Summary
Murine undersøgelser i modeller af Colon betændelse har vist, at en lille procentdel (1-5%) af mesenchymale stamceller (MSC) injiceres intravenøst eller intraperitoneal hjem til den betændte kolon1,2. Denne undersøgelse viser, at ultralydsvejledt intracardiac injektioner af MSCs resultere i øget lokalisering til tarmen.
Abstract
Crohns sygdom (CD) er en fælles kronisk inflammatorisk sygdom i små og store tarmene. Murine og menneskelige mesenchymale til stamceller (msc) har immunosuppressive potentiale og har vist at undertrykke betændelse i musemodeller af tarmbetændelse, selvom indgiftsmåde kan begrænse deres målsøgende og effektivitet 1 , 3 , 4 , 5. lokal anvendelse af MSC'er til Colon skade modeller har vist større effekt på mildne betændelse i tyktarmen. Men der er mangel på data om teknikker til at forbedre lokalisering af menneskelige knoglemarv-afledte MSCs (hMSCs) til tyndtarmen, site af betændelse i SAMP-1/YitFc (SAMP) modellen af eksperimentelle Crohns sygdom. Dette arbejde beskriver en ny teknik for ultralyd-styrede intracardiac injektion af hMSCs i SAMP mus, en vel karakteriseret spontan model af kronisk tarmbetændelse. Køn og alder-matchede, inflammation-free RANDIS/J (RANDIS) mus blev brugt som kontrol. For at analysere biodistributionen og lokalisering, var hMSCs transduced med en lentivirus, der indeholder en tredobbelt reporter. Den tredobbelte reporter bestod af firefly luciferase (fl), for en bioluminescerende imaging; monomere rødt fluorescerende proteiner (mrfp), til celle sortering; og afkortet herpes simplex virus thymidine kinase (ttk), for positron emission tomografi (PET) imaging. Resultaterne af denne undersøgelse viser at 24 h efter intracardiac administration, hMSCs lokalisere i tyndtarmen af SAMP mus i modsætning til inflammation-free RANDIS mus. Denne roman, ultralydsvejledt injektion af hMSCs i venstre hjertekammer af SAMP mus sikrer en høj succesrate på celle levering, giver mulighed for hurtig inddrivelse af mus med minimal sygelighed og dødelighed. Denne teknik kunne være en nyttig metode til forbedret lokaliseringen af MSCs i andre modeller af små-tarm inflammation, såsom TNFΔRE6. Fremtidige undersøgelser vil bestemme, hvis den øgede lokalisering af hMSCs af intraarteriel levering kan føre til øget terapeutiske virkning.
Introduction
Crohns sygdom (CD) er en fælles kronisk inflammatorisk sygdom i små og store tarme og menes at skyldes en uhensigtsmæssig reaktion i immunsystemet vært til tarm mikrober7,8. Nylige undersøgelser har vist, at både murine og menneskelige mesenchymale til stamceller (msc) kan undertrykke betændelse i musemodeller tarmbetændelse1,3,4,5. Der er flere igangværende kliniske forsøg, som bruger menneskelige MSCs stammer fra knoglemarven eller fedtvæv til behandling af patienter med inflammatorisk tarmsygdom (IBD), som omfatter CD9. To ruter for MSC terapi har været brugt i disse kliniske forsøg: en indebærer den systemiske infusion (dvs. intravenøst) af MSCs luminale IBD (herunder CD), og den anden omfatter lokaliseret anvendelse/injektion af stamceller i fistlen tarmkanalen af patienter med endetarmsåbning CD. I en nylig meta-analyse af MSC terapi for IBD, systemisk (dvs., intravenøs) MSC terapi for luminale IBD (herunder CD) blev effektiv i op til 40% (95% CI: 7-79%) af patienter, der henviser til, at effekten var meget højere, på 61% (95% CI: 36-85%), når MSCs blev sprøjtet lokalt ind den syge CD fistel9. En nylig fase III multicenter randomiseret placebo kontrollerede forsøg af allogene adipøst stamceller injiceres direkte i perianal fistel CD patienter viste statistisk signifikant klinisk og radiologiske tegn på endetarmsåbning fistler healing, bekræfter resultaterne af meta-analyse10. Årsagerne til den lave effekten af MSC terapi gives intravenøst luminale CD er blevet utilstrækkeligt undersøgt, men en af grundene kan være den utilstrækkelige homing af MSC'er til stedet for betændelse. Murine undersøgelser i modeller af Colon betændelse har vist, at kun en lille procentdel af MSCs (1-5%) injiceres intravenøst nå betændte tyktarmen; de resterende MSCs er filtreret af lungerne (first-pass effekt)1,2 ,5,11,12. Flere murine forskningsundersøgelser har derfor brugt intraperitoneal ruten (i.p.) for MSC administration i dyremodeller for colitis4. De har imidlertid også vist, at kun en lille brøkdel af celler nå og indpode tyktarmen og at effekten er relateret til udskillelsen af opløselige paracrine faktorer, såsom