Summary
استخراج الملح متسلسلة من البروتينات الكروماتين ملزمة أداة مفيدة لتحديد خصائص ربط مجمعات كبيرة من البروتين. ويمكن استخدام هذا الأسلوب لتقييم دور مفارز الفردية أو المجالات في تقارب شامل بروتين معقدة لمعظم الكروماتين.
Abstract
توضيح خصائص ربط الكروماتين استهداف البروتينات يمكن أن تكون صعبة للغاية بسبب الطبيعة المعقدة الكروماتين والطابع غير المتجانس لمجمعات الكروماتين--تعديل معظم الثدييات. وللتغلب على هذه العقبات، نحن قد تكيفت مقايسة استخراج ملح متسلسلة (SSE) لتقييم الانتماءات ملزم النسبية لمجمعات الكروماتين زمنياً. هذا التحليل سهلة ومباشرة يمكن أن يستخدمها غير الخبراء لتقييم الفرق النسبي في ملزمة تقارب من مجمعين ذات الصلة، والتغييرات في تقارب مجمع عند وحدة فرعية يتم فقدان أو يتم إلغاء تنشيطه مجال فردية، والتغيير في ملزمة تقارب بعد التعديلات للمناظر الطبيعية الكروماتين. بشكل تسلسلي إعادة تعليق الكروماتين الأكبر في زيادة كميات من الملح، نحن قادرون على الشخصية شطف بروتين معين من الكروماتين. استخدام ملفات التعريف هذه، نحن قادرون على تحديد كيف تؤثر التعديلات في مجمع الكروماتين--تعديل أو تعديلات على البيئة الكروماتين على التفاعلات ملزمة. اقتران SSE مع غيرها من فحوصات في المختبر و في فيفو ، يمكننا تحديد أدوار المجالات الفردية والبروتينات في وظائف معقدة في مجموعة متنوعة من البيئات الكروماتين.
Introduction
تنظيم الحمض النووي في الخلايا حقيقية النواة هو نظام معقد ومتطورة هو رقابة مشددة من جانب مجموعة متنوعة بروتينات بتنسيق الاستجابات للمثيرات داخل الخلية وخارج الخلية. الحمض النووي هو الملتفة حول هيستون أوكتاميرس للنموذج نوكليوسوميس، الذي يمكن توزيعها على طول الحمض النووي فضفاضة أو ضغط في اللفات ضيقة1. ويعرف هذا الترتيب الهيكلي للحمض النووي و histones الكروماتين، الذي تنظمه شبكة بروتينات بالقراءة والكتابة، ومحو التعديلات متعدية الجنسيات (PTM) وظيفة في هيستونيس2. تغيير بعض هيستون بتمس، مثل أسيتيلاتيون، المسؤول عن الحمض الأميني تودع، تغيير التفاعلات بين هيستونيس والحمض النووي2. هيستون بتمس تخدم أيضا تجنيد المنظمين النسخي، remodelers الكروماتين، وآلية إصلاح تلف الحمض النووي، وآلات النسخ المتماثل الحمض النووي لمناطق محددة من الجينوم3.
معظم طرق لدراسة التفاعلات بين لونين أما التحقيق التفاعلات صغيرة الحجم أو تنطوي على تحليلات المجين على نطاق كبير. كثيرا ما تستخدم في المختبر ملزمة الدراسات الفردية المجالات المؤتلف مع الببتيدات هيستون أو الحمض النووي في فحوصات مثل الببتيد بولدوونس والاستقطاب الأسفار، التفريد التنقل shift فحوصات (أمسا) والقياس المعايرة متحاور. لأن هذه الاختبارات عادة التركيز على مجال البروتينات فردية، تيسير فهم قطعة صغيرة من اللغز، ولكنها لا تسمح لنا بفهم الطبيعة التعاونية للبروتينات متعددة المجالات، ناهيك عن دورها في البروتين المتعددة المجمعات. تتم إضافة طبقة أخرى من المعضلة بتشكيل مجمعات الكروماتين--تعديل معظم الثدييات غير متجانسة. هذا التغاير البروتين، في تركيبة مع الطبيعة الدينامية للمناظر الطبيعية الكروماتين، يجعل من تحدي بإيجاز في فيفو ملزمة تفاعلات البروتينات الكروماتين على الكروماتين في المختبر.
