Summary
Sekventiell salt utvinning av kromatin bundna proteiner är ett användbart verktyg för att fastställa bindande egenskaper för stora proteinkomplex. Denna metod kan användas för att utvärdera enskilda subenheter eller domäner i den övergripande affinitet av ett proteinkomplex bulk kromatin roll.
Abstract
Förtydligandet av kromatin-targeting proteiners bindande egenskaper kan vara mycket utmanande på grund av den komplicerade karaktären av kromatin och mest däggdjur kromatin-ändra komplex heterogena karaktär. För att övervinna dessa hinder, har vi anpassat en sekventiell salt extraktion (SSE) analys för att utvärdera de relativa bindande tillhörighet av kromatin-bundet komplex. Denna enkelt och okomplicerat analys kan användas av icke-experter för att utvärdera den relativa skillnaden i bindande affinitet av två relaterade komplex, förändringar i affinitet av ett komplex när en subenhet går förlorad eller en enskild domän är inaktiverat och förändringen i bindningsaffinitet efter ändringar av kromatin landskapet. Genom att sekventiellt åter avbryta bulk kromatin i ökande mängder av salt, har vi möjlighet att profilera elueringen av ett visst protein från kromatin. Med hjälp av dessa profiler, har vi möjlighet att avgöra hur förändringar i ett kromatin-ändra komplex eller förändringar kromatin miljön påverka bindande interaktioner. Koppling SSE med andra in vitro och in-vivo -analyser, kan vi bestämma enskilda domäner och proteiner på funktionaliteten i ett komplex i en mängd olika kromatin miljöer roller.
Introduction
DNA förordning i eukaryota celler är en invecklad och sofistikerade system som styrs hårt av ett sortiment av proteiner som samordna Svaren till intracellulär och extracellulär stimuli. DNA är virad runt Histon octamers att bilda nucleosomes, som kan vara löst fördelade längs DNA eller packas in i snäva spolar1. Detta strukturella arrangemang av DNA och histoner som kallas kromatin, som regleras av ett nätverk av proteiner som läsa, skriva och radera inlägget translationella modifieringar (PTM) på histoner2. Vissa Histon PTMs, såsom acetylering, ändra avgiften av den amino syran de sätts på, att förändra samspelet mellan histoner och DNA2. Histon PTMs också fungera att rekrytera transkriptionell regulatorer, kromatin remodelers, DNA skador reparation maskiner och DNA-replikering maskiner till specifika regioner i genomet3.
De flesta metoder för att studera kromatin interaktioner antingen sond småskaliga interaktioner eller involvera stora genome-wide analyser. In vitro studier utnyttjar ofta enskilda rekombinant domäner med Histon peptider eller DNA analyser som elektrofores rörlighet Skift analyser (EMSA), isotermiska titrering calorimetry, fluorescence polarization och peptid pulldowns. Eftersom dessa analyser fokuserar oftast på en enskild protein domän, de underlätta förståelsen av en liten pusselbit, men tillåter inte oss att förstå den kooperativa typ av multi-domän proteiner, för att inte tala om deras roll i flera protein komplex. Ytterligare ett lager av krångliga läggs av den heterogena sammansättningen av mest däggdjur kromatin-ändra komplex. Detta protein heterogenitet, gör i kombination med den dynamiska karaktären av kromatin landskapet, det utmanande för att sammanfatta den i vivo bindande interaktioner av kromatin proteiner till kromatin in vitro.
In vivo -metoder har gjort betydande framsteg; men är de ofta dyrt, tidskrävande och tekniskt utmanande. Kromatin immunoprecipitation följt av sekvensering (ChIP-seq) är mycket användbart för att bestämma localizationen av proteiner och Histon ändringar hela genomet, men det kräver betydande optimering4. Proteiner är ofta tvärbundna till kromatin att bevara interaktioner; men detta kan producera konstgjorda interaktioner och kan orsaka epitop maskering5. Dessutom kräver immunoprecipitations (IP) mycket specifika antikroppar och omfattande optimering av DNA klippning och IP tillstånd av ChIP-qPCR med hjälp av en känd bindningsställe, vilket ofta inte tillgängliga förhand. Efter optimering av ChIP villkor, bearbetning av proverna är kostsamma och kräver flera veckor till månader för att sekvensera och analysera. Även denna metod är ovärderlig för att identifiera lokaliseringen av kromatin bundna proteiner hela genomet, kostnaden och tid engagemang gör det oöverkomliga att använda denna metod för att generera hypoteser om hur små förändringar kan påverka globala bindande boenden .