tumor nekrose faktor-inducerbar gen 6 protein (TSG-6)2. MSC mekanisme af immunosuppression og healing indebærer en flerstrenget tilgang, der involverer paracrine; celle nærhed-uafhængige faktorer, som GTS-6; og celle nærhed-afhængige faktorer, ligesom programmeret død-ligand 1 (PD-L1); eller takkede 1. Derfor, MSC lokalisering til webstedet af betændelse kan resultere i øget effektivitet9,13. Faktisk viste en nylig undersøgelse, at MSC'er direkte implanteret i stedet for Colon skade resulterede i healing ved at udskille angiogenese-fremme vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF). På den anden side blev en minimal helbredende effekt bemærket efter intravenøs injektion5. For at øge deres lokalisering til webstedet af betændelse (dvs., tyndtarmen i SAMP mus), blev denne ultralydsvejledt intracardiac injektionsteknik for MSC administration i venstre hjertekammer udviklet. Image-vejledt injektion sikrer en præcis indsprøjtning, hvilket fører til en højere sats for succes og at faldt sygelighed og dødelighed. Derudover leverer indsprøjtning af MSCs i venstre hjertekammer dem til arteriel omsætning, hvor de kan nå de betændte tyndtarmen før at blive fanget i lungerne.
I denne undersøgelse, blev menneskelige knoglemarv-afledte MSCs (hMSCs) brugt til injektion i den SAMP-1/YitFc (SAMP) murine model CD14. STEMPLET er en vel karakteriseret spontan murine model af kronisk inflammation, der udvikler små tarmbetændelse med næsten 100% penetrans14. Inflammation udvikler sig som reaktion på mikrofloraen i mangel af enhver kemisk, immunologisk eller genetisk manipulation og ligner menneskelige CD11. Sex - og alder-matchede inflammation-free RANDIS/J (RANDIS) mus, Børnesikring mus af SAMP, anvendtes i denne undersøgelse.
HMSCs var isoleret og udvidet i laboratorium fra knoglemarv (BM) prøver fra normal, uidentificerede donorer efter informeret samtykke ved hjælp af validerede og tidligere offentliggjorte protokoller15,16. Efter isolering og ekspansion, MSC evne i osteogenic, adipogenic, og chondrogenic differentiering blev evalueret i laboratoriet af flere assays15. Den osteogenic funktionel analyse blev udført af implanterer keramiske terninger af hydroxyapatit/tricalciumphosphat fosfat matrix indeholdende hMSCs subkutant i immunkompromitterede CB17-Prkdc SCID mus17. Cube analysen viser osteogenesis og chondrogenesis potentielle og betragtes som den ultimative test til at vurdere individuelle MSC præparater17. For at visualisere hMSCs i vivo efter injektion, blev lentivirus brugt til at transduce hMSCs med tredobbelt reporter gen konstruktion, der består af firefly luciferase (fl), monomere rødt fluorescerende proteiner (mRFP) og herpes simplex viral thymidine kinase (ttk ), drevet af en modificeret myeloproliferative sarkom virus (mnd) promotor18. Firefly luciferase i tredobbelt reporter er et enzym der dækfjer injiceres luciferin til oxyluciferin i hMSCs og producerer fotoner/hvidt lys. Dette registreres af følsomme charge - sammen enhed (CCD) kamera (bioluminescens) i en i vivo optisk tænkelig ordning, muliggører visualisering af levende hMSCs i mus. Bioluminescens imaging (BLI) er en følsom teknik, der kan bruges seriefremstillede til sporing af celler og for ex vivo analyse. Brug af en stærk mnd promotor drev kontinuerlig udtryk for triple fusion reporter gen konstruktion og giver mulighed for billeddannelse af injicerede hMSCs for mere end 16 uger19. HMSCs er vanskeligt at transduce og har en lav transduktion effektivitet. Bruger en optimeret protokol, hMSCs transduktion effektivitet er blevet forbedret og transgen udtryk blev udvidet18. Ved hjælp af mRFP udtryk, (en af generne, tredobbelt reporter) på flowcytometri, blev evnen til at transduce hMSCs med en høj virkningsgrad på op til 83% demonstreret. Differentiering assays og i vivo cube assays demonstreret den transduced hMSCs evne til at differentiere i chondrocytter, adipocytter og osteocytes17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle mus eksperimenter og procedurer i undersøgelsen blev godkendt ved Case Western Reserve University ' s institutionelle Animal Care og brug udvalget. Procedurerne, der blev gennemført i tilknytning til vurdering og akkreditering af laboratorier dyrs pleje (AAALAC) godkendt facilitet. BM var indsugning under et universitet sygehuse institutionelle Review Board-godkendt protokollen på stamcelle core facilitet ved Case Western Reserve University efter informeret samtykke.
