Summary
Extração de sal sequencial das proteínas da cromatina vinculada é uma ferramenta útil para determinar as propriedades de vinculação de grandes complexos de proteínas. Esse método pode ser empregado para avaliar o papel das subunidades individuais ou domínios na afinidade total de uma proteína complexa em massa de cromatina.
Abstract
Elucidação das propriedades de ligação de proteínas da cromatina-direcionamento pode ser muito desafiador devido à natureza complexa da cromatina e a heterogeneidade dos mamíferos mais complexos de cromatina-modificando. Para superar estes obstáculos, adaptámos um ensaio de extração de sal sequencial (SSE) para avaliar as afinidades de ligação relativo dos complexos ligados a cromatina. Este ensaio fácil e simples pode ser usado por não-especialistas para avaliar a diferença relativa na vinculação afinidade de dois complexos relacionados as mudanças na afinidade de um complexo quando uma subunidade é perdida ou um domínio individuais é inativado e a mudança na afinidade de ligação após alterações à paisagem da cromatina. Suspendendo sequencialmente re-cromatina em massa no aumento da quantidade de sal,... somos capazes de perfil de eluição de uma proteína específica da cromatina. Usando esses perfis, somos capazes de determinar como as alterações em um complexo de cromatina-modificando ou alterações no ambiente de cromatina afetam as interações de ligação. SSE de acoplamento com outros ensaios in vitro e em vivo , podemos determinar os papéis de domínios individuais e proteínas sobre a funcionalidade de um complexo em uma variedade de ambientes de cromatina.
Introduction
Regulamento de ADN em células eucarióticas é um sistema complexo e sofisticado que é rigidamente controlado por uma variedade de proteínas que coordenar as respostas aos estímulos intracelulares e extracelulares. DNA é acondicionada em torno do histone octamers para os nucleossomas formulário, que podem ser livremente distribuídos ao longo do DNA ou compactados em bobinas apertado1. Este arranjo estrutural do DNA e histonas é conhecido como cromatina, que é regulada por uma rede de proteínas que ler, escrever e apagar post modificações translacional (PTM) em histonas2. Alguns histona PTMs, tais como a acetilação, mudar a carga de aminoácidos que são depositados, alterando as interações entre histonas e DNA2. Histona PTMs servem também para recrutar reguladores transcricionais, empresas de reestruturação da cromatina, maquinaria de reparo de dano de DNA e maquinaria de replicação do DNA para regiões específicas do genoma3.
A maioria dos métodos para o estudo de interações de cromatina ou sonda interações de pequena escala ou envolvem grandes análises de todo o genoma. Estudos de ligação in vitro , frequentemente, utilizam domínios individuais recombinantes com peptídeos de histona ou DNA, em ensaios, tais como ensaios de turno electroforese mobilidade (EMSA), Calorimetria de Titulação Isotérmica, polarização de fluorescência e peptídeo pulldowns. Porque estes ensaios geralmente se concentram em um domínio de proteínas individuais, eles facilitam a compreensão de uma pequena peça do puzzle, mas não nos permitem compreender a natureza cooperativa de proteínas de vários domínios, muito menos seu papel em várias proteínas complexos. Outra camada de complexidade é adicionada pela composição heterogênea dos mamíferos mais complexos de cromatina-modificando. Esta heterogeneidade de proteína, em combinação com a natureza dinâmica da paisagem da cromatina, torna desafiador para recapitular o na vivo vinculando interações de proteínas da cromatina a cromatina em vitro.
Métodos in vivo têm feito avanços significativos; no entanto, eles são muitas vezes caro, demorado e tecnicamente desafiador. Imunoprecipitação da cromatina, seguida por sequenciamento (ChIP-seq) é muito útil para determinar a localização de proteínas e modificações do histone através do genoma, porém requer substancial otimização4. As proteínas são frequentemente quitosana a cromatina para preservar as interações; no entanto, isto pode produzir interações artificiais e pode causar o epítopo mascaramento5. Além disso, as moleculas (IP) requerem anticorpos altamente específicos e otimização extensiva de DNA cisalhamento e condições IP por ChIP-qPCR usando um sítio de ligação conhecida, que muitas vezes não é disponível a priori. Após a otimização das condições de ChIP, processamento das amostras é dispendioso e requer várias semanas ou meses para sequenciar e analisar. Embora este método é inestimável para identificar a localização da cromatina ligado proteínas através do genoma, o custo e compromisso de torná-lo proibitivo para usar esse método para gerar hipóteses sobre como pequenas mudanças podem afetar Propriedades de associação global .