I den här artikeln beskriver vi hur en sekventiell salt extraktion (SSE) analysen kan användas för att undersöka globalt bindande profiler av kromatin-bundna proteiner och särskilja hur förändringar i en protein, komplexa eller global PTM profil kan ändra interaktioner. Även salt extraktioner är ett vanligt och allmänt använd teknik, visar vi hur denna sekventiell metod är mycket reproducerbara och mångsidig. SSE tillåter oss att karakterisera hur en enda del av ett komplex eller ens en enda domän bidrar till anläggningens totala affinitet för bulk kromatin. SSE kan också användas för att avgöra om bindningen av ett protein påverkas av förändringar i kromatin landskap, som ger intressanta hypoteser för Histon mark inriktning som kan bekräftas med hjälp av ChIP-seq och andra genome bred studier.
Vi ursprungligen anpassat denna metod från Wu et al., pröva funktionen av Polybromo1 (PBRM1) i bindningen av PBAF kromatin remodeler6,7. Med denna teknik, vi bestäms rollen av PBRM1 för kromatin bindande inom PBAF kromatinet remodeling complex och sedan bestäms de sex enskilda bromodomains till denna funktion7relativa bidrag.
Här beskriver vi hur man kan optimera denna metod för att utforska kromatin bindande i olika celltyper, att bedöma det relativa affinitet av liknande kromatin ändra komplex, för att undersöka förskjutningen av ett protein från kromatin genom en kemiska hämmare, och att fastställa effekterna av kromatin bindande efter ändringar av kromatin landskapet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparat
- förbereda 100 mL hypoton lösning buffert A: 0,3 M sackaros, 60 mM KCl, 60 mM Tris pH 8,0, 2 mM EDTA, och 0,5% NP-40. Butik vid 4 °.
Obs: Vissa cellinjer, såsom HEK293T, kräver mindre stränga lyseringslösning villkor. Om kärnor lysera enkelt, använda modifierade buffert A: 25 mM HEPES pH 7,6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 0,05 mM EDTA, 0,1% NP-40, och 10% glycerol. - Förbereda 250 mL stamlösning av 2 x mRIPA lösning: 100 mM Tris pH 8,0, 2% NP-40, och 0,5% natriumdeoxikolat.
- Förbereda 100 mL stamlösning 5 M NaCl.
- Med 2 x mRIPA och 5 M NaCl lösningar, bereda 50 mL 1 x mRIPA lösning för varje av de sex salt koncentrationerna: 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM och 500 mM NaCl. Före start experimentet, cool alla lösningar på ice.
- Växa cellinjer önskade villkor.
Obs: När de fastställer effekterna av knacka ner ett protein, SSE för knockdown raden måste jämföras med vildtyp celler. Dessa SSE måste utföras sida vid sida. Exempel använder kemiska hämmare eller stimuli, se avsnitt 3-5.
2. Grundläggande sekventiell Salt utvinning
- skörd 8 miljoner celler av varje skick och tvätta två gånger med 5 mL is kallt PBS.
Obs: Det är viktigt att ha lika många celler ha motsvarande protein koncentrationer. Det exakta antalet celler kan behöva optimeras för enskilda cellinjer eller särskilda proteiner. Det är viktigt att inte ha för många, eftersom ökningen av protein koncentrationer förhindrar att observation av eluering kurvan, som är beroende av equilibriumen bindande. Men med för få celler det kanske inte finns tillräckligt med protein att upptäcka kurvan och kromatin pelleten är svårare att isolera och kan förloras mellan fraktioner. - Resuspendera cellerna i 1 mL buffert A + proteashämmare, överföra till 1,5 mL centrifugrör som micro, och rotera topp över botten vid 4 ° c i 10 min.
- Isolera atomkärnor genom centrifugering vid 6000 x g under 5 minuter vid 4 °.
Obs: Efter detta steg kärn kuvertet ska fortfarande vara intakt. Om kärn kuvertet är intakt, kommer pelleten återsuspendering fullt ut. men när kuvertet är lyserat och kromatinet är släppt, kommer pelleten inte återsuspendering. Om kärn kuvertet inte är intakt efter buffert A inkubation, använda modifierade buffert A. - Tillsätt 200 µL mRIPA 0 mM NaCl + proteas hämmare till varje atomkärnor pellet innan vi åter avbryter pellet. Homogenisera varje prov genom pipettering 15 gånger med 1 mL pipett. Pelleten bör återsuspendering enkelt, dock atomkärnor kommer lyse som det är pipetteras och provet blir tjock och klibbig och svår att Pipettera.