في فيفو الأساليب تقدما كبيرا؛ ومع ذلك، أنها غالباً مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، وتحديا من الناحية التقنية. إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين متبوعاً بالتسلسل (الرقائق-seq) مفيد جداً لتحديد التعريب من البروتينات والتعديلات هيستون عبر الجينوم، إلا أن ذلك يتطلب التحسين الكبير4. غالباً ما تكون البروتينات كروسلينكيد بلونين للحفاظ على التفاعلات؛ ومع ذلك، هذا يمكن أن تنتج التفاعلات مصطنعة، وقد يسبب حانمه إخفاء5. وعلاوة على ذلك، تتطلب إيمونوبريسيبيتيشنز (IP) أجسام مضادة محددة للغاية، والتحسين واسعة من قص الحمض النووي وشروط الملكية الفكرية برقاقة--قبكر استخدام موقع ربط معروفة، التي غالباً لا مسبقاًالمتوفرة. بعد تحسين ظروف رقاقة، تجهيز العينات مكلف ويتطلب عدة أسابيع إلى أشهر لتسلسل وتحليل. على الرغم من أن هذا الأسلوب لا تقدر بثمن لتحديد إضفاء الطابع المحلي على الكروماتين ملزمة البروتينات عبر الجينوم، التكلفة والالتزام بالوقت جعله الباهظة لاستخدام هذا الأسلوب لتوليد فرضيات حول كيفية تأثير التغييرات الصغيرة على خصائص الربط العالمي .
في هذه الورقة، ويصف لنا كيف يمكن استخدام مقايسة استخراج ملح متسلسلة (SSE) لفحص ملفات تعريف عالمي ملزم البروتينات المرتبطة الكروماتين وتميز كيف التغييرات في التشكيل جانبي PTM المعقدة، أو العالمية بروتين، يمكن أن يغير التفاعلات. وعلى الرغم من عمليات استخراج الملح تقنية تستخدم عادة، وعلى نطاق واسع، نظهر كيف هذا الأسلوب المتسلسل استنساخه للغاية وتنوعاً. SSE يسمح لنا بوصف كيفية إسهام وحدة فرعية مفردة معقدة أو حتى مجال مفرد إلى التقارب في المجمع العام لمعظم الكروماتين. SSE يمكن استخدامها أيضا لتحديد إذا كان الربط من البروتين تتأثر بالتغيرات في المشهد الكروماتين، وتقديم فرضيات مثيرة للاهتمام لاستهداف مارك هيستون التي يمكن تأكيدها باستخدام رقاقة seq وغيرها من الدراسات على نطاق واسع الجينوم.
ونحن أصلاً تكييف هذا الأسلوب من وو وآخرون، دراسة لوظيفة Polybromo1 (PBRM1) في ربط6،ريموديلير الكروماتين بباف7. باستخدام هذا الأسلوب، تحدد دور PBRM1 لربط الكروماتين داخل الكروماتين بباف يعيد البناء المعقدة وثم تحديد المساهمة النسبية برومودومينس الفردية الستة لهذه الدالة7.
هنا ونحن تصف كيفية تحسين هذه الطريقة لاستكشاف ملزمة الكروماتين في أنواع الخلايا المختلفة، لتقييم تقارب ملزم النسبية من الكروماتين مماثلة تعديل المجمعات، وأن ينظر في تشريد البروتين من الكروماتين مثبط كيميائية، و لتحديد آثار ملزمة الكروماتين بعد التعديلات للمناظر الطبيعية الكروماتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الاستعدادات
السكروز- تحضير 100 مل من محلول ناقص التوتر "المخزن المؤقت ج:" 0.3 متر، 60 ملم بوكل، 60 ملم تريس pH 8.0، 2 مم يدتا، و 0.5% NP-40. تخزين في درجة مئوية 4-
ملاحظة: بعض خطوط الخلايا، مثل HEK293T، تتطلب الظروف ليسينج أقل صرامة. إذا نوى بسهولة، استخدام تعديل المخزن المؤقت ج: 25 مم هيبيس درجة الحموضة 7.6، 25 مم بوكل، 5 مم مجكل 2، يدتا 0.05 مم، والغليسيرول NP-40، و 10% 0.1%- - تعد حلاً أسهم 250 مل من 2 x mRIPA الحل: 100 مم تريس pH 8.0، ديوكسيتشولاتي الصوديوم NP-40، و 0.5% 2%-
- تعد حلاً أسهم 100 مل من كلوريد الصوديوم م 5-
- باستخدام x mRIPA وحلول كلوريد الصوديوم م 5، 2 إعداد 50 مل من 1 x mRIPA حل لكل من تركيزات الملح ستة: 0، 100 مم، 200 مم، 300 مم، مم 400، و 500 ملم كلوريد الصوديوم. قبل البدء بالتجربة، بارد جميع الحلول على مدت
- تنمو الخلية خطوط تحت الظروف المرجوة.
