Summary
Sequential extraction du sel de protéines chromatiniennes lié est un outil utile pour déterminer les propriétés de liaison de complexes protéiques importantes. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer le rôle des sous-unités individuelles ou des domaines de l’affinité globale d’une protéine complexe en bloc de la chromatine.
Abstract
Élucider les propriétés de liaison de ciblage de la chromatine des protéines peut être très difficile en raison de la nature complexe de la chromatine et l’hétérogénéité des mammifères plus complexes modification de la chromatine. Afin de surmonter ces obstacles, nous avons adapté un test d’extraction séquentielle du sel (SSE) permettant d’évaluer les affinités de liaison relative de la chromatine lié aux complexes. Ce dosage facile et simple peut être utilisé par des non-spécialistes pour évaluer la différence relative affinité de deux complexes apparentés, les changements dans l’affinité d’un complexe quand une sous-unité est perdue ou d’un domaine individuel est inactivé et le changement de affinité de liaison après modification du paysage de la chromatine. Séquentiellement, re-suspension en vrac la chromatine en augmentant les quantités de sel, nous sommes en mesure de profil l’élution d’une protéine particulière de la chromatine. À l’aide de ces profils, nous sommes en mesure de déterminer l’incidence des altérations dans un complexe de modification de la chromatine ou modifications de l’environnement de la chromatine sur des interactions de liaison. SSE de couplage avec d’autres dosages in vitro et in vivo , nous pouvons déterminer les rôles des domaines individuels et des protéines sur les fonctionnalités d’un complexe à une variété d’environnements de chromatine.
Introduction
Règlement de l’ADN dans les cellules eucaryotes est un système complexe et sophistiqué qui est étroitement contrôlé par un assortiment de protéines que coordonner les réactions aux stimuli intracellulaires et extracellulaires. ADN est enroulé autour d’histone octamères aux nucléosomes forme, qui peuvent être plus ou moins répartis le long de l’ADN ou compactés en serpentins serré1. Cet arrangement structurels de l’ADN et les histones est connu comme la chromatine, qui est régulée par un réseau de protéines que lire, écrire et effacer les modifications post traductionnel (PTM) histones2. Certaines histones SPTM, tels que l’acétylation, changer la charge de l’acide aminé, ils sont déposés sur, modifier les interactions entre les histones et ADN2. Histone SPTM service aussi à recruter des régulateurs transcriptionnels, rénovateurs de la chromatine, machines de réparation des dommages ADN et machinerie de réplication de l’ADN à des régions spécifiques du génome3.
La plupart des méthodes pour étudier les interactions de la chromatine soit sonder les interactions à petite échelle ou impliquent de grandes analyses Génome-large. Études in vitro de liaison utilisent souvent des domaines individuels recombinants peptides histone ou ADN dans les essais comme les essais de déplacement de mobilité électrophorèse (EMSA), la calorimétrie isotherme de titration, polarisation de fluorescence et peptide pulldowns. Parce que ces tests se concentrent généralement sur un domaine de protéines individuelles, ils facilitent la compréhension d’un petit morceau du puzzle, mais ne nous permettent pas de comprendre la nature coopérative de protéines multi-domaine, sans parler de leur rôle en multi-protéines complexes. Une autre couche de complexité est ajoutée par la composition hétérogène de mammifères plus complexes modification de la chromatine. Cette hétérogénéité de protéine, en combinaison avec le caractère dynamique du paysage la chromatine, rend difficile de récapituler in vivo liant les interactions des protéines chromatiniennes à chromatine in vitro.