- För att dra upp pelleten i spetsen, tryck på slutet av pipettspetsen mot botten av centrifugröret. Pelleten löses inte fullt när DNA släpps från atomkärnor, men pipettering kommer att bryta upp
- När alla prover har varit homogeniserad, inkubera alla prover på is för 3 min.
Obs: Inkubationstiden kan behöva optimeras beroende på proteinet av intresse. - Isolera kromatin pellets av centrifugering proverna för 3 min vid 6500 x g vid 4 °.
- Överför supernatanten till en ren 1,5 mL Centrifugera röret. Detta kommer att vara 0 mM fraktionen. Denna 0 mM mRIPA lösning kan fungera som en TVÄTTNINGSSTEGET till lysis atomkärnor och ta bort eventuella lösa proteiner som inte är associerad med kromatin.
- Tillsätt 200 µL mRIPA 100 mM NaCl + proteas hämmare till varje kromatin pellet innan vi åter avbryter pellet. Bryta upp kromatin pelleten genom pipettering pelleten upp och ner 15 gånger.
Obs: Det är viktigt att vara konsekvent med antalet gånger pelleten i pipetteras. - Inkubera på is för 3 min. Detta INKUBERINGSSTEGET tillåter alla prover att nå en jämvikt stat, vilket är särskilt viktigt när det finns flera prover.
- Centrifugera vid 6500 x g under 3 minuter vid 4 ° c och överför supernatanten till en ren 1,5 mL tub.
- Upprepa 2.6-2.10 för de återstående salt koncentrationerna.
Obs: Efter 400 mM NaCl, mRIPA pelleten bör vara tydliga och gloopy och kommer inte att bo på botten av röret. Pelleten kan placeras i locket till centrifugröret medan supernatanten isolerade. - Lägga till 70 µL av 4 x protein lastning färga till respektive fraktion och lasta 30 µL av varje del till en SDS akrylamid gel för western blot analys.
Obs: För att fastställa bindande profilen av protein, är det viktigt att ladda motsvarande volymer av lysat, snarare än lastning lika protein koncentrationer. - Utföra en standard western blot genom att överföra till ett membran och använda primära antikroppar för proteiner av intresse.
- Att kvantifiera det protein som elueras från kromatinet, inkubera blot i IR fluorescence IRDye sekundära antikroppar och bild blot med en imager. Medan andra metoder för utveckling kan användas, vi rekommenderar fluorescens eller infraröd imaging, eftersom det är mer kvantitativ natur.
- Användning ImageJ eller liknande programvara för att beräkna stödnivån för det protein som elueras vid varje koncentration av salt. Av grafritande bandet intensiteten mot Saltkoncentrationen, eluering mönstret av ditt protein av intresse kan fastställas.
3. Sekventiell Salt utvinning i närvaro av en " läsare " hämmare
- skörda två uppsättningar av celler (4 miljoner) och isolera atomkärnor som i en standard SSE.
- Återsuspendering båda uppsättningarna i 200 µL mRIPA 0 mM NaCl och inkubera i 3 min. Detta gör det möjligt för avlägsnande av alla gratis protein i atomkärnor.
- Tillsätt 200 µL mRIPA 0 mM NaCl till varje pellet. Lägg till hämmaren (2 µL av 1 mM (+) JQ1) till ett prov och DMSO till de kontroll.
- Agitera pelleten genom pipettering 15 gånger och inkubera på is för 5 min.
- Centrifugera vid 6500 x g under 3 minuter vid 4 ° c och överför supernatanten till en ren 1,5 mL tub.
- Upprepa 3.3-4 för alla de salt koncentrationerna och utföra en standard western blot.
4. Sekventiell Salt utvinning i närvaro av en " författare " hämmare
- behandla celler med hämmaren (10 µM SAHA) eller DMSO för 3 h.
- Skörd 4 miljoner celler för varje behandling.
- Utföra en standard SSE för prover med hämmaren tillsätts alla buffertar.
5. Sekventiell Salt utvinning följande DNA-skador
- behandla celler med 1 µM doxorubicin för 1 h.
- Ändra media på cellerna och tillåta dem att återhämta sig för 3 h.
- Skörda 8 miljoner celler och utför de grundläggande SSE.