ملاحظة: عند تحديد الآثار المترتبة على إسقاط بروتين، يجب مقارنة SSE للسطر ضربة قاضية للخلايا wildtype. يجب إجراء هذه SSE جنبا إلى جنب. للحصول على أمثلة استخدام مثبطات الكيميائية أو المحفزات، الرجوع إلى الأقسام 3-5-
2. استخراج الملح متسلسلة الأساسية
الخلايا- الحصاد 8 مليون لكل شرط ويغسل مرتين مع 5 مل من الجليد الباردة PBS.
ملاحظة: من المهم لعدد متساو من الخلايا بتركيزات البروتين تعادل. العدد الدقيق للخلايا قد تحتاج إلى أن يكون الأمثل لخطوط الخلايا الفردية أو بروتينات معينة. من المهم أن لا يكون كثيرة جداً، كما أن الزيادة في تركيزات البروتين سيمنع المراقبة منحنى شطف، الذي يعتمد على الربط التوازن. ومع ذلك، مع عدد قليل جداً من الخلايا قد لا يكون هناك ما يكفي من البروتين للكشف عن المنحنى، وبيليه الكروماتين أصعب لعزل ويمكن أن تضيع بين الكسور. - تعليق إعادة الخلايا في 1 مل من المخزن المؤقت A + مثبطات البروتياز، نقل إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الصغرى، وتدوير أعلى على القاع في درجة 4 مئوية للحد الأدنى 10 عزل
- الأنوية باستخدام الطرد المركزي في 6000 x ز لمدة 5 دقائق في درجة مئوية 4-
ملاحظة: بعد هذه الخطوة المغلف النووي ينبغي أن يظل سليما. إذا كان المغلف النووية سليمة، بيليه إعادة ستعلق تماما؛ ومع ذلك، عندما يتم تفكيك المغلف ويطلق الكروماتين، بيليه سوف لا إعادة تعليق. إذا لم يكن المغلف النووية سليمة بعد المخزن المؤقت بالحضانة، استخدم "تعديل المخزن المؤقت ألف"
مثبطات - إضافة 200 ميليلتر مريبا 0 ملم كلوريد الصوديوم + مبطلات لكل بيليه نوى قبل إعادة تعليق بيليه. مجانسة كل عينة من بيبيتينج 15 مرة مع ماصة 1 مل. وينبغي إعادة تعليق بيليه بسهولة، ومع ذلك، سوف الأنوية هو بيبيتيد، وسوف تصبح العينة سميكة ولزجة ويصعب على "الماصة؛".
- من أجل وضع بيليه في التلميح، والاستفادة من نهاية طرف ماصة ضد الجزء السفلي من الأنبوب الطرد المركزي. بيليه لا تذوب تماما بمجرد الإفراج عن الحمض النووي من النواة، ولكن سيتم كسرها بيبيتينج المكياج.