Méthodes in vivo ont fait des progrès considérables ; Cependant, ils sont souvent coûteux, chronophages et techniquement difficiles. Immunoprécipitation de la chromatine suivie par séquençage (ChIP-seq) est très utile pour déterminer la localisation des protéines et des modifications d’histone au sein du génome, mais il nécessite une optimisation importante4. Les protéines sont souvent réticulé à la chromatine de préserver des interactions ; Toutefois, cela peut produire des interactions artificielles et peut causer épitope masquant5. En outre, l’immunoprécipitation (IP) exige des anticorps hautement spécifiques et vaste optimisation des ADN cisaillement IP conditions par ChIP-qPCR en utilisant un site de liaison connue, ce qui n’est souvent pas disponible a priori. Après l’optimisation des conditions de la puce, traitement des échantillons est coûteuse et nécessite quelques semaines ou mois de séquencer et d’analyser. Bien que cette méthode est précieuse pour identifier la localisation de la chromatine lié protéines au sein du génome, le coût et engagement en temps rendre prohibitifs pour utiliser cette méthode pour générer des hypothèses sur comment les petits changements peuvent affecter des propriétés de liaison de global .
Dans cet article, nous décrivons comment un test d’extraction séquentielle du sel (SSE) peut être utilisé pour examiner les profils de liaison globale des protéines liées à la chromatine et distinguer comment des changements dans un profil PTM protéine complex ou global peuvent modifier les interactions. Bien que les extractions sels sont une technique couramment et largement utilisée, nous démontrons comment cette méthode séquentielle est hautement reproductible et polyvalent. SSE permet de caractériser la façon dont une seule sous-unité d’un immeuble ou même un seul domaine contribue à affinité globale du complexe de la chromatine globale. SSE permet également de déterminer si la liaison d’une protéine est influencée par les changements dans le paysage de la chromatine, fournissant des hypothèses intéressantes pour histone marque ciblant qui peuvent être confirmés à l’aide de ChIP-seq et autres études large de génome.
Nous avons initialement adapté cette méthode de Wu et al., d’examiner la fonction de Polybromo1 (PBRM1) dans la liaison de la PBAF la chromatine rénovateur6,7. En utilisant cette technique, nous avons déterminé le rôle de PBRM1 pour la liaison de la chromatine dans la chromatine PBAF complexe de remodelage et ensuite déterminer la contribution relative des six BROMODOMAINES individuels à cette fonction7.
Nous décrivons ici comment optimiser cette méthode pour explorer la liaison de la chromatine dans différents types de cellules, pour évaluer l’affinité relative de chromatine semblable modification complexes, afin d’examiner le déplacement d’une protéine de la chromatine par un inhibiteur chimique, et pour déterminer les effets de la liaison de la chromatine après modification du paysage de la chromatine.
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Protocol
1. préparations
- préparer 100 mL d’une solution hypotonique tampon AR. : 0,3 M saccharose, KCl 60 mM, 60 mM Tris pH 8,0, 2 mM EDTA et 0,5 % NP-40. Conserver à 4 ° c.
Remarque : Certaines lignées cellulaires, tels que HEK293T, nécessitent des conditions moins strictes de lyse. Si les noyaux lyse facilement, utiliser modification tampon A: 25 mM HEPES pH 7,6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 0,05 mM EDTA, 0,1 % NP-40 et 10 % de glycérol. - Préparer une solution 250 mL de solution de 2 x mRIPA : 100 mM Tris pH 8,0, désoxycholate de sodium 2 % NP-40 et 0,5 %.
- Préparer une solution de 5 M de NaCl 100 mL.
- à l’aide de la x mRIPA et les solutions de 5 M de NaCl, 2 préparer 50 mL de solution de x mRIPA 1 pour chacune des six concentrations sels : 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM et 500 mM NaCl. Avant de commencer l’expérience, refroidir toutes les solutions sur glace
- Grow cell lines dans conditions souhaitées.
Remarque : Pour déterminer les effets de faire tomber une protéine, SSE pour la ligne de coup de masse doit être comparée aux cellules de type sauvage. Ces SSE doit être exécutés en parallèle. Pour obtenir des exemples utilisant des inhibiteurs chimiques ou des stimuli, reportez-vous aux sections 3-5.
2. Base Extraction séquentielle du sel
- récolte 8 millions de cellules de chaque État et laver deux fois avec 5 mL de PBS froid glace.