Neste artigo, descrevemos como um ensaio de extração de sal sequencial (SSE) pode ser usado para examinar os perfis de ligação global de proteínas da cromatina-limite e distinguir como as alterações em uma proteína, complexo, ou global PTM perfil podem alterar interações. Apesar de extração de sal é uma técnica comum e amplamente utilizada, demonstraremos como esse método sequencial é altamente reprodutível e versátil. SSE nos permite caracterizar como uma única subunidade de um complexo ou até mesmo um único domínio contribui para afinidade geral do complexo da cromatina em massa. SSE pode também ser usado para determinar se a ligação de uma proteína é influenciada pelas alterações na paisagem de cromatina, fornecendo hipóteses interessantes para o direcionamento de marca de histona que podem ser confirmados usando ChIP-seq e outros estudos de ampla do genoma.
Adaptamos, originalmente, esse método de Wu et al., para examinar a função de Polybromo1 (PBRM1) na ligação do PBAF cromatina remodeler6,7. Usando esta técnica, determinou o papel de PBRM1 para ligação de cromatina dentro a cromatina PBAF remodelação complexa e determinado a contribuição relativa das seis bromodomains individuais para esta função7.
Aqui descrevemos como otimizar esse método para explorar a ligação da cromatina em diferentes tipos de células, para avaliar a afinidade obrigatória relativa da cromatina semelhante modificando complexos, para examinar o deslocamento de uma proteína de cromatina por um inibidor químico, e para determinar os efeitos da ligação de cromatina após alterações à paisagem da cromatina.
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Protocol
1. preparações
- preparar 100 mL de solução hipotônica Buffer r.: 0,3 M de sacarose, o 60 mM KCl, 60 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA e 0,5% NP-40. Loja a 4 ° c.
Nota: Algumas linhas celulares, tais como HEK293T, exigem condições menos rigorosas de Lise. Se núcleos lyse facilmente, utilize d. modificado Buffer r: 25 mM HEPES pH 7,6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 0,05 mM EDTA, 0,1% NP-40 e 10% de glicerol. - Prepare uma solução stock de 250 mL de solução de x mRIPA 2: pH de Tris 100mm 8.0, 2% NP-40 e 0,5% de sódio Deoxycholate do.
- Preparar um 100 mL de solução de NaCl 5 de M.
- Usando o x mRIPA 2 e soluções de NaCl 5m, preparar 50 mL de solução de x mRIPA 1 para cada uma das seis sal concentrações: 0 mM, 100mm, 200mm, 300mm, 400mm e 500 mM de NaCl. Antes de iniciar o experimento, cool todas as soluções na Ice. Linhas sob condições desejadas de células
- crescer.
Nota: Ao determinar os efeitos de derrubando uma proteína, SSE para a linha "knockdown" deve ser comparado com sua células. Estes SSE deve ser executadas lado a lado. Para obter exemplos usando inibidores químicos ou estímulos, consulte seções 3-5.
2. Extração de sal sequencial básica
- colheita 8 milhões de células de cada condição e lavar duas vezes com 5 mL de PBS frio gelo.
Nota: É fundamental ter igual número de células que possuem concentrações de proteína equivalente. O número exato de células pode precisar de ser otimizado para linhas de célula individual ou proteínas específicas. É importante não ter muitos, como o aumento nas concentrações de proteína impedirá a observação da curva de eluição, que depende de ligação do equilíbrio. No entanto, com muito poucas células não pode haver proteína suficiente para detectar a curva, e a pelota de cromatina é mais difícil de isolar e podem ser perdidos entre fracções. - Ressuspender as células em 1 mL de tampão A + inibidores da protease, transferir para tubos de centrífuga de micro de 1,5 mL e top giram sobre inferior a 4 ° c durante 10 min.
- Isolar os núcleos por centrifugação a 6000 x g por 5 min a 4 ° c.