- عند الجميع قد تم تجانس العينات، احتضان جميع العينات في الثلج للحد الأدنى 3
ملاحظة: قد تحتاج فترة حضانة الأمثل اعتماداً على بروتين الفائدة. - بيليه عزل الكروماتين سينتريفوجينج عينات لمدة 3 دقيقة في 6500 س ز على 4 درجة مئوية. أنبوب
- نقل المادة طافية للطرد مركزي نظيفة 1.5 مل. وسوف يكون هذا الكسر 0 ملم. هذا الحل مريبا 0 ملم يمكن أن تتصرف كخطوة غسيل لتحلل الأنوية وإزالة أي البروتينات فضفاضة لا ترتبط مع الكروماتين. مثبطات
- إضافة 200 ميليلتر مريبا 100 ملم كلوريد الصوديوم + مبطلات لكل بيليه الكروماتين قبل إعادة تعليق بيليه. تفكيك بيليه الكروماتين بيبيتينج بيليه صعودا وهبوطاً مرات 15-
ملاحظة: من المهم أن تكون متسقة مع عدد مرات بيبيتيد بيليه في. - إينكوباتي على الجليد لمدة 3 دقائق. تسمح هذه الخطوة حضانة جميع العينات للوصول إلى حالة توازن، الذي يكتسي أهمية خاصة عندما تكون هناك نماذج متعددة-
- الطرد المركزي في 6500 س ز لمدة 3 دقيقة 4 درجة مئوية ونقل طافية إلى أنبوب نظيفة 1.5 مل. كرر
- 2.6-2.10 لتركيزات الملح المتبقي.
ملاحظة: بعد 400 مم كلوريد الصوديوم، ينبغي أن يكون واضحا وجلوبي مريبا بيليه ولن تبقى في الجزء السفلي من الأنبوب. يمكن وضع بيليه في غطاء أنبوب الطرد المركزي بينما المادة طافية معزولة. - ميليلتر 70 إضافة 4 × تحميل البروتين صبغ لكل جزء وتحميل 30 ميليلتر من كل جزء إلى هلام اكريلاميد الحزب الديمقراطي الصربي لتحليل لطخة غربية-
ملاحظة: لتحديد الشخصية الملزمة من البروتين، من الأهمية بمكان تحميل وحدات تخزين ما يعادل تركيزات البروتين تساوي ليستي، بدلاً من تحميل- - القيام بوصمة عار غربية قياسية بنقل على غشاء واستخدام الأجسام المضادة الأساسي للبروتينات للفائدة-
- إلى قوانتيتاتي البروتين الوتيد من الكروماتين، احتضان وصمة عار في الأسفار الأشعة تحت الحمراء إيرديي الأجسام المضادة الثانوية ووصمة عار الصورة مع تصوير. بينما يمكن استخدام أساليب أخرى للتنمية، نوصي fluorescence أو التصوير بالأشعة تحت الحمراء، كما أنها أكبر كمية في الطبيعة-
- "استخدام إيماجيج" أو برامج مماثلة لحساب الكثافة للبروتين الوتيد في كل تركيز الملح. يمكن تحديد نمط شطف من البروتين الخاص بك للاهتمام بالرسوم البيانية كثافة الفرقة ضد تركيز الملح،.
3. استخراج الملح متسلسلة في حضور كل من " القارئ " مثبط
- حصاد مجموعتين من الخلايا (4 مليون)، وعزل الأنوية كما هو الحال في SSE قياسية.
- إعادة تعليق كلتا المجموعتين في 200 ميليلتر من مريبا 0 ملم كلوريد الصوديوم، واحتضان لمدة 3 دقائق. سيسمح هذا لإزالة أي البروتين حرة في الأنوية.
- إضافة 200 ميليلتر مريبا 0 ملم كلوريد الصوديوم لكل بيليه. إضافة مثبط (2 ميليلتر من 1 ملم (+) JQ1) إلى واحد من العينة و [دمس] إلى مجموعة مراقبة-
- أجيتاتي بيليه بيبيتينج 15 مرة، واحتضان على الجليد للحد الأدنى 5
- الطرد المركزي في 6500 س ز لمدة 3 دقيقة 4 درجة مئوية ونقل طافية إلى أنبوب نظيفة 1.5 مل.
- كرر 3، 3-4 من أجل كل تركيزات الملح وأداء وصمة عار غربية قياسية.
4. استخراج الملح متسلسلة في حضور كل من " الكاتب " مثبط
- علاج الخلايا مع المانع (10 ميكرومتر ساها) أو [دمس] حاء 3
- حصاد الخلايا 4 مليون لكل معاملة.