6. Icke-sekventiella Salt utvinning
- skörda 12 miljoner celler och tvätta med PBS.
- Klyftan cellerna, så att det finns 2 miljoner celler per mikro centrifugrör.
- Återsuspendering i 500 µL buffert A och inkubera i 10 min.
- Isolera atomkärnor genom centrifugering vid 6000 x g.
- Återsuspendering pellets i en 200 µL av varje av mRIPA buffertar + NaCl.
- Homogenisera varje prov genom pipettering 15 gånger med en 1 mL pipettspetsen.
- Inkubera på is för 3 min.
- Isolera kromatinet genom centrifugering vid 6500 x g och överför supernatanten för att rengöra tuber. Lägg till 70 µL av lastning färgämne och kör 30 µL på en SDS-page gel för western blot analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta papper visar vi fördelar och tillämpningar av metoden ofta används sekventiell salt extraktion (SSE) som vi har anpassat från litteratur6. I figur 1jämför vi reproducerbarheten för SSE att utvinna proteiner icke-sekventiellt genom att upptäcka de eluering mönster av ARID1a och PBRM1. Konsekvent observerar vi att ARID1a, en BAF subenhet, eluerar primärt vid 200 mM NaCl och PBRM1, en exklusiv PBAF-subenhet, eluerar primärt på 300 mM NaCl. Figur 1a visar tre oberoende replikat av SSE med 8 miljoner OVCA429 celler. Figur 1b skildrar en icke-sekventiella salt utvinning var atomkärnor isolerade från 2 miljoner celler var åter svävande i en enskild salt buffert. Även om båda metoderna slutsatsen att ARID1a eluerar vid 200 mM och PBRM1 eluerar vid 300 mM, SSE producerar ett väldefinierat bindande profil och möjliggör en tydlig åtskillnad av bindningen av dessa två komplex. Dessutom i den icke-sekventiella metoden, mängden protein elueras i 400 mM och 500 mM NaCl buffertar är lägre än 300 mM och är inkonsekvent mellan de tre replikat. Även om det här problemet kan lösas med ytterligare optimering av inkubering tid och centrifugering hastighet, illustrerar detta reproducerbarhet fördelen med SSE.
Genom vår optimering fann vi att andra kromatin komplex kan kräva mer tid att vara elueras. I figur 2visar vi att transkriptionell aktivator, PBAF, eluerar från kromatin konsekvent mellan SSEs med 3 min och 10 min inkubationstider. Eluering av den transkriptionell repressor, Polycomb repressiva komplexa 1 (PRC1), indikeras av BMI-1, kräver däremot en längre inkubationstid att släppas från kromatin8. Detta fenomen kunde vara på grund av PRC1 att vara lokaliserade i mer kompakt och otillgängliga regioner i genomet, eller kan bero på differentiell bindande kinetik för två komplexen.
Efter optimering för ett visst protein, kan SSEs användas för att studera hur styrkan av proteinbindning ändras i olika förhållanden. SSE kan användas för att undersöka effektiviteten av en hämmare av protein-protein interaktioner. För att demonstrera detta koncept, utnyttjade vi (+) JQ1, är en hämmare av BRD4 bromodomain för att undersöka hur det förändrat BRD4 bindande (figur 3a)9. Vi isolerade kärnor från 4 miljoner OVCA429 celler. Ta bort eventuella obundna BRD4, utfördes en inledande 0 mM tvätta på båda exemplaren. Sedan en standard SSE utfördes med DMSO eller 1 µM (+) JQ1 läggs till respektive fraktion. Prover inkuberades i 5 min. Vi observerar att BRD4 eluerar tidigare i närvaro av den hämmare jämfört med DMSO. För att visa att (+) JQ1 är specifik för BRD4, vi utplånas för ARID1a och såg ingen förändring i eluering (figur 3b).
Nästa vi granskat hur proteinbindning kan ändras när landskapet i kromatinet ändras. BRD4 innehåller två bromodomains som känner igen acetylerade lysin rester på Histon svansar10. För att öka nivån på Histon acetylering, vi behandlat OVCA429 celler med 10 µM av Histon histondeacetylas hämmare suberanilohydroxamic syra (SAHA) för 3 h. SAHA (10 µM) lades till alla buffertar under SSE. Genom att öka de globala Histon acetylering, observerat vi en ökning BRD4 bindande (figur 4a). När blotting för ARID1a, observerar vi stramare bindning av ARID1a också, vilket inte är förvånande eftersom subenheter av BAF komplexa, såsom BRG1, BRM och BRD9, alla innehåller bromodomains10,11 (figur 4b).