Nota: Após esta etapa o envelope nuclear ainda deve estar intacto. Se o envelope nuclear está intacto, a pelota re-irá suspender totalmente; no entanto, quando o envelope é lysed e a cromatina é liberada, a pelota não irá re-suspender. Se o envelope nuclear não está intacto após incubação de tampão A, usar modificado A. Buffer
Inibidores de - Adicionar 200 µ l de mRIPA 0 mM NaCl + protease cada pellet de núcleos antes de re-suspender o sedimento. Homogeneizar a amostra cada pipetando 15 vezes com uma pipeta de 1 mL. A pelota deve Ressuspender facilmente, no entanto, os núcleos serão lyse como ele é pipetado e a amostra se tornará espesso e pegajoso e difícil de colocar.
- a fim de elaborar a pelota na ponta, toque final da ponta da pipeta contra o fundo do tubo. A pelota não irá dissolver totalmente uma vez que o DNA é liberado do núcleo, mas pipetagem quebrará cima
- Quando todas as amostras têm sido homogeneizadas, incubar todas as amostras no gelo por 3 min.
Nota: O tempo de incubação pode precisar de ser otimizada dependendo da proteína de interesse. - Pellet de cromatina isolado por centrifugação das amostras por 3 min a 6500 x g a 4 ° c.
- Transferência de sobrenadante para uma centrífuga limpa 1,5 mL tubo. Esta será a fração de 0 mM. Esta solução de mRIPA de 0 mM pode atuar como uma etapa de lavagem para lise dos núcleos e remover qualquer proteínas soltas não associadas com cromatina. Inibidores de
- Adicionar 200 µ l de mRIPA 100 mM NaCl + protease cada pellet de cromatina antes de re-suspender o sedimento. Romper a pelota de cromatina pipetando a pelota e descer 15 vezes.
Nota: É fundamental para ser consistente com o número de vezes que a pelota em pipetado. - Incubar no gelo por 3 min. Esta etapa de incubação permite que todas as amostras alcançar um estado de equilíbrio, que é particularmente importante quando existem múltiplos exemplos.
- Centrifugar 6500 x g por 3 min a 4 ° c e transferência sobrenadante para um tubo limpo 1,5 mL.
- Repetir 2.6-2.10 para as concentrações de sal restantes.
Nota: Após 400 mM NaCl, mRIPA a pelota deve ser clara e como e não vai ficar no fundo do tubo. O sedimento pode ser colocado na tampa do tubo de centrífuga enquanto o sobrenadante isolado. - Adicionar 70 µ l de 4x do carregamento de proteína tingir de cada fração e carregar 30 µ l de cada fração em um gel do acrilamido do SDS para análise ocidental do borrão.
Nota: Para determinar o perfil de ligação da proteína, é fundamental para carregar volumes equivalentes das concentrações de proteína igual lisado, ao invés de carregamento. - Realizar um western blot padrão transferindo para uma membrana e usar os anticorpos primários para proteínas de interesse.
- Para dosar a proteína eluída da cromatina, incubar o borrão em anticorpos secundários de fluorescência infravermelho IRDye e borrão de imagem com uma câmera. Enquanto podem ser utilizados outros métodos de desenvolvimento, nós recomendamos fluorescência ou imagiologia por infravermelhos, como é mais quantitativa na natureza.
- Uso ImageJ ou software similar para calcular a intensidade para a proteína eluída em cada concentração de sal. Pela representação gráfica da intensidade da banda contra a concentração de sal, pode ser determinado o padrão de eluição de sua proteína do interesse.
3. Extração de sal sequencial na presença de um " leitor " inibidor
- colheita dois conjuntos de células (4 milhões) e isolar os núcleos como um padrão SSE.
- Re-suspender ambos os conjuntos em 200 µ l de mRIPA 0 mM NaCl e incubar durante 3 min. Isso permitirá que a remoção de qualquer proteína livre nos núcleos.
- Adicionar 200 µ l mRIPA 0 mM de NaCl para cada pellet. Adicionar o inibidor (2 µ l (+) JQ1 a 1 mm) de uma amostra e DMSO para o conjunto de controle.
- Agitar o sedimento por pipetagem 15 vezes e incubar no gelo por 5 min.
- Centrifugar 6500 x g por 3 min a 4 ° c e transferência sobrenadante para um tubo limpo 1,5 mL.
- Repetir 3.3-4 para todas as concentrações de sal e realizar um western blot padrão.
4. Extração de sal sequencial na presença de um " escritor " inibidor
- tratar as células com o inibidor (10 µM SAHA) ou DMSO por 3 h.
- Colher células 4 milhões para cada tratamento.