- أداء SSE قياسية للعينات مع المانع إضافة إلى كافة المخازن المؤقتة.
5. متسلسلة "الملح استخراج الحمض النووي الأضرار التالية"
- علاج الخلايا مع 1 ميكرومتر ميتوتريكسات حاء – 1
- تغيير الوسائط في الخلايا وتسمح لهم باسترداد 3 ﻫ.
- حصاد الخلايا 8 مليون وأداء SSE الأساسية-
6. استخراج الملح عدم متسلسلة
- حصاد الخلايا 12 مليون وتغسل مع برنامج تلفزيوني.
- الفجوة الخلايا حيث أن هناك 2 مليون من خلايا كل أنبوبة الطرد المركزي الصغير-
- إعادة تعليق في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت A واحتضانها للحد الأدنى 10
- عزل الأنوية باستخدام الطرد المركزي في 6000 x زاي
- إعادة تعليق الكريات في ميليلتر 200 لكل من مخازن مريبا + كلوريد الصوديوم.
- مجانسة كل عينة من بيبيتينج 15 مرة مع تلميح ماصة 1 مل.
- إينكوباتي على الجليد للحد الأدنى 3 عزل في الكروماتين بالطرد المركزي في 6500 س ز
- ونقل المادة طافية لتنظيف الأنابيب. إضافة ميليلتر 70 من تحميل صبغ وتشغيل 30 ميليلتر في جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة لتحليل لطخة غربية-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه الورقة، ونظهر بمزايا وتطبيقات أسلوب استخراج الملح متسلسلة استخداماً (SSE) التي كنا قد تكيفت من الأدب6. في الشكل 1، قارنا إمكانية تكرار نتائج لمشاريع الأعمال الصغيرة لاستخراج البروتينات غير التتابع عن طريق الكشف عن أنماط شطف ARID1a و PBRM1. ونلاحظ دائماً أن ARID1a، وحدة فرعية BAF، الوتيس في المقام الأول 200 ملم كلوريد الصوديوم، و PBRM1، فرعية بباف حصري، الوتيس في المقام الأول 300 ملم كلوريد الصوديوم. ويبين الشكل 1a replicates المستقلة ثلاثة من مشاريع الأعمال الصغيرة مع 8 مليون OVCA429 الخلايا. ويصور الشكل 1b استخراج ملح غير متسلسلة حيث كانت نواة معزولة عن الخلايا 2 مليون تعليق جديد في مخزن مفرد ملح. على الرغم من أن كلا الأسلوبين استنتاج أن التيس ARID1a 200 ملم والتيس PBRM1 في 300 ملم، SSE تنتج صورة ملزمة محددة تحديداً جيدا ويسمح بتمييز واضح لربط هذه المجمعات اثنين. وعلاوة على ذلك، في الأسلوب غير المتسلسلة، كمية البروتين التيد في مخازن كلوريد الصوديوم 400 و 500 ملم أقل من 300 ملم وغير متناسقة بين replicates الثلاثة. على الرغم من أن هذه المسألة قد يمكن حلها بالتحسين المزيد من سرعة الوقت والطرد المركزي الحضانة، وهذا يوضح ميزة إمكانية تكرار نتائج SSE.
من خلال جهودنا الأمثل، وجدنا أن المجمعات الكروماتين الأخرى قد تحتاج إلى مزيد من الوقت ليكون التيد. في الشكل 2، نبدي أن المنشط النسخي، بباف، التيس من الكروماتين دائماً بين المؤسسات الصغيرة الحجم مع أوقات الاحتضان 3 دقيقة و 10 دقيقة. في المقابل، شطف قامع النسخي، بوليكومب قمعية معقدة 1 (PRC1)، يتبين من مؤشر كتلة الجسم-1، يتطلب وقتاً أطول في حضانة أن يفرج عنها من الكروماتين8. هذه الظاهرة يمكن أن تكون سبب PRC1 يجري مترجمة في مناطق أكثر تركيزاً وأكثر غير قابل للوصول من الجينوم، أو قد يكون بسبب حركية التفاضلية ملزم للمجمعات اثنين.