1. kultur og transduktion af menneskelige knoglemarv-afledte mesenkymale stamceller (hMSCs)
Bemærk: isolering af hMSCs er beskrevet detaljeret i forrige publikationer 15 , 20.
- Kultur isoleret hMSCs i Dulbecco ' s ændret Eagle Medium-lav glucose (DMEM-LG) medium suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS). Kultur cellerne ved 37 ° C, luftfugtighed 95% og 5% CO 2 i T175 kolber med 25 mL af vækstmediet. Udskift mediet hver 3-4 dage. Dag 14, udføre den primære passage af hMSCs.
- Når cellerne nå 80% sammenløb, helt at fjerne den gamle medium og forsigtigt vaske cellerne med 5 mL sterilt fosfatbufferet saltopløsning (PBS; til 75 cm vævskultur flasker).
- Fjerne PBS fra kolben og der tilsættes 4 mL 0,25% trypsin-ethylendiamintetra syre (EDTA). Sted kolben tilbage i varmeskab ved 37 ° C i 5-10 min. hold tid eksponering så kortfattet som muligt.
- Når fleste celler er blevet afrundet eller have løsrevet fra kultur parabol, stoppe reaktionen ved at tilføje et bind af kvæg kalveserum lig med halv mængde af trypsin.
- Overføre cellesuspension til en passende størrelse-centrifugerør. Centrifugeres celler ved 400 x g i 5 min og derefter forsigtigt fjerne supernatanten.
- Resuspend celler i 5 mL medium (DMEM-LG + 10% FBS) og tælle celler med en hemocytometer.
Bemærk: På dette punkt, cellerne kan podes eller transduced med tredobbelt reporter.
- Udføre transduktion af hMSCs med tredobbelt reporter.
- Frø 1,5 x 10 6 celler i én T175 kolbe. Kultur celler i 25 mL af vækstmediet ved 37 ° C, 95%, fugtighed og 5% CO 2. Vent 24 timer for cellerne til at vedhæfte.
- Gøre en virus cocktail i 15 mL rør, som beskrevet i henvisning 18.
- Tø lentivirus ved 37 ° C i et vand bad. Tilføje 160 µL af en 5 mg/mL proteamine sulfat løsning i Dulbecco ' s ændret Eagle Medium (DMEM) til 8 mL af næringssubstratet (DMEM-LG + 10% FBS) til en endelig koncentration på 100 µg/mL. Vortex for 3 s. Tilføj en virus mangfoldighed af infektion (MOI) af 5 (1. gang optøet) .
- Fjerne medium fra celle kultur kolbe (trin 1.2.1) og tilføje virus cocktailen til cellerne. Der inkuberes i 10 timer ved 37 ° C, luftfugtighed 95% og 5% CO 2.
- Tilsættes 4 mL 100 µg/mL proteamine sulfat i 4 mL af DMEM-LG + 10% FBS og inkuberes i en yderligere 14 h.
- Stoppe transduktion efter 24 timer ved at udskifte med 25 mL af medium (DMEM-LG + 10% FBS).
- Bekræft transduktion effektivitet ved at evaluere mRFP udtryk af flow flowcytometri 18.
Bemærk: Her, hMSCs, der blev transduced med over 65% effektivitet blev brugt. - Udvide cellerne ved at udskifte med 25 mL af frisk medium (DMEM-LG + 10% FBS) to gange om ugen. Kultur cellerne ved 37 ° C, 95%, fugtighed og 5% CO 2. Passage celler, når de når 80% sammenløbet.
- Når det ønskede antal celler er nået, udføre trypsinization pr. trin 1.1.2 - 1.1.4.
- Tæller cellerne og suspendere dem i steril PBS (1 x) i den endelige koncentration af 1 x 10 6 celler/75 µL. hold celler på isen for transport til ultralyd maskine. For eksperimenter, brug hMSCs fra passage numre 2-5.
2. Ultralydsvejledt Intracardiac injektion af hMSCs i den venstre ventrikel
Bemærk: Brug SAMP1/YitFc med etablerede små-tarm inflammation og alder - og køn-matchede RANDIS/J mus for forsøgene. Opretholde SAMP og JONNAS mus under specifikt patogenfrie betingelser, fodre dem standard laboratorium chow og holde dem på 12-h lys/mørke cyklus. Her, blev ultralydsvejledt hjerte injektionerne udført i en dedikeret patogenfrie hjerte ultralyd værelse beliggende i CWRU dyreforskning facilitet, der var desinficeret med et desinfektionsmiddel og skylles med 70% alkohol. Forskning Laboratoriepersonalet skal bære personlige værnemidler, herunder kjoler, ansigtsmasker med eye shields og sterile handsker under de intracardiac injektioner. Kropsvarme af musen skal opretholdes for procedurens varighed.