Remarque : Il est essentiel de disposer d’un nombre égal de cellules présentent des concentrations de protéines équivalente. Le nombre exact de cellules devrez peut-être être optimisé pour les lignées de cellules individuelles ou des protéines particulières. Il est important de ne pas avoir trop, car l’augmentation des concentrations de protéines va empêcher l’observation de la courbe de l’élution, qui dépend de la liaison de l’équilibre. Toutefois, avec trop peu de cellules il y a peut-être pas suffisamment de protéines pour détecter la courbe et le culot de la chromatine est plus difficile à isoler et peut être perdu entre fractions. - Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de tampons A + inhibiteurs de la protéase, transvaser dans des tubes à centrifuger micro 1,5 mL et tournent dessus plus bas à 4 ºC pendant environ 10 minutes
- Isoler les noyaux par centrifugation à 6000 x g pendant 5 min à 4 ° c.
NOTE : Après cette étape de l’enveloppe nucléaire soit encore intact. Si l’enveloppe nucléaire est intact, le culot va remettre en suspension entièrement ; Cependant, quand l’enveloppe est lysé et la chromatine est libérée, le pellet ne sera pas remettre en suspension. Si l’enveloppe nucléaire n’est pas intacte après incubation de tampons A, utilisez modifié tampon A.
Inhibiteurs de la - Ajouter 200 µL de mRIPA 0 mM NaCl + protéase à chaque boulette de noyaux avant de re-suspendre pellet. Homogénéiser chaque échantillon de pipetage 15 fois avec une pipette de 1 mL. Le culot doit réactiver facilement, cependant, les noyaux lyseront car il est reversé, et l’échantillon deviendra épaisse et collante et difficile à pipeter.
- Afin d’élaborer le culot dans la pointe, tapez sur le bout de l’embout de la pipette contre le fond du tube à centrifuger. Les granulés se dissoudront pas entièrement une fois que l’ADN est libéré par les noyaux, mais pipetage il cassera vers le haut
- Lorsque tous les échantillons ont été homogénéisés, Incuber tous les échantillons sur glace pendant 3 min.
Remarque : Le temps d’incubation devrez peut-être être optimisée en fonction de la protéine d’intérêt. - Pellet isolat de la chromatine en centrifugeant les échantillons pendant 3 min à 6500 x g à 4 ° c.
- Transfert surnageant dans une centrifugeuse propre 1,5 mL tube. Il s’agit de la fraction de 0 mM. Cette solution de mRIPA 0 mM peut agir comme un pas de lavage à la lyse des noyaux et supprimer tout protéines lâches ne pas associées à la chromatine. Inhibiteurs de la
- Ajouter 200 µL de mRIPA 100 mM NaCl + protéase à chaque boulette de chromatine avant de re-suspendre pellet. Briser le culot de la chromatine en pipettant également, le culot et descendre 15 fois.
Remarque : Il est essentiel d’être cohérent avec le nombre de fois le culot en éjectant. - Incuber sur glace pendant 3 min. Cette étape d’incubation permet à tous les échantillons d’atteindre un état d’équilibre, qui est particulièrement important lorsqu’il y a plusieurs échantillons.
- Centrifugeuse à 6500 x g pendant 3 min à 4 ºC et transférez surnageant dans un tube propre de 1,5 mL.
- Répéter 2.6-2.10 pour les autres concentrations salines.
Remarque : Après 400 mM NaCl, mRIPA le culot doit être claire et gloopy et ne restera pas au fond du tube. Le plomb peut être placé dans le couvercle de la tube à centrifuger pendant le surnageant isolé. - Ajouter 70 µL de 4 x chargement protéine teindre à chaque fraction et charger 30 µL de chaque fraction sur un gel d’acrylamide SDS pour analyse par western blot.
Remarque : Pour déterminer le profil de liaison de la protéine, il est essentiel de charger des volumes équivalents de concentrations de lysat, plutôt que de charger des protéines égale. - Effectuer un transfert western standard par le transfert sur une membrane et d’utiliser des anticorps primaires pour des protéines d’intérêt.
