes, 및 osteoblasts로 차별 하는 불리고 hMSCs의 능력을 보여 주는 차별화 분석 실험에 의해 확인으로 불리고 hMSCs 줄기 세포 속성을 유지 합니다. 기능 분석 결과 대 한 hydroxyapatite/tricalcium 인산 행렬의 세라믹 큐브 피하 소성 기증자 뼈 (D)를형성 하는 hMSCs의 기능을 보여 주기 위해 immunocompromised CB17-Prkdc SCID 쥐에 이식 했다. A에서 바 규모 = 500 µ m. 규모 막대 c에서 씨의 단위를 나타냅니다 (103 광자/s/cm2/steradian). D에 바 규모 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 초음파 유도 주입을 위한 계기. (A)는 악기의 파노라마 보기: 심장 초음파 이미징 시스템 (빨간색 사각형)의 적절 한 소유자, 주사기 홀더 및 nosecone (녹색 사각형), 마 취와 흡입 마 취 기계 수술 테이블에 장착 하는 변환기 유도 챔버 (노란색 사각형) (B) Ultrasonographic 이미지의 주사기 바늘: 바늘 팁 (빨간색 화살표) 좌 심 실 (노란색 화살표) 안에 명확 하 게 표시 됩니다. (C) 주사기에 신선한 동맥 혈액 유출 hMSC 관리 전에 좌 심 실에 주사기 바늘의 성공적인 삽입을 확인합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . hMSCs SAMP 쥐에서 Intracardiac Intra arterial 관리 후 소장에 Localize. 3-4 쥐/그룹의 대표 이미지, 안락사 24 h 후 주입 및 3 개의 독립적인 실험에서 표시 됩니다. 생물 발광 영상 vivo에서 (A)주입 후 SAMP와 AKR 마우스 24 시간에에서 hMSCs의 존재를 보여 줍니다. SAMP 쥐에서 vivo 전 분석 보여줍니다 hMSCs 소장 (즉, 염증의 사이트)에 우선적으로 지역화 (D), 반면 그들은 염증-무료 제어 AKR의 작은 창 자에 있으면 안 하는 경향이 (C)마우스입니다. 사실, 첫 번째 동맥 통행 후에 hMSCs 더 SAMP 쥐 (B)반대로 AKR 마우스의 폐에 축적 시작 합니다. HMSCs의 일부는 비장, 간, SAMP와 AKR 마우스 (B, C, D)의 폐에서 감지할 수 있습니다. 스케일 바 씨의 단위 표시 (103 광자/s/cm2/steradian). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 연구는 hMSCs 실험 CD의 작은 장 마우스 모델에서의 초음파 유도 intracardiac 주입에 대 한 소설 기법을 설명합니다. 이 기술은 매우 높은 비율의 생존과 성공, 바늘의 궤적을 마우스 좌 심 실, 초음파에 의해 제공의 실시간, 고해상도 이미지에 따라 조정 될 수 있다 있다. 좌 심 실에 배달의 장점은 hMSCs intra-arterially 배포 다음 하 고 우회 정 맥 순환, 폐에 있는 셀의 집계를 피할. 이전에 간 동맥 배달에 대 한 경 동맥 도관 법 주사 MSCs16,21을 사용 되었다. 경 동맥 도관 법 방법은 동맥 내 카 테 터를 두기 위하여 경 동맥을 노출 하는 수술을 포함 한다. 카 테 터 셀의 수혈에 대 한 대동맥 아치 쪽으로 고급입니다. 카 테 터 제거 후 되 고 경 동맥 출혈. 이 새로운 기술은 경 동맥 도관 법에 비해 좌 심 실에서 MSCs의 초음파 유도 주입은 보다 적게 침략 적, 훨씬 더 빨리 (약 10 분/마우스 60 분/마우스 대), 이며 적은 병 적 상태와 사망률 (< 10% 대 30%). 우수한 mesenteric 동맥의 도관 법을 통해 인간의 임상 실험 hMSCs의 마우스 초음파 유도 intracardiac 주사의 임상 번역 될 것 이라고 (현재 mesenteric 만성 국 소 빈 혈의 치료에 대 한 수행 하 고 다루기 힘든 위장 출혈) 병 소장을 hMSCs를 제공 하.