- Opret ultrasound imaging system før bedøve musen. Denne protokol brug ultralyd maskine designet for musen ekkokardiografi.
- Tænder for magt og initialisere transducer (30 MHz) til at oprette den nye undersøgelse.
- Bedøver mus i en induktion kammer ved hjælp af 3-4% isofluran i 100% ilt på en rate på 0,2 - 0,5 L/min. vedligehold dyret under hele proceduren med 2% isofluran i 100% ilt via en næsen kegle. Bekræfte ordentlig anesthetization inden du udfører billeddannelse ved at klemme tå, rullende musen, og observere manglen bevægelse.
Bemærk: Oftalmologiske salve bør anvendes til øjnene efter induktion af anæstesi til at forhindre hornhinde tørring. Overføre de bedøvede mus til imaging-maskiner (dvs. bioluminescens billedbehandlingssystem og ultralyd), hvor de vil modtage en vedligeholdelsesdosis af bedøvelsesmiddel isofluran. Bestemme anæstesi starttidspunkt og dybde af anæstesi ved at observere en mangel på reaktion på pinches på halen og mund pad hver 10 min for hele varigheden af anæstesi. - Indstillet temperatur af imaging tabel og ultralyd gel til 37 ° C.
- Helt fjerne pels over brystkassen området bedøvede musen bruger Hårfjerningscreme.
- Placer musen på tabellen billedbehandling i liggende stilling og sikre både øvre og nedre lemmer med tape til at undgå krop bevægelse under proceduren. Bruge et elektrokardiogram skærm under proceduren for alle mus.
- Rense huden af brystkassen området med en 10% povidon/jod vatpind efterfulgt af en 70% ethanol vatpind. Påfør et tykt lag af gel til thorax område af musen.
- Montere transduceren i indehaveren og justere dens position indtil venstre hjertekammer er klart synlige på synsfelt.
- Belastning 150 µL af transduced hMSC cellesuspension (2 x 10 6 hMSCs i 150 µL sterilt PBS) i en 1-mL sprøjte med en 28-G nål og sikre sprøjten til passende indehaveren. For at visualisere pulserende blod, holde en lille luft kolonne i sprøjten. For at undgå sammenklumpning, suspendere celler før injektionen.
- Forhånd sprøjte mod mus thorax, justere nålen bane ved hjælp af ultralyd vejledning og indtaste den venstre ventrikel.
- Efter vejledning af ultralyd imaging, trænge sprøjte nål gennem den interkostale rum og ind i venstre hjertekammer musen.
Bemærk: Sprøjte nål tip skal være klart synlige i den venstre ventrikel på ultralydsundersøgelser billedet. Korrekt placering bør bekræftes yderligere ved frisk arterielt blod udstrømning ind i sprøjten. Disse er tegn på en vellykket indsættelse. - Indsprøjtes hMSC cellesuspension meget langsomt over 2 min, anvende blid pressure.
- Efter injektion af suspenderede celler, forsigtigt trække tilbage nål, ren off gel ultralyd og slip musen fra tape begrænsninger.
- Placere dyret i en ny, ren bur med en forvarmet pad.
Bemærk: Efter afslutningen af proceduren, et varmt miljø bør de mus indtil opsving. Overophedning bør undgås, da perifer vasodilatation kompromiser inddrivelse. Mus bør overvåges nøje og holdt isoleret fra andre mus indtil deres fuld helbredelse, anført af deres evne til at opretholde brystbenet recumbency. - Overvåge dyret indtil de opnå fuldstændig helbredelse fra anæstesi og dagligt indtil udgangen af eksperimentet.
3. Bioluminescens (BLI) billeddannelse af hMSCs
- billede mus 24 timer efter intracardiac injektion i bioluminescens imaging system. Start i vivo imaging software. Initialiser den billedbehandlingssystem og åbne en ny undersøgelse.
- I Kontrolpanel, indstille imaging parametre ved at klikke på " sekvens setup. " Vælg i tilstanden imaging " luminescens " og " fotografi. " indstillet eksponering gange fra 0,5 s til 10 min. sat den binning til " medium " og F / stop til " 1. " angiver excitation filteret til " blok " og filteret emission til " open. " indstillet synsfeltet til " C " for to mus. Tilføje opsætningen sekvens til guiden billede ved at klikke på kontrolpanelet erhvervelse.
- Tænd ilt pumpe og sæt isofluran til 2,5% i både induktion kammer og næsen kegle inde i maskinen.