- Realizar um SSE padrão para as amostras com o inibidor adicionado para todos os buffers.
5. Sequencial sal extração seguinte dano do ADN
- tratar células com 1 doxorrubicina µM por 1 h.
- Alterar os meios de comunicação sobre as células e lhes permitem recuperar para 3h.
- Colher 8 milhões de células e executar o SSE básico.
6. Extração de sal não-sequencial
- colher 12 milhões de células e lave com PBS.
- Dividir células que existem 2 milhões de células por tubo de centrífuga micro.
- Ressuspender em 500 µ l de tampão A e incubar durante 10 min.
- Isolar os núcleos por centrifugação a 6000 x g..
- Re-suspender aglomerados em um 200 µ l de cada um dos buffers de mRIPA + NaCl.
- Homogeneizar cada amostra pipetando 15 vezes com uma ponta de pipeta de 1 mL.
- Incubar no gelo por 3 min.
- Isolar a cromatina por centrifugação a 6500 x g e transferir o sobrenadante para limpar os tubos. Adicionar 70 µ l de corante a carregar e executar 30 µ l em um gel de SDS-page para análise ocidental do borrão.
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Representative Results
Neste artigo, vamos demonstrar as vantagens e aplicações do método comumente usados extração sequencial de sal (SSE) que nós adaptamos do literatura6. Na Figura 1, comparamos a reprodutibilidade do SSE para extrair proteínas não sequencial, detectando os padrões de eluição de ARID1a e PBRM1. Consistentemente, observamos que ARID1a, uma subunidade BAF, elutes principalmente em 200 mM NaCl e PBRM1, uma subunidade PBAF exclusiva, elutes principalmente a 300 mM de NaCl. A Figura 1a mostra três repetições independentes de SSE com 8 milhões de células de OVCA429. Figura 1b retrata uma extração de sal não-sequencial onde núcleos isolados de 2 milhões de células foram re-suspensos em um único buffer de sal. Embora ambos os métodos concluem que ARID1a elutes em 200mm e PBRM1 elutes a 300mm, SSE produz um perfil de ligação bem definidas e permite uma distinção clara da ligação destes dois complexos. Além disso, o método não-sequencial, a quantidade de proteína eluída nos buffers de NaCl de 400 mM e 500 mM é inferior a 300 mM e é inconsistente entre as três repetições. Embora esse problema pode ser resolvido com mais otimização de velocidade de tempo e centrifugação de incubação, isto ilustra a vantagem de reprodutibilidade de SSE.
Através da nossa otimização, achamos que outros complexos de cromatina podem exigir mais tempo para ser eluídos. Na Figura 2, podemos demonstrar que o ativador transcricional, PBAF, elutes de cromatina consistentemente entre Zee com tempos de incubação de 3 min e 10 min. Em contraste, a eluição do transcricional repressor, Polycomb 1 complexo repressivas (PRC1), indicada pela BMI-1, requer um tempo de incubação para ser liberado de cromatina8. Este fenômeno pode ser devido a PRC1 sendo localizado em regiões mais compactas e inacessíveis do genoma, ou poderia ser devido à cinética de ligação diferencial para os dois complexos.
Após a otimização para uma proteína particular, Zee pode ser usado para estudar como a força de ligação às proteínas é alterado em condições diferentes. SSE pode ser usado para examinar a eficácia de um inibidor de interações da proteína-proteína. Para demonstrar este conceito, utilizamos o (+) JQ1, que é um inibidor de bromodomain de BRD4, para examinar como ele alterado BRD4 ligação (Figura 3a)9. Estamos isolados de núcleos de células de OVCA429 4 milhões. Para remover qualquer BRD4 não acoplado, realizou-se uma lavagem inicial 0 mM em ambas as amostras. Em seguida, uma norma que SSE foi realizada com DMSO ou 1 µM (+) JQ1 adicionado para cada fração. As amostras foram incubadas por 5 min. Observamos que BRD4 elutes anteriormente na presença de inibidor em comparação com DMSO. Para mostrar que (+) JQ1 é específico para BRD4, nós apagados para ARID1a e não vi nenhuma mudança na eluição (Figura 3b).