Slutligen, för att uppvisa hur SSE kan användas för att titta på hur proteinbindning ändras när celler upplever genomiska förändringar, vi inducerad dubbel stranded DNA bryter med topoisomeras II-hämmare, doxorubicin12. Vi behandlade HEK293T celler med 1 µM av doxorubicin i en timme och får cellerna att återhämta sig i tre timmar. Efter att ha utfört SSE, utplånas vi för PBRM1, som är involverad i DNA skador reparation13. Vi observerade två toppar för PBRM1 bindning: en på 300 mM och en på 500 mM NaCl (figur 5). Detta tyder på att några av PBRM1 befolkningen normalt är bindande, men en delmängd av PBRM1 binds hårdare till kromatin efter DNA-skador. Detta är bara ett exempel på hur du använder SSE för att undersöka hur kromatin interaktioner ändras som svar på olika yttre stimuli.
Figur 1: Icke-sekventiella jämfört med sekventiell salt extraktioner i OVCA429 celler
(A) Immunoblots och kvantifiering av tre oberoende replikerar av ARID1a och PBRM1 eluering profiler av metoden sekventiell salt extraktion. (B) Immunoblots och kvantifiering av tre oberoende replikat av ARID1a och PBRM1 eluering profiler i metoden icke-sekventiella salt extraktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Jämförelse av inkubationstider av PBAF och PRC1 eluering profiler
(A) jämförelse av PBAF (PBRM1) eluering profiler med 3 och 10 minuters inkubationstider. (B) jämförelse av PRC1 (BMI-1) eluering profiler med 3 och 10 minuters inkubationstider. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Effektivitet av (+) JQ1 på att hämma BRD4 bindning
(A) eluering mönster av BRD4 i närvaro av 1 µM (+) JQ1 jämfört med DMSO kontroll i OVCA429 celler. (B) eluering profil av ARID1a i närvaro av 1 µM (+) JQ1 jämfört med DMSO kontroll i OVCA429 celler. Band intensitet är indicerat för 0 mM - 500 mM fraktionen med DMSO eller (+) JQ1.
Figur 4: Förändringar i bindande när kromatin anlagda ändras
(A) jämförelse av BRD4 eluering från OVCA429 celler behandlas med 10 µM SAHA 3 timmar jämfört med DMSO behandling. (B) eluering profiler av ARID1a från OVCA429 celler behandlas med10 µM SAHA jämfört med DMSO. Band intensitet är indicerat för 0 mM - 500 mM fraktionen med DMSO eller SAHA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Förändringar i PBRM1 bindande efter DNA-skador
SSE resultat för PBRM1 bindande från HEK293T celler behandlas med 1 µM Doxorubicin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Karaktärisering av protein och kromatin interaktioner genom salt extraktioner är en vanlig metod som har använts för årtionden14,15. men har det inte systematiskt optimerats innan för att avslöja dess full nytta. Vi visar hur sekventiella metoden ger en snabb och billig sätt att urskilja förändringar i kromatin bindande när proteinet eller miljön förändras. SSE är mycket anpassningsbar och optimerbart, och ännu viktigare, det är tekniskt enkel och kräver ingen specialutrustning. De viktigaste aspekter som behöver optimeras före start är: Start mobilnummer, hypoton buffert villkor och inkubationstiden.
Den viktigaste aspekten av antalet celler är att det är konsekvent mellan alla prover. När man tittar på BAF komplex, ger med 8 miljoner celler en bra profil av hur dessa komplex är bindande; dock kan antalet celler (eller mängden buffert) behöva justeras beroende på överflödet av proteinet av intresse. Det är viktigt att notera att använda färre celler utmanande eftersom på 400 mM och 500 mM NaCl är det svårt att visualisera kromatin pelleten. Det är viktigt att se till att pelleten inte överförs med supernatanten efter 400 mM NaCl.
För att korrekt utvärdera nukleära proteiner, behöver kärnorna bo intakt tills de är lyserat med 0 mM NaCl mRipa lösning. Många vanliga hypoton lösningar är för hårda för cellinjer som HEK293T och HeLa celler. För dessa cellinjer, är det rekommenderat att använda modifierade bufferten A.