- Indsprøjtes mus i.p. med 300 µL af D-Luciferin (12,5 mg/mL).
- Placere musen i anæstesi induktion kammer.
- Efter 2-3 min, overføre musen til den i vivo billeddannelse kammer, med hovedet i næsen kegle på anæstesi manifold. Anvende optisk salve for at beskytte øjnene under imaging. For at billedet flere mus, bruge sort lys baffel for at undgå refleksion af lys ind på tilstødende mus.
- Klik på den " erhverve " knappen for at starte billede erhvervelse 10 min efter D-Luciferin injektion.
- Gentag trin 3.3-3.5 for at billedet flere mus.
- Efter den i vivo billede erhvervelse, aflive mus af CO 2 inhalation efterfulgt af cervikal dislokation, at bekræfte død. Udføre ex vivo-analyser.
- Hvis ex vivo-analyser er udført efter 20 min, Gentag luciferin injektion (trin 3.3) før du ofrer mus; BLI signal kan nedsætte 20 min efter luciferin injektion.
- Dissekere mus for at fjerne hele mave-tarmkanalen (dvs. fra maven til endetarmen), mesenteriallymfeknuderne lymfeknude (mio.), lunger, milt og lever. Placere dem i petriskåle ved hjælp af saks og pincet 2 , 4.
- Placer petriskålen indeholdende de eksplanterede organer i den billeddiagnostiske afdeling og erhverve BLI billeder pr. trin 3.1-3.6.
- Efter billede erhvervelse, overføre de eksplanterede organer til modellen forme indeholdende optimal opskæring temperatur (OCT) sammensatte. Cryofreeze forme ved-80 ° C ved hjælp af tøris. Udføre Immunhistokemi bruger anti-luciferase antistof på frosne sektioner til at bekræfte tilstedeværelsen af hMSCs 16.
- Til kvantificering af lysintensitet, bruge region af interesse (ROI) værktøjet i tool paletten 16 , 19. Vælg rammen ROI og flytte det til område af interesse på billedet. Klik på " ROI måling " og gemme data i SEQ-filformat. Eksportere dataene som en .txt-fil og bruge statistisk software til at udføre grundlæggende statistiske test for kvantificering 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser, at hMSCs kan være transduced med den tredobbelte reporter på en høj effektivitet, bevare deres stamcelle egenskaber. Transduced hMSCs kan visualiseres i realtid af BLI (figur 1 c, figur 3). Denne roman, ultralydsvejledt injektion af hMSCs i venstre hjertekammer af SAMP mus sikrer en meget høj succesrate af injektion, giver mulighed for hurtig inddrivelse af musene med minimal sygelighed og dødelighed (figur 2). Den gennemsnitlige tid for indsprøjte en mus med hMSCs er ca. 10 min., og mindre end 8-9% sygelighed og dødelighed observeret med denne teknik. Den største årsag til dødelighed er slagtilfælde og hjerte tamponade fra hæmoragisk perikardieeffusion. Ex vivo analyse udført 24 h efter intracardiac (intraarteriel) administrationen af hMSC bekræfter, at denne rute af administration resultater i homing af hMSCs til den betændte tyndtarmen af SAMP mus, i modsætning til inflammation-free styre mus (figur 3 c og D). Desuden hMSCs har tendens til ikke at bo i tyndtarmen af inflammation-free RANDIS mus og begynde at akkumulere eller at blive fanget i lungerne (figur 3B).