- Pour doser la protéine éluée de la chromatine, incuber la tache en anticorps secondaires de fluorescence infrarouge IRDye et tache d’image avec un imageur. Alors que les autres méthodes de développement peuvent être utilisées, nous vous recommandons de fluorescence ou l’imagerie infrarouge, car c’est plus de nature quantitative.
- Utilisation ImageJ ou un logiciel similaire pour calculer l’intensité pour la protéine éluée à chaque concentration de sel. En traçant la courbe l’intensité de la bande contre la concentration de sel, le profil d’élution de votre protéine d’intérêt peut être déterminé.
3. Sequential Extraction du sel en présence d’un " lecteur " inhibiteur
- récolter les deux ensembles de cellules (4 millions) et d’isoler les noyaux comme un SSE standard.
- Remettre en suspension les deux ensembles dans 200 µL de mRIPA 0 mM NaCl et incuber pendant 3 min. Cela permettra la suppression de toute protéine libre dans les noyaux.
- Ajouter 200 µL mRIPA 0 mM NaCl pour chaque boulette. Ajouter l’inhibiteur (2 µL de 1 mM (+) JQ1) à un échantillon et DMSO à l’ensemble de la commande.
- Agiter le culot de pipetage 15 fois et incuber sur glace pendant 5 min.
- Centrifugeuse à 6500 x g pendant 3 min à 4 ºC et transférez surnageant dans un tube propre de 1,5 mL.
- Répétez 3.3-4 pour toutes les concentrations de sels et d’effectuer un transfert western standard.
4. Sequential Extraction du sel en présence d’un " écrivain " inhibiteur
- traiter les cellules avec l’inhibiteur (10 µM SAHA) ou le DMSO pendant 3 h
- Récolte 4 millions de cellules pour chaque traitement.
- Effectuer un SSE standard pour les échantillons avec l’inhibiteur ajouté à tous les tampons.
5. Sel Sequential Extraction suivant DNA Damage
- traiter les cellules avec 1 doxorubicine µM pour 1 h.
- Modifier les médias sur les cellules et leur permettre de récupérer pendant 3 h.
- Récolte 8 millions de cellules et d’effectuer la base SSE.
6. Extraction du sel non séquentiel
- récolter 12 millions de cellules et laver avec du PBS.
- Diviser les cellules afin qu’il y a 2 millions de cellules par tube à centrifuger micro.
- Remettre en suspension dans 500 µL de tampons A et incuber pendant 10 min.
- Isoler les noyaux par centrifugation à 6000 x g.
- Une nouvelle suspension pastilles dans un 200 µL de chacune des tampons mRIPA + NaCl.
- Homogénéiser chaque échantillon de pipetage 15 fois avec une pointe de pipette de 1 mL.
- Incuber sur glace pendant 3 min.
- Isoler la chromatine par centrifugation à 6500 x g et transférer le surnageant pour nettoyer les tubes. Ajouter 70 µL de colorant de chargement et exécuter 30 µL sur un gel SDS-page pour analyse par western blot.
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Representative Results
Dans cet article, nous montrons les avantages et les applications de la méthode d’extraction du sel séquentielle couramment utilisés (SSE) que nous nous sommes adaptés de la littérature6. Dans la Figure 1, on compare la reproductibilité du SSE pour extraire des protéines non séquentielle en détectant les profils d’élution des ARID1a et PBRM1. Nous observons constamment que ARID1a, une sous-unité de la BAF, élue surtout à 200 mM NaCl et PBRM1, une sous-unité PBAF exclusive, élue principalement à 300 mM NaCl. Figure 1 a montre trois répétitions indépendantes de SSE avec 8 millions de cellules OVCA429. Figure 1 b montre une extraction du sel non séquentiel où les noyaux isolés des cellules de 2 millions ont été remises en suspension dans un tampon salin unique. Même si les deux méthodes concluent que ARID1a élue à 200 mM et PBRM1 élue à 300 mM, le SSE produit un profil de liaison bien défini et permet une distinction claire de la liaison de ces deux complexes. En outre, dans la méthode non séquentiel, la quantité de protéine éluée dans les tampons de 400 mM et 500 mM NaCl est inférieure à la 300 mM et est incompatible entre les trois répétitions. Bien que ce problème peut être résolu avec l’optimisation de la vitesse de centrifugation et de temps d’incubation, ce qui montre l’avantage de la reproductibilité de SSE.