بعد التحسين لبروتين معين، يمكن استخدام المؤسسات الصغيرة الحجم لدراسة كيفية تغيير قوة ملزمة البروتين في ظروف مختلفة. يمكن استخدام SSE لدراسة فعالية مثبط تفاعلات البروتين البروتين. وللتدليل على هذا المفهوم، ونحن تستخدم (+) JQ1، ومثبط برومودوماين BRD4، لدراسة كيف أنها غيرت BRD4 ملزمة (الشكل 3a)9. ونحن عزل نواة من خلايا OVCA429 4 مليون. لإزالة أي BRD4 غير منضم، أنجز غسيل أولى 0 ملم على كلا عينات. ثم إضافة معيار SSE أنجز مع [دمس] أو 1 ميكرومتر (+) JQ1 لكل جزء. كانت عينات المحتضنة لمدة 5 دقائق. ونلاحظ أن التيس BRD4 في وقت سابق حضور المانع المقارنة مع [دمس]. لإظهار أن (+) JQ1 محددة ل BRD4، مسح ل ARID1a، ورأيت أي تغيير في شطف (الشكل 3b).
قمنا بفحص كيف يمكن تغيير البروتين ملزمة عندما يتم تعديل المناظر الطبيعية الكروماتين التالي. يحتوي BRD4 على برومودوماينس اثنين تعترف يسين أسيتيلاتيد المخلفات في هيستون ذيول10. لزيادة مستوى acetylation هستون، نحن تعامل الخلايا OVCA429 مع 10 ميكرون من هيستون deacetylase مثبط سوبيرانيلوهيدروكساميك الحامض (ساها) حاء 3 ساها (10 ميكرون) أضيفت إلى كافة المخازن المؤقتة أثناء SSE. عن طريق زيادة مستويات acetylation هيستون العالمية، لاحظنا زيادة في BRD4 ملزمة (الشكل 4 أ). عند النشاف ل ARID1a، نلاحظ ملزمة أكثر تشدداً من ARID1a أيضا، الذي ليس من المستغرب أن مفارز BAF المعقدة، مثل BRG1، وحركة الإصلاح البلجيكية، و BRD9، وكلها تتضمن برومودوماينس10،11 (الشكل 4 باء).
وأخيراً، لإظهار كيف يمكن استخدام SSE إلقاء نظرة على كيفية تغيير ملزمة البروتين عند الخلايا تجربة التعديلات الجينوم، نحن فعل مزدوجة فواصل الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل مع المانع الثاني topoisomerase، ميتوتريكسات12. تعامل الخلايا HEK293T مع 1 ميكرومتر من ميتوتريكسات لمدة ساعة، ويسمح للخلايا لاسترداد لمدة ثلاث ساعات. بعد تنفيذ SSE، نحن مسح ل PBRM1، التي تشارك في إصلاح أضرار الحمض النووي13. لاحظنا قمم اثنين لربط PBRM1: واحد في 300 ملم وواحد في 500 ملم كلوريد الصوديوم (الشكل 5). وهذا يوحي بأن بعض السكان PBRM1 ملزم عادة، ولكن أكثر أحكاما ترتبط مجموعة فرعية PBRM1 الكروماتين عقب تلف الحمض النووي. وهذا مجرد مثال لكيفية استخدام SSE لدراسة كيف تتغير التفاعلات الكروماتين في الاستجابة للمحفزات الخارجية المختلفة.