몇 가지 고려 사항 수정 및 쥐의 좌 심 실에서 hMSCs의 초음파 유도 intracardiac 사출의 문제 해결을 확인 하 고 있습니다. 절차의 중요 한 측면은 좌 심 실으로 주사 바늘을 안내 하는 초음파를 사용 하 여 마스터링은. 어떤 절차, 적절 한 훈련, 연습, 및 전문가 의견 처럼는이 절차를 성공적으로 수행 하려면 중요 한 요소입니다. 불 쌍 한 기술을 출혈 pericardial 유출에서 심장 tamponade 죽음을 발생할 수 있습니다. 세포 응집과 색전술 뇌 (즉, 뇌졸중)의 위험을 최소화 하려면 각 주입 전에 hMSCs resuspend 필수적 이다. 이 절차를 구현 하기 전에 전문가 조언의 받을 로컬 동물 연구 시설 담당 수 의사를 상담 하는 것이 중요 하다. 동물의 안전 하 고 효과적인 사용에 대 한 지침 쥐에 실수로 부상을 최소화 하기 위해 수행 됩니다 확인.
HMSCs의 biodistribution 쥐에 주입 후 검사, hMSCs 고효율 트리플 기자와 성공적으로 불리고 있었다. 차별화 분석 수행 chondrocytes, adipocytes, osteocytes18로 차별 하는 불리고 hMSCs의 능력을 설명 했다. Osteogenic 기능 분석 결과 대 한 hydroxyapatite/tricalcium 인산 행렬의 세라믹 큐브 immunocompromised SCID 마우스에 피하 이식 했다 고 소성 기증자 뼈17,18 형성 하는 hMSCs의 기능 시연 . 이 감 별 법 및 기능 분석 실험 불리고 hMSCs 그들의 줄기 세포 특성 유지를 보여줍니다. 이 연구의 결과 보여 SAMP 쥐로 intracardiac 주입에 사용 되는 불리고 hMSCs 소장, SAMP 쥐에 있는 염증의 사이트에 지역화. 창 자 염증-무료 AKR 마우스, 주입, 염증의 부재에서 암시 하는, 후 창 자 24 h를 지역화 하는 hMSCs의 단지 소수 민족에서에서 hMSCs 소장에 남아 있지 않습니다. 이 데이터 마이그레이션 및 부상, 급성 심근 경색22 심장 등 방사선 부상을 다리16부상된 BM의 사이트에서 engraft를 MSCs의 능력으로 나타났습니다 여러 개의 다른 연구와 일치에는. 처럼 다른 질병에서 저 승 부상 모델 MSCs의 로컬 응용 프로그램 염증23장황에 효능을 보이고 있다. 쥐에 있는 colitis의 2,4,6 trinitrobonzene 술 폰 산 (TNBS) 모델, 하 야 외. 쥐 콜론의 submucosa에 BM 파생 MSCs를 주입 시 주변 지역 TNBS에 노출 하 고 시연 가속23 대 장 염의 치료 .
Manieri 그 외 여러분 에 의해 최근 연구 원심 결, 스타 글란 딘 결핍 생쥐에서 저 승 부상의 사이트에서에서 저 승 MSCs의 내 시경 이용한 주입의 소설 기법을 사용 하 고의 형성을 방지에 그들의 효과 보여 관통 궤 양5. SAMP 작은 창 자 염증의 모델 이며 이러한 마우스 그들의 콜론에 자발적인 염증을 개발 하지 않습니다. 우리의 실험실 개발 하 고 평가 저 승 염증 및 쥐에 있는 종양 개발의 정량화에 대 한 내 시경 방법의 유효성을 검사 했다. 그러나, 내 시경 장치24라이브 마우스 작은 창 자에 도달할 수 없습니다. 채 점 시스템만 안락사 후 SAMP 쥐에 있는 염증의 평가 대 한 터미널 방법으로 사용할 수 있습니다. 따라서 내 시경 방법은 SAMP 모델에서 MSCs의 로컬 응용 프로그램에 대 한 적합 한 아니다. 주입의이 새로운 기술을 사용 하 여 향상 된 로컬라이제이션 MSCs의 소장을 얻을 수 있습니다. 염증이 소장에 증가 지역화 증가 효능으로 번역할 것 이다 여부를 알 수 없는 고 미래 연구의 초점이 될 것입니다. SAMP 모델 이외에 MSCs의 초음파 유도 주입 실험 CD의 TNFΔRE6 murine 모델 등 작은 창 자 염증의 다른 모델에 hMSCs의 향상 된 지역화에 대 한 유용한 방법을 것입니다.