Par le biais de notre optimisation, nous avons constaté que les autres complexes de chromatine peuvent exiger plus de temps pour être élue. Dans la Figure 2, nous démontrons que l’activateur de la transcription, PBAF, élue de chromatine constamment entre les petites entreprises avec des temps de 3 min et 10 min d’incubation. En revanche, l’élution de la répresseur transcriptionnel, Polycomb répressif complexe 1 (PRC1), indiquée par BMI-1, requiert un temps d’incubation plus longs à être libéré de la chromatine,8. Ce phénomène pourrait être due à PRC1 localisé en plus compactes et plus inaccessibles des régions du génome, ou pourrait être due à la cinétique de liaison différentielle pour les deux complexes.
Après optimisation pour une protéine particulière, les petites entreprises peuvent être utilisés pour étudier l’évolution de la force de liaison aux protéines dans des conditions différentes. SSE permet d’étudier l’efficacité d’un inhibiteur d’interactions protéine-protéine. Pour illustrer ce concept, nous avons utilisé (+) JQ1, qui est un inhibiteur du côté du BRD4, d’examiner comment elle altérée BRD4 liaison (Figure 3 a)9. Nous avons isolé les noyaux des cellules 4 millions de OVCA429. Pour supprimer un BRD4 indépendant, un lavage initial 0 mM a porté sur les deux échantillons. Puis un étalon que SSE a été réalisée avec le DMSO ou 1 µM (+) JQ1 ajouté à chaque fraction. Des échantillons ont été incubés pendant 5 min. Nous observons que BRD4 élue plus tôt en présence de l’inhibiteur par rapport au DMSO. Pour prouver que (+) JQ1 est spécifique pour les BRD4, nous avons effacé pour ARID1a et ne vu aucun changement d’élution (Figure 3 b).
Ensuite, nous avons examiné comment la liaison aux protéines peut être modifiée lorsque le paysage de la chromatine est modifié. BRD4 contient deux BROMODOMAINES qui reconnaissent des résidus lysine acétylée sur histone queues10. Pour augmenter le niveau de l’acétylation des histones, nous avons traité des cellules OVCA429 avec 10 µM de l’histone désacétylase inhibiteur suberanilohydroxamic l’acide (SAHA) pendant 3 h SAHA (10 µM) a été ajouté à tous les tampons au cours de l’ETI. En augmentant les niveaux de l’acétylation d’histone global, nous avons observé une augmentation BRD4 de liaison (Figure 4 a). Lorsque éponger pour ARID1a, nous observons une liaison plus serrée du ARID1a ainsi, qui n’est pas surprenant, parce que les sous-unités de la BAF complexe, tels que BRG1, BRM et BRD9, contiennent tous les BROMODOMAINES10,11 (Figure 4 b).
Enfin, pour montrer comment SSE peut être utilisé pour regarder comment la liaison aux protéines change lorsque les cellules expérience altérations génomiques, nous avons induit double brin cassures de l’ADN avec l’inhibiteur de la topoisomérase II, doxorubicine12. Nous avons traité cellules HEK293T avec 1 µM de la doxorubicine pendant une heure et a permis de récupérer pendant trois heures, les cellules. Après avoir effectué la SSE, nous avons effacé pour PBRM1, qui est impliqué dans l’ADN des dommages réparation13. Nous avons observé deux pics pour la liaison de PBRM1 : 1 ã 300 mM et 1 500 mm NaCl (Figure 5). Ceci suggère que la partie de la population PBRM1 s’impose normalement, mais un sous-ensemble de PBRM1 est plus étroitement lié à la suite de dommages à l’ADN de chromatine. Il s’agit d’un exemple d’utilisation de SSE d’examiner comment les interactions de la chromatine sont modifiées en réponse à différents stimuli externes.