الشكل 1: غير المتسلسلة مقارنة باستخراج الملح متسلسلة في الخلايا OVCA429
A) إيمونوبلوتس والتحديد الكمي للمستقلة الثلاثة يتطابق الملامح شطف ARID1a و PBRM1 بطريقة متسلسلة استخراج الملح. ب) إيمونوبلوتس والتحديد الكمي للمستقلة الثلاثة يتطابق الملامح شطف ARID1a و PBRM1 في أسلوب استخراج الملح غير المتسلسلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: مقارنة بين أوقات الاحتضان من الملامح شطف بباف و PRC1
A) مقارنة بين الملامح شطف بباف (PBRM1) مع أوقات الاحتضان 3 و 10 دقائق. ب) مقارنة بين PRC1 (مؤشر كتلة الجسم-1) شطف الملامح مع أوقات الاحتضان 3 و 10 دقائق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: فعالية (+) JQ1 على تثبيط الربط BRD4
A) نمط شطف BRD4 حضور 1 ميكرومتر (+) JQ1 بالمقارنة مع [دمس] التحكم في الخلايا OVCA429. ب) شطف الشخصية ARID1a حضور 1 ميكرومتر (+) JQ1 بالمقارنة مع [دمس] التحكم في الخلايا OVCA429. تتم الإشارة إلى كثافة الفرقة ل 0 مم-500 مم الكسر مع [دمس] أو (+) JQ1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التعديلات في الربط عندما يتم تعديل الكروماتين مناظر طبيعية
A) مقارنة BRD4 شطف من الخلايا OVCA429 تعامل مع 10 ميكرون ساها لمدة 3 ساعات مقارنة بالمعاملة [دمس]. ب) شطف لمحات من ARID1a من الخلايا OVCA429 معاملة with10 مكم ساها بالمقارنة مع [دمس]. تتم الإشارة إلى كثافة الفرقة للكسر 0-500 مم مع [دمس] أو ساها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: التغييرات في ربط PBRM1 بعد "تلف الحمض النووي"
التعامل مع 1 ميكرومتر SSE النتائج لربط PBRM1 من الخلايا HEK293T ميتوتريكسات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصف التفاعلات بين البروتينات والكروماتين من خلال عمليات استخراج الملح هو أسلوب شائع التي استخدمت لعقود14،15؛ بيد أنه قد لا تم بشكل منهجي الأمثل قبل الكشف عن فائدته بالكامل. علينا أن نظهر كيف يوفر هذا الأسلوب المتسلسل بطريقة سريعة وغير مكلفة لتمييز التغييرات في ربط الكروماتين عندما يتم تغيير البروتين أو البيئة. SSE قابلة للتكيف للغاية ويمكن تحسينه للأمثل، والأهم من ذلك أنها بسيطة من الناحية التقنية ويتطلب أي معدات متخصصة. الجوانب الرئيسية التي تحتاج إلى أن يكون الأمثل قبل البدء: ابتداء من عدد الخلايا وشروط المخزن المؤقت ناقص التوتر ووقت الحضانة.
الجانب الأكثر أهمية من عدد الخلايا أنها متسقة بين جميع العينات. عندما ننظر إلى مجمعات BAF، باستخدام الخلايا 8 مليون يعطي لمحة جيدة عن كيف يتم ربط هذه المجمعات؛ ومع ذلك، عدد الخلايا (أو مقدار المخزن المؤقت) قد تحتاج إلى تعديلها تبعاً لوفرة بروتين الفائدة. من المهم ملاحظة أن استخدام خلايا أقل يمثل تحديا لأن من الصعب تصور بيليه الكروماتين في 400 و 500 ملم كلوريد الصوديوم. من المهم للتأكد من أن لا يتم نقل بيليه مع المادة طافية بعد 400 مم كلوريد الصوديوم.
من أجل دقة تقييم البروتينات النووية، الأنوية بحاجة إلى البقاء سليمة حتى أنها يتم تفكيك مع 0 ملم محلول كلوريد الصوديوم مريبا. العديد من الحلول ناقص التوتر استخداماً قاسية جداً لخطوط الخلايا مثل الخلايا HEK293T والحلة. لهذه الخطوط الخلية، من المستحسن استخدام المخزن المؤقت المعدل أ
وأخيراً، قد تختلف فترة حضانة المرض اعتماداً على التجربة. لمفارز BAF لا يغير نمط شطف بين 3 دقيقة و 10 دقيقة الحضانة؛ ومع ذلك، التغييرات شطف مجمع PRC1 جذريا اعتماداً على كم هي المحتضنة العينات. بالإضافة إلى ذلك، عند تقييم تأثير مثبط على ربط هدفه، قد تحتاج إلى فترة حضانة الأمثل اعتماداً على حركية المانع.