Em seguida, examinamos como o emperramento da proteína pode ser alterado quando a paisagem da cromatina é modificada. BRD4 contém dois bromodomains que reconhecer resíduos de lisina acetilado em caudas de histona10. Para aumentar o nível de acetilação da histona, tratámos de células OVCA429 com 10 µM de histona deacetilase inibidor suberanilohydroxamic ácido (SAHA) por 3 h. SAHA (10 µM) foi adicionado para todos os buffers durante o SSE. Ao aumentar os níveis de acetilação da histona global, observamos um aumento na BRD4 de ligação (figura 4a). Quando a mancha para ARID1a, observamos a vinculação mais apertada de ARID1a, bem como, que não é surpreendente porque subunidades do complexo, como BRG1, BRM e BRD9, o BAF todos contêm bromodomains10,11 (figura 4b).
Por último, para expor como SSE pode ser usado para olhar como o emperramento da proteína muda quando células experimentam alterações genômicas, induzimos quebras de DNA encalhadas dobro com o inibidor de topoisomerase II, doxorrubicina12. Nós tratados HEK293T células com 1 µM de doxorrubicina por uma hora e permitido células para recuperar durante três horas. Depois de executar o SSE, estamos destruídos por PBRM1, que está envolvida no DNA de reparação de danos13. Observamos dois picos para ligação de PBRM1: uma para 300 mM e uma de 500 mM de NaCl (Figura 5). Isto sugere que uma parte da população PBRM1 é obrigatório normalmente, mas um subconjunto de PBRM1 é mais rigidamente vinculado a cromatina seguindo o dano do ADN. Este é apenas um exemplo de como usar SSE para examinar como interações de cromatina são alteradas em resposta a diferentes estímulos externos.
Figura 1: Não-sequencial em comparação com extrações sal sequenciais em células OVCA429
A) Immunoblots e quantificação de independente de três Replica de perfis de eluição ARID1a e PBRM1 pelo método de extração de sal sequencial. B) Immunoblots e quantificação de três repetições independentes de perfis de eluição de ARID1a e PBRM1 no método de extração de sal não-sequencial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Comparação dos tempos de incubação de perfis de eluição PBAF e PRC1
A) comparação dos perfis de eluição PBAF (PBRM1) com tempos de incubação de 3 e 10 minutos. B) a comparação de PRC1 perfis de eluição (IMC-1) com tempos de incubação de 3 e 10 minutos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Eficácia do (+) JQ1 em inibir a ligação BRD4
A) padrão de eluição de BRD4 na presença de 1 µM (+) JQ1 em relação ao controle de DMSO em células OVCA429. B) perfil de eluição de ARID1a na presença de 1 µM (+) JQ1 em relação ao controle de DMSO em células OVCA429. Intensidade da banda é indicada para 0 mM - fração de 500 mM com DMSO ou (+) JQ1.
Figura 4: Alterações na ligação quando cromatina ajardinada é modificada
A) comparação da eluição de BRD4 de OVCA429 células tratadas com 10 µM SAHA por 3 horas em relação ao tratamento de DMSO. B) perfis de eluição de ARID1a de OVCA429 células trataram µM with10 SAHA comparado com DMSO. Intensidade da banda é indicada para fração mM 0-500 mM com DMSO ou Santos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Alterações na ligação de PBRM1 depois de dano do ADN
SSE resultados para ligação de PBRM1 de HEK293T células tratadocom com 1 µM doxorrubicina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Caracterização das interações da proteína e cromatina através da extração de sal é um método comum que tem sido utilizado por décadas de14,15; no entanto, isso não foi sistematicamente otimizado antes de revelar sua utilidade completa. Vamos demonstrar como este método sequencial fornece uma maneira rápida e barata de distinguir entre alterações na ligação de cromatina quando a proteína ou o ambiente é alterado. SSE é altamente adaptável e otimizável e importante, é tecnicamente simples e exige nenhum equipamento especializado. São os principais aspectos que precisam ser otimizadas antes de começar: começando o número do celular, tampão hipotônica condições e tempo de incubação.
O aspecto mais importante do número do celular é que é consistente entre todas as amostras. Quando se olha para complexos de BAF, usando células 8 milhões dá um bom perfil de como estes complexos são obrigatórias; no entanto, o número de células (ou a quantidade de buffer) pode precisar ser ajustada dependendo da abundância da proteína de interesse. É importante notar que usar menos células é um desafio porque é difícil de visualizar a pelota de cromatina em 400 mM e 500 mM de NaCl. É vital para garantir que o sedimento não é transferido com o sobrenadante após 400 mM de NaCl.