Slutligen, inkubationstiden kan variera beroende på experimentet. För BAF subenheter ändras eluering mönstret inte mellan en 3 min och 10 min inkubering; men förändras elueringen av PRC1 komplexa drastiskt beroende på hur länge proverna inkuberas. Dessutom när du utvärderar effekten av en hämmare på bindningen av sitt mål, kan inkubationstiden behöva optimeras beroende på hämmare kinetik.
När du utför experimentet, är det viktigt att vara så konsekvent som möjligt med behandling av proverna. För varje fraktion, bör salt bufferten läggas till varje provet före homogenisering så att varje prov är lika utsatt. Poängen med pipettering är att bryta upp en kromatin och hjälp frigivning bundna proteinerna. Det är viktigt att se till att pelleten passerar genom pipettspetsen. Speciellt när man använder ett större antal celler, är kromatin pelleten utmanande att passera pipettspetsen de första gångerna. Vi har funnit att en 1 mL spets fungerar bäst för detta, som med smärre avlyssning av spetsen mot botten av centrifugröret mikro, vi kan dra upp pelleten i spetsen. Efter att ha passerat kromatin pelleten genom spetsen femton gånger, bör pelleten smidigt förflytta spets, även om det inte kommer att upplösas. Efter inkubation proverna på is och isolera kromatinet genom centrifugering, möjliggör ta bort supernatanten med en 200 µL pipettspetsen maximal borttagning utan att störa pelleten kromatin.
Även om SSE kräver tekniska konsistens, den är enkel och kan utföras med gemensamma laboratorieresurser. Det är viktigt att notera att den verkliga kraften i denna metod är när det är tillsammans med andra fenotypiska undersökningar. Exempelvis använder denna teknik, Vi jämförde de bindande profilerna av PBRM1 när var och en av dess sex bromodomains var muterade, vi bestämde att alla utom en av bromodomains var involverade i bindningen av PBRM1 i varierande grader7. Spännande, hittade vi att de bromodomains som var viktigast för bindande var också viktigt för PBRM1 reglering av genuttryck och kontroll cell spridning7. Vi validerat också förändringar i bindningen av dessa mutanter till en diskret genomisk locus av kvantitativa ChIP-qPCR7.
Vi har visat bara några exempel på hur denna teknik kan användas för att studera protein-kromatin interaktioner; dock i vårt labb har vi funnit att SSE är ett mångsidigt verktyg för att undersöka en rad olika frågor om kromatin läsaren proteiner. I kombination med andra analyser, denna teknik underlättar vår förmåga belysa funktionen av komponenter bestående av dessa utarbeta proteinkomplex. Genom att förstå vikten av enskilda domäner, kan vi identifiera oavsett om de är potentiella terapeutiska mål för utvecklingen av en hämmare som blockerar kromatin association.
Vi har visat hur SSE kan utökas för att utvärdera effektiviteten av en liten molekyl-hämmare på proteinbindning till kromatin. Dessutom, genom att hämma epigenetiska författare och suddgummin, kan SSE avgöra förhållandet mellan PTM nivåer och läsaren proteiner. Vi har också visat SSE kan användas för att fastställa förändringar i bindande svar på yttre stimuli såsom DNA-skador. Även om detta är en enkel teknik, när den tillämpas under rätt förhållanden, kan det kraftigt förväg vår kunskap om chromatin och dess reglerande proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av en V scholar award (V2014-004) och en V scholar plus award (D2016-030) från V Stiftelsen för cancerforskning och en amerikansk institutionella forskningsbidrag för Cancer Society (ACS IRG Grant 58-006-53) till Purdue University Center för Cancer Forskning. E. G. P. stöddes av Borch Graduate Endowment tilldelning till Purdue University läkemedelskemi och Molekylär farmakologi institutionen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
References
- Ramakrishnan, V. Histone structure and the organization of the nucleosome. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T.
- Musselman, C. A., Lalonde, M. -E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, (2017).
- Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting. Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).
- Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma. J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).
- Kerppola, T. K. Polycomb group complexes--many combinations, many functions. Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).
- Filippakopoulos, P., et al.
- Filippakopoulos, P., et al. Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family. Cell. 149 (1), 214-231 (2012).
- Sanchez, R., Zhou, M. -M. The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription. Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).
- Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics. Biochim. Biophys. Acta - Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).
- Kakarougkas, A., et al. Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin. Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).
- Lee, S. Y., Park, J. -H., Kim, S., Park, E. -J., Yun, Y., Kwon, J. A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks. Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin. J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).