Figure 1 : Non séquentiel par rapport aux extractions séquentielles de sels dans les cellules de OVCA429
A) immuno-Blot et la quantification des trois indépendants réplique des profils d’élution ARID1a et PBRM1 par la méthode d’extraction séquentielle du sel. B) par immunoblot et la quantification des trois répétitions indépendantes des profils d’élution ARID1a et PBRM1 dans la méthode d’extraction du sel non séquentiel. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Comparaison des temps d’incubation des profils d’élution PBAF et PRC1
A) Comparaison des profils d’élution PBAF (PBRM1) avec des temps d’incubation de 3 à 10 minutes. B) Comparaison des PRC1 profils d’élution (IMC-1) avec des temps d’incubation de 3 à 10 minutes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Efficacité du (+) JQ1 sur inhibant la liaison BRD4
A) modèle élution de BRD4 en présence de 1 µM (+) JQ1 par rapport au témoin de DMSO dans les cellules OVCA429. B) profil d’élution de ARID1a en présence de 1 µM (+) JQ1 par rapport au témoin de DMSO dans les cellules OVCA429. Intensité de la bande est indiquée pour 0 mM 500 mM fraction avec le DMSO ou (+) JQ1.
Figure 4 : Modifications dans la liaison lorsque la chromatine paysagée est modifiée
A) Comparaison d’élution de la BRD4 de OVCA429 des cellules traitées avec 10 µM SAHA pendant 3 heures par rapport au traitement de DMSO. B) profils d’élution de ARID1a de OVCA429 des cellules traitement 10 µM SAHA par rapport au DMSO. Intensité de la bande est indiquée pour la fraction de 0 à 500 mM avec le DMSO ou SAHA. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Modifications dans la liaison de PBRM1 après des dommages à l’ADN
Résulats de la SSE PBRM1 liaison de cellules HEK293T traitement avec 1 µM doxorubicine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Caractérisation des interactions de protéine et la chromatine par extractions sels est une méthode commune qui a été employée pendant des décennies14,15; Toutefois, il n'a pas été systématiquement optimisée avant de révéler son utilité complète. Nous montrons comment cette méthode séquentielle fournit un moyen rapid et peu coûteux de distinguer les changements dans la liaison de la chromatine, lorsque la protéine ou l’environnement est modifié. SSE est très adaptable et optimisable, et surtout, il est techniquement simple et ne nécessite aucun équipement spécialisé. Sont les principaux aspects qui doivent être optimisés avant de commencer : compter le nombre de cellules, les conditions de tampon hypotonique et temps d’incubation.
L’aspect le plus important du nombre de cellules, c’est qu’il est cohérent entre tous les échantillons. Lorsque vous regardez des complexes de la BAF, à l’aide de 8 millions de cellules donne un bon profil de comment ces complexes sont contraignantes ; Toutefois, le nombre de cellules (ou la quantité de mémoire tampon) peut devoir être ajustée selon l’abondance de la protéine d’intérêt. Il est important de noter qu’en utilisant moins de cellules est difficile parce qu’à 400 mM et 500 mM NaCl, il est difficile de visualiser le culot de la chromatine. Il est essentiel de s’assurer que le plomb n’est pas transféré avec le surnageant après 400 mM NaCl.
Afin d’évaluer avec précision les protéines nucléaires, les noyaux doivent rester intacts jusqu'à ce qu’ils sont lysées avec 0 mM NaCl mRipa solution. De nombreuses solutions hypotoniques couramment utilisées sont trop dures pour les lignées de cellules comme les cellules HEK293T et HeLa. Pour ces lignées cellulaires, il est recommandé d’utiliser le tampon mis à jour le A.
Enfin, le temps d’incubation peut varier selon l’expérience. Pour les sous-unités de la BAF, le profil d’élution ne change pas entre 3 min et 10 min d’incubation ; Toutefois, l’élution du complexe PRC1 change radicalement selon combien de temps les échantillons sont incubés. En outre, lorsqu’on évalue l’effet d’un inhibiteur sur la liaison de sa cible, le temps d’incubation peut devez être optimisé selon la cinétique de l’inhibiteur.