Figur 1 . hMSCs kan være Transduced med en høj effektivitet for In Vivo visualisering og med bevarelse af stamceller egenskaber. (A) mikroskopisk billede af transduced hMSCs. Vellykket transduktion af menneskelige MSC'er, som bestemt af mRFP udtryk evalueret med flowcytometri (B) og BLI (C). Transduced hMSCs bevarer stamcelle egenskaber, som bekræftet af differentiering assays, der viser transduced hMSCs evne til at differentiere i chondrocytter, adipocytter og osteoblaster. For en funktionel analyse, blev de keramiske terninger af hydroxyapatit/tricalciumphosphat fosfat matrix implanteret subkutant i immunkompromitterede CB17-Prkdc SCID mus at demonstrere evne til hMSCs at danne ektopisk donor knogle (D). Skalere barer i A = 500 µm. skala barer i C angive enheder af BLI (103 fotoner/s/cm2/steradian). Skalere barer i D = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Instrumenter til ultralydsvejledt injektion. (A) en panoramisk udsigt over instrumenterne: hjertets ultrasound imaging system (rød firkant), transducer monteret i sine rammende indehaver, sprøjte indehaveren og kirurgisk bord med nosecone for anæstesi (grøn firkant) og inhalation anæstesi maskine med induktion kammer (Gul firkant). (B) ultralydsundersøgelser billede af sprøjte nål: nål spids (rød pil) er klart synlig inde den venstre hjertekammer (gul pile). (C) friske arterielt blod udstrømning ind i sprøjten bekræfter den succesfulde indsættelse af sprøjte nål ind i venstre hjertekammer før hMSC administration. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . hMSCs Oversæt til tyndtarmen efter Intracardiac/Intra-arterial Administration i SAMP mus. Repræsentative billeder af 3-4 mus/gruppe, aflivede 24 timer efter injektion, og fra tre uafhængige forsøg er vist. In vivo bioluminescens imaging viser tilstedeværelsen af hMSCs i SAMP og JONNAS mus 24 timer efter injektion (A). Ex vivo analyse i SAMP mus viser, at hMSCs fortrinsvis lokalisere til tyndtarmen (dvs., stedet for betændelse) (D), der henviser til, at de har tendens til at ikke bo i tyndtarmen af betændelse-gratis kontrol RANDIS mus (C). Faktisk, efter den første arteriel passage, hMSCs begynde at akkumulere mere i lungerne af RANDIS mus, i modsætning til SAMP mus (B). En brøkdel af hMSCs kan også påvises i milten, leveren og lungerne af SAMP og JONNAS mus (B, C, D). Skala barer angive enheder af BLI (103 fotoner/s/cm2/steradian). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse beskriver en ny teknik for ultralyd-styrede intracardiac injektion af hMSCs i en lille-tarm musemodel af eksperimenterende CD. Denne teknik har meget høj sats for overlevelse og succes, som bane af nålen kan justeres baseret på real-time, høj opløsning billeder af musen venstre hjertekammer, leveret af ultralyd. Fordelen ved levering til venstre hjertekammer er, at hMSCs fordeles derefter intra-arterially og omgå venøs cirkulation, således at man undgår sammenlægning af cellerne i lungerne. Tidligere blev halspulsåren kateterisation intraarteriel levering brugt til at injicere MSCs16,21. Carotis kateterisation metode indebærer kirurgi til at udsætte halspulsåren for at placere et kateter i arteria. Kateteret er avancerede mod aortabuen transfusion af celler. Kateteret fjernes efterfølgende og halspulsåren forbundet. Denne roman teknik for ultralydsvejledt injektion af MSCs i venstre hjertekammer, i forhold til halspulsåren kateterisation, er mindre invasiv, er meget hurtigere (ca. 10 min/mus versus 60 min./mus), og har mindre sygelighed og dødelighed (< 10% versus 30%). Den kliniske oversættelse af musen ultralydsvejledt intracardiac injektion af hMSCs til humane kliniske forsøg ville være gennem kateterisation af den overlegne mesenteriallymfeknuderne arterie (i øjeblikket udføres til behandling af kronisk mesenteriallymfeknuderne iskæmi og genstridig gastrointestinal blødning) til at levere hMSCs til syge tyndtarmen.
Der er flere overvejelser med hensyn til ændringer og fejlfinding af ultralydsvejledt intracardiac injektion af hMSCs i venstre hjertekammer af mus. Et kritisk aspekt af proceduren mastering brug af ultralyd til at guide injektion nålen ind i venstre hjertekammer. Ligesom enhver procedure, ordentlig uddannelse, praksis og ekspert feedback er vigtige komponenter kan fuldføre denne procedure. Dårlig teknik kan føre til hjerte tamponade fra hæmoragisk perikardieeffusion og død. For at minimere celle sammenklumpning og risikoen for embolisering til hjernen (dvs., slagtilfælde), er det vigtigt at resuspend hMSCs før hver injektion. Før du implementerer denne procedure, er det vigtigt at konsultere dyrlæge med ansvar for den lokale animalske forskningsfacilitet til at modtage ekspert råd. Sikre, at retningslinjer for sikker og effektiv brug af dyr følges for at minimere utilsigtet skade til mus.
For at undersøge biodistribution af hMSCs efter injektion i mus, transduced hMSCs med succes med tredobbelt reporter, med høj effektivitet. Differentiering assays udført påvist transduced hMSCs evne til at differentiere i chondrocytter, adipocytter og osteocytes18. For den osteogenic funktionelle assay, de keramiske terninger af hydroxyapatit/tricalciumphosphat fosfat matrix blev implanteret subkutant i immunkompromitterede SCID mus og viste hMSCs evne til at danne ektopisk donor knogle17,18 . Disse differentiering og funktionelle assays viser, at transduced hMSCs bevarer deres stamcelle egenskaber. Resultaterne af denne undersøgelse viser, at transduced hMSCs anvendes til intracardiac injektion i SAMP mus lokalisere til tyndtarmen, som er stedet for betændelse i SAMP mus. I de tarm inflammation-free RANDIS mus, kun et mindretal af hMSCs lokaliseret til tarmene 24 timer efter injektion, hvilket indebærer, at i mangel af betændelse, forbliver hMSCs ikke i tarmen. Disse data er i overensstemmelse med flere andre undersøgelser, der har vist evne til MSCs til at migrere og indpode på stedet for skade, såsom hjertet i akut myokardieinfarkt22 og sårede BM i en stråling-sårede ben16. Som i andre sygdomme, har den lokale anvendelse af MSC'er til Colon skade modeller vist effekt på mildne betændelse23. I en 2,4,6-trinitrobonzene ethylbenzthiazolinsulfonsyre syre (TNBS) model af colitis i rotter fremskyndet Hayashi et al. injiceres submucosa af rat kolon, BM-afledte MSCs omegn udsat for TNBS, og vist helbredelse af colitis23 .