Para avaliar com precisão as proteínas nucleares, os núcleos devem permanecer intacto até eles lysed com 0 mM NaCl mRipa solução. Muitas soluções hipotônicas comumente usadas são ásperas demais linhas de células como as células HEK293T e HeLa. Para estas linhas de celular, é aconselhável usar o tampão modificado A.
Finalmente, o tempo de incubação pode variar dependendo da experiência. Para subunidades BAF o padrão de eluição não muda entre um 3 min e 10 min de incubação; no entanto, a eluição do complexo PRC1 altera drasticamente dependendo de quanto tempo as amostras são incubadas. Além disso, ao avaliar o efeito de um inibidor da ligação de seu alvo, o tempo de incubação pode precisar ser otimizada dependendo da cinética de inibidor.
Ao realizar o experimento, é importante ser tão consistente quanto possível com o tratamento das amostras. Para cada fração, o buffer de sal deve ser adicionado para cada amostra antes da homogeneização, para que cada amostra é igualmente exposta. O ponto de pipetagem é interromper o lançamento de cromatina e ajuda as proteínas acopladas. É importante se certificar de que a pelota passa a ponta da pipeta. Especialmente quando se utiliza um maior número de células, a pelota de cromatina é um desafio para passar a ponta da pipeta nas primeiras vezes. Achamos que uma dica de 1ml funciona melhor para isso, como com menor batida da ponta contra o fundo do tubo de centrífuga micro, somos capazes de elaborar a pelota na ponta. Depois de passar a pelota de cromatina pela ponta quinze vezes, a pelota deve percorrer suavemente a ponta, embora não se dissolverá. Após a incubação as amostras no gelo e isolando a cromatina por centrifugação, remover o sobrenadante com uma ponta de pipeta 200 µ l permite a máxima remoção sem interromper a pelota de cromatina.
Embora SSE requer consistência técnica, é simples, direta e podem ser executada com recursos de laboratório comuns. É importante notar que o verdadeiro poder deste método é quando está acoplada com outros exames fenotípica. Por exemplo, usando esta técnica, comparamos os perfis de ligação de PBRM1, quando cada um dos seus seis bromodomains foram uma mutação, determinamos que todos os bromodomains estavam envolvidos na ligação de PBRM1 para diferentes graus7. Curiosamente, descobrimos que o bromodomains que foram as mais importantes para vinculação também foram essenciais para PBRM1 regulação da expressão gênica e controle de proliferação celular7. Nós também validado as alterações na ligação dos mutantes para um locus genômico discreto pelo quantitativo ChIP-qPCR7.
Mostramos apenas alguns exemplos de como esta técnica pode ser usada para estudar as interações proteína-cromatina; no entanto, em nosso laboratório, nós encontramos que o SSE é uma ferramenta versátil para investigar um vasto leque de perguntas sobre a cromatina leitor de proteínas. Em combinação com outras análises, essa técnica facilita nossa capacidade elucidar a funcionalidade dos componentes compreendendo estas elaborar complexos da proteína. Compreendendo a importância dos domínios individuais, podemos identificar se eles são alvos terapêuticos para o desenvolvimento de um inibidor que bloqueia a associação de cromatina.
Nós demonstramos como SSE pode ser expandido para avaliar a eficácia de um inibidor de pequena molécula na ligação às proteínas a cromatina. Além disso, inibindo escritores epigenéticas e borrachas, SSE pode determinar a relação entre os níveis PTM e proteínas do leitor. Também mostramos que o SSE pode ser usado para determinar as alterações na ligação em resposta a estímulos externos, tais como danos ao DNA. Embora esta é uma técnica simples, quando aplicado em condições adequadas, isso pode extremamente aumentar o nosso conhecimento da cromatina e suas proteínas reguladoras.
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Disclosures
Os autores têm sem interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por um prêmio de estudioso de V (V2014-004) e um estudioso V plus award (D2016-030) da Fundação para pesquisa do câncer de V e um americano câncer sociedade institucional bolsa de investigação (ACS IRG Grant 58-006-53) para o centro da Universidade de Purdue para câncer Pesquisa. E. G. P. foi apoiado pelo prêmio Borch pós doação ao departamento de farmacologia Molecular e Química Medicinal de Universidade de Purdue.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
References
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