Lors de l’exécution de l’expérience, il est important d’être aussi cohérente que possible avec le traitement des échantillons. Pour chacune des fractions, le tampon salin devrait être ajouté à chaque échantillon avant homogénéisation afin que chaque échantillon est également exposée. Le point de pipetage est de briser la libération de la chromatine et aide les protéines liées. Il est important de s’assurer que le diabolo passe à travers l’embout de la pipette. Surtout lorsque vous utilisez un plus grand nombre de cellules, la pastille de la chromatine est difficile de passer à travers de l’embout de la pipette les premières fois. Nous avons trouvé qu’un pourboire de 1 mL fonctionne le mieux pour ce faire, comme avec taraudage mineure de la pointe contre le fond du tube micro centrifugeuse, nous sommes en mesure de dresser le culot dans la pointe. Après avoir passé le culot de la chromatine par la pointe une quinzaine de fois, le culot doit déplace par le biais de la pointe, bien qu’il se dissoudra pas. Après incubation des échantillons sur la glace et isoler la chromatine par centrifugation, éliminer le surnageant avec une pointe de pipette 200 µL permet une élimination maximale sans perturber la pastille de la chromatine.
Bien que SSE exige cohérence technique, il est simple et direct et peut être exécutée avec des ressources communes de laboratoire. Il est important de noter que le vrai pouvoir de cette méthode est quand il est couplé avec d’autres examens phénotypiques. Par exemple, en utilisant cette technique, nous avons comparé les profils de liaison de PBRM1 lors de chacune de ses six BROMODOMAINES ont été muté, nous avons déterminé que toutes sauf une les BROMODOMAINES étaient impliqués dans la liaison de la PBRM1 à divers degrés,7. Curieusement, nous avons constaté que les BROMODOMAINES qui étaient les plus importantes pour la liaison sont également essentiels pour PBRM1 régulation de l’expression génique et contrôle de la prolifération cellulaire7. Nous avons validé également les modifications dans la liaison de ces mutants à un locus génomique discret par quantitative ChIP-qPCR7.
Nous avons montré que quelques exemples de comment cette technique peut être utilisée pour étudier les interactions de protéine-chromatine ; Cependant, dans notre laboratoire, nous avons trouvé que le SSE est un outil polyvalent pour enquêter sur un large éventail de questions concernant les protéines de lecteur de la chromatine. En combinaison avec d’autres analyses, cette technique facilite notre capacité élucider les fonctionnalités des composants comprenant élaborer des complexes protéiques. En comprenant l’importance des domaines individuels, nous pouvons identifier qu’ils soient des cibles thérapeutiques potentielles pour le développement d’un inhibiteur qui bloque l’association de la chromatine.
Nous avons démontré comment SSE peut être développé pour évaluer l’efficacité d’un inhibiteur de petites molécules sur la liaison aux protéines de la chromatine. En outre, en inhibant les écrivains épigénétiques et gommes à effacer, SSE peut déterminer la relation entre les niveaux PTM et protéines de lecteur. Nous avons aussi montré que le SSE peut être utilisé pour déterminer les changements dans la liaison en réponse à des stimuli externes tels que les dommages à l’ADN. S’il s’agit d’une technique simple, lorsqu’il est appliqué dans bonnes conditions, il peut avancer considérablement notre connaissance de la chromatine et ses protéines régulatrices.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une bourse de chercheur de V (V2014-004) et un érudit V plus award (D2016-030) de la Fondation de V pour la recherche sur le Cancer et un American Cancer Society institutionnels Research Grant (subvention de IRG ACS 58-006-53) vers le centre de l’Université de Purdue pour Cancer Recherche. E. G. P. était accompagnée d’une bourse de dotation supérieure Borch au département de pharmacologie moléculaire et chimie médicinale de la Purdue University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
References
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