En nylig undersøgelse foretaget af Manieri et al. anvendte en ny teknik af endoskop-assisteret injektion af Colon MSC'er i den distale colon, stedet for Colon skade i prostaglandin-mangelfuld mus og viste deres effektivitet i at forhindre dannelsen af gennemtrængende sår5. STEMPLET er en model af små-tarmbetændelse, og disse mus udvikler ikke spontan betændelse i deres kolon. Vores laboratorium har udviklet og valideret en endoskopisk metode til evaluering og kvantificering af Colon betændelse og tumor udvikling i mus. Men endoskopisk enheder er ikke købedygtig nå til tyndtarmen i en levende mus24. Pointsystemet kan kun bruges som terminal metode til vurdering af betændelse i SAMP mus efter aktiv dødshjælp. Derfor, metoden endoskopisk er ikke egnet til lokal anvendelse af MSCs i SAMP model. Ved hjælp af denne nye teknik til injektion, kan forbedret lokalisering af MSC'er til tyndtarmen opnås. Om den øgede lokalisering til betændte tyndtarmen vil udmønte sig i øget effektivitet er ikke kendt og vil være i fokus for fremtidige undersøgelser. Ud over modellens SAMP ville ultralydsvejledt injektion af MSCs være en nyttig metode til den forbedrede lokalisering af hMSCs i andre modeller af små tarmbetændelse, såsom TNFΔRE6 murine model af eksperimenterende CD.
BLI er en følsom og praktisk teknik, der kan bruges seriefremstillede til at spore hMSCs i vivo, men det giver ikke mulighed for en præcis kvantificering af hMSC målsøgende. En fordel ved at bruge den tredobbelte reporter-transduced hMSCs i mus er, at enzymet ttk i tredobbelt reporter giver mulighed for flere kvantitative positron emission tomografi (PET) imaging19. Kombinere meget kvantitative PET imaging (med en radiotracer sonde) med en computertomografi (CT) scan (giver lokalisering) giver mulighed for et kvantitativt skøn over antallet af aflægger hMSCs på webstedet syge som gamma tæller er proportional med den antallet af levedygtige hMSCs mærket med ttk-genet. Nøjagtig kvantificering af hMSC lokalisering kan hjælpe med at bestemme procentdelen af hMSCs homing og terapeutiske virkning og vil være i fokus for fremtidige undersøgelser.
Denne teknik, trods sine mange fordele, har nogle begrænsninger: i) kravet om en dyre hjerte ultrasound imaging system for mus, ii) den dødelighed og sygelighed forbundet med intracardiac injektion, og iii) den manglende evne til at blive brugt til den langsom infusion (dvs.m > over timer) af celler og andre molekyler. På trods af disse begrænsninger har det mange fordele over den nuværende teknik af halspulsåren kateterisation for intraarteriel injektion af hMSCs, som fremhævet ovenfor.