라스는 민감한 이며 hMSCs에서 vivo에서, 하지만 그것을 추적 하기 위해 순차적으로 사용할 수 있는 편리한 기술 hMSC 유도의 정확한 정량화에 대 한 허용 하지 않습니다. 쥐의 트리플 기자 불리고 hMSCs를 사용 하 여 이점을 트리플 기자에 효소 ttk 더 양적 양전자 방출 단층 촬영 (PET)19이미징에 대 한 수입니다. 감마 계산 비례 하는 양적 예상 질병 사이트에 engrafted hMSCs의 수에 대 한 수 있습니다 결합 높은 양적 애완 동물 화상 진 찰 (radiotracer 프로브) 계산 된 단층 촬영 (CT) 스캔 (지역화 제공)는 ttk 유전자 표시 가능한 hMSCs의 수입니다. HMSC 지역화의 정확한 정량화 귀환 hMSCs 및 치료 효능의 비율을 결정 하 고 미래 연구의 초점이 될 것입니다.
그 많은 장점에도 불구 하 고이 기술은 몇 가지 제한 사항이 있다: i) 비싼 심장 초음파 이미징 쥐, ii) 사망률과 질병 률 intracardiac 주입, 및 iii)에 사용 될 무 능력 연관에 대 한 시스템에 대 한 요구는 (즉, 천천히 주입m > 시간) 세포와 다른 분자의. 이러한 제한에도 불구 하 고 그것은 위의 강조 hMSCs의 간 동맥 주입을 위해 경 동맥 도관 법의 현재 기술에 많은 이득이 있다.
결론적으로,이 연구의 결과 효율성과 편의 실험 CD의 SAMP 모델에서 염증의 사이트에 hMSCs의 지역화를 개선 하기 위해 초음파 유도 주입 기술을 보여 줍니다. 미래 연구는 경우 간 동맥 배달에 의해 hMSCs의 증가 유도 모델 작은 창 자 염증의 치료 효능을 증가 될 수 있습니다 결정 됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
Maneesh 데이브는 국방부의 그랜트 PR141774와 크 론 및 Colitis 재단의 미국 경력 개발 수상에 의해 지원 됩니다. 파비오 Cominelli 연구실 NIH에 의해 지원 됩니다 DK042191 (F.C.), DK055812 (F.C.), DK091222 (F.C.) 및 DK07948 (F.C.) 부여. 아놀드 캐 플 란의 실험실 L. 데이비드 E. 버지니아 볼드윈 재단에 의해 부분에서 지원 됩니다. 자금 지원 기관 연구 분석 또는 원고 쓰기에 아무 역할을 했다. 그 내용을 전적으로 저자의 책임입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-LG | Gibco | 31600-091 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25-200-072 | |
| Proteamine Sulfate | Sigma Aldrich | P4020-1G | |
| D-Luciferin | Goldbio | luck-500 | |
| Fetal Bobine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 175 cm tissue cutlure flasks | Corning | 431080 | |
| 75 cm tissue cutlure flasks | Corning | 430720 | |
| Centrifuge tubes | Crysalgen | 23-2265 | |
| Tissue-Plus O.C.T. compound | Fisher HealthCare | 4585 | |
| Cryomold Standard | Tissue-Tek | 4557 | |
| Lenti-Pac HIV Expression Packaging System | GeneCopoeia | HPK-LvTR-20 | |
| Povidone Ionidine swabs | Medline | MDS093901 | |
| Hair removal cream | Nair | N/A | |
| Isoflurane | Piramal Helathcare | NDC 66794 013 25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Aquasonic 100 ultrasound transmission gel | Parker laboratories | 01 08 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SAMP mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| AKR mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| Vevo 770 imaging system | Visual Sonics, Toronto, Canada | ||
| IVIS spectrum series system | PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Living image software | CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Triple reporter | Kindly provided by Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (citation 19) |
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