Afslutningsvis, påvise resultaterne af denne undersøgelse effektiviteten og bekvemmelighed af ultralydsvejledt injektion teknikken til at forbedre lokalisering af hMSCs til webstedet af betændelse i SAMP modellen af eksperimenterende CD. Fremtidige undersøgelser vil bestemme, hvis den øgede homing af hMSCs af intraarteriel levering kan føre til øget terapeutiske effekt i modeller af små-tarmbetændelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Maneesh Dave understøttes af Department of Defense grant PR141774 og Crohns og Colitis Foundation of America karriere udvikling Award. Laboratoriet af Fabio Cominelli understøttes af NIH tilskud DK042191 (FC), DK055812 (FC), DK091222 (FC) og DK07948 (FC). Laboratoriet for Arnold Caplan er delvist understøttet af L. David og E. Virginia Baldwin Foundation. De finansielle organer spillede ingen rolle i undersøgelse analyse eller skrivning af manuskriptet. Dens indhold er udelukkende ansvarlig for forfatterne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-LG | Gibco | 31600-091 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25-200-072 | |
| Proteamine Sulfate | Sigma Aldrich | P4020-1G | |
| D-Luciferin | Goldbio | luck-500 | |
| Fetal Bobine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 175 cm tissue cutlure flasks | Corning | 431080 | |
| 75 cm tissue cutlure flasks | Corning | 430720 | |
| Centrifuge tubes | Crysalgen | 23-2265 | |
| Tissue-Plus O.C.T. compound | Fisher HealthCare | 4585 | |
| Cryomold Standard | Tissue-Tek | 4557 | |
| Lenti-Pac HIV Expression Packaging System | GeneCopoeia | HPK-LvTR-20 | |
| Povidone Ionidine swabs | Medline | MDS093901 | |
| Hair removal cream | Nair | N/A | |
| Isoflurane | Piramal Helathcare | NDC 66794 013 25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Aquasonic 100 ultrasound transmission gel | Parker laboratories | 01 08 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SAMP mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| AKR mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| Vevo 770 imaging system | Visual Sonics, Toronto, Canada | ||
| IVIS spectrum series system | PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Living image software | CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Triple reporter | Kindly provided by Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (citation 19) |
References
- Duijvestein, M., et al. Pretreatment with interferon-gamma enhances the therapeutic activity of mesenchymal stromal cells in animal models of colitis. Stem Cells. 29 (10), 1549-1558 (2011).
- Sala, E., et al. Mesenchymal Stem Cells Reduce Colitis in Mice via Release of TSG6, Independently of Their Localization to the Intestine. Gastroenterology. 149 (1), 163-176 (2015).
- Gonzalez, M. A., Gonzalez-Rey, E., Rico, L., Buscher, D., Delgado, M. Adipose-derived mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis by inhibiting inflammatory and autoimmune responses. Gastroenterology. 136 (3), 978-989 (2009).
- Dave, M., et al. Stem cells for murine interstitial cells of cajal suppress cellular immunity and colitis via prostaglandin e2 secretion. Gastroenterology. 148 (5), 978-990 (2015).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. J. Clin. Invest. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).
- Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. N. Engl. J. Med. 361 (21), 2066-2078 (2009).
- Dave, M., Papadakis, K. A., Faubion, W. A. Immunology of inflammatory bowel disease and molecular targets for biologics. Gastroenterol. Clin. North Am. 43 (3), 405-424 (2014).
- Dave, M., et al. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Inflammatory Bowel Disease: A Systematic Review and Meta-analysis. Inflamm. Bowel Dis. 21 (11), 2696-2707 (2015).
- Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), (2016).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Gao, J., Dennis, J. E., Muzic, R. F., Lundberg, M., Caplan, A. I. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. Cells Tissues Organs. 169 (1), 12-20 (2001).
- English, K. Mechanisms of mesenchymal stromal cell immunomodulation. Immunol Cell Biol. 91 (1), 19-26 (2013).
- Pizarro, T. T., et al. SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn's disease-like ileitis. Inflamm. Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).
- Lennon, D. P., Caplan, A. I. Isolation of human marrow-derived mesenchymal stem cells. Exp. Hematol. 34 (11), 1604-1605 (2006).
- Lin, P., et al. Serial transplantation and long-term engraftment of intra-arterially delivered clonally derived mesenchymal stem cells to injured bone marrow. Mol. Ther. 22 (1), 160-168 (2014).
- Dennis, J. E., Caplan, A. I. Porous ceramic vehicles for rat-marrow-derived (Rattus norvegicus) osteogenic cell delivery: effects of pre-treatment with fibronectin or laminin. J. Oral Implantol. 19 (2), 106-115 (1993).
- Lin, P., et al. Efficient lentiviral transduction of human mesenchymal stem cells that preserves proliferation and differentiation capabilities. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 886-897 (2012).
- Love, Z., et al. Imaging of mesenchymal stem cell transplant by bioluminescence and PET. PET. J. Nucl. Med. 48 (12), 2011-2020 (2007).
- Haynesworth, S. E., Goshima, J., Goldberg, V. M., Caplan, A. I. Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow. Bone. 13 (1), 81-88 (1992).
- Ishizaka, S., et al. Intra-arterial cell transplantation provides timing-dependent cell distribution and functional recovery after stroke. Stroke. 44 (3), 720-726 (2013).
- Schenk, S., et al. Monocyte chemotactic protein-3 is a myocardial mesenchymal stem cell homing factor. Stem Cells. 25 (1), 245-251 (2007).
- Hayashi, Y., et al. Topical implantation of mesenchymal stem cells has beneficial effects on healing of experimental colitis in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326 (2), 523-531 (2008).
- Kodani, T., et al. Flexible colonoscopy in mice to evaluate the severity of colitis and colorectal tumors using a validated endoscopic scoring system. J. Vis. Exp. (80), e50843 (2013).