عند إجراء التجربة، من المهم أن تكون متسقة قدر الإمكان مع علاج العينات. لكل جزء، تضاف الملح المخزن المؤقت لكل عينة قبل التجانس حيث أن يتعرض كل عينة على قدم المساواة. نقطة بيبيتينج لتفريق إطلاق سراح الكروماتين ومساعدة البروتينات منضم. من المهم التأكد من بيليه يمر عبر الحافة ماصة. خاصة عند استخدام عدد أكبر من الخلايا، بيليه الكروماتين التحدي لتمرير من خلال طرف الماصة في المرات القليلة الأولى. وقد وجدنا أن تلميح 1 مل يعمل الأفضل لهذا، ومع التنصت طفيفة من التلميح ضد الجزء السفلي من الأنبوب الصغير للطرد المركزي، نحن قادرون على وضع بيليه في التلميح. بعد اجتياز بيليه الكروماتين من خلال التلميح خمسة عشر مرات، بيليه أن تتحرك بسلاسة من خلال معلومات سرية، على الرغم من أنه سوف لا تذوب. بعد حضانة العينات في الثلج، وعزل في الكروماتين بالطرد المركزي، تسمح إزالة المادة طافية مع تلميح ماصة 200 ميليلتر لإزالة القصوى دون تعطيل بيليه الكروماتين.
على الرغم من SSE يتطلب الاتساق التقني، هو بسيط ومباشر، ويمكن تنفيذها مع الموارد المشتركة للمختبر. من المهم أن نلاحظ أن القوة الحقيقية لهذا الأسلوب عندما يقترن مع غيرها من امتحانات الشكلية. على سبيل المثال، باستخدام هذا الأسلوب، قارنا ملامح ملزمة PBRM1 عند كل من برومودوماينس الست كانت تحور، عقدنا العزم أن لكن كل واحد من برومودوماينس متورطون في ربط PBRM1 باختلاف درجات7. الفضول، وجدنا أن برومودوماينس التي كانت الأكثر أهمية بالنسبة الملزمة ضرورية أيضا ل PBRM1 تنظيم التعبير الجيني والتحكم خلية انتشار7. أيضا علينا التحقق من صحة التغييرات في ربط هذه طفرات إلى موضع الجينوم منفصلة حسب الكمية رقاقة--قبكر7.
وقد أظهرنا إلا بضعة أمثلة كيف يمكن استخدام هذا الأسلوب لدراسة تفاعلات البروتين-الكروماتين؛ ومع ذلك، في لدينا مختبر، وجدنا أن SSE أداة مرنة للتحقيق في مجموعة واسعة من المسائل المتعلقة بالبروتينات القارئ الكروماتين. ويسهل هذا الأسلوب بالاقتران مع غيرها من التحليلات، قدرتنا على توضيح وظائف مكونات تضم هذه وضع مجمعات البروتين. عن طريق فهم أهمية المجالات الفردية، نتمكن من التعرف على ما إذا كانت الأهداف العلاجية المحتملة لتطوير المانع الذي يمنع رابطة الكروماتين.
لقد أظهرنا كيف يمكن توسيع SSE تقييم فعالية مثبط جزيء صغير على البروتين ملزمة على الكروماتين. SSE عن طريق تثبيط الكتاب جينية وومحايات، بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحديد العلاقة بين مستويات PTM والبروتينات القارئ. وقد أظهرنا أيضا SSE يمكن استخدامها لتحديد التغيرات في ملزمة في الاستجابة للمحفزات الخارجية مثل تلف الحمض النووي. على الرغم من أن هذا أسلوب بسيط، عند تطبيقها في الظروف المناسبة، أنه يمكن إلى حد كبير مسبقاً معرفتنا الكروماتين وبه البروتينات التنظيمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
المؤلفين قد لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل على جائزة باحث الخامس (V2014-004) وباحث الخامس بالإضافة إلى جائزة (D2016-030) من مؤسسة الخامس "بحوث السرطان"، وأمريكا سرطان المجتمع المؤسسية منحة بحثية (ACS سيبحث المنحة 58-006-53) إلى مركز جامعة بوردو عن السرطان البحث. أ وأيد "منح الهبات بورتش الدراسات العليا" إلى إدارة الصيدلة الجزيئية والكيمياء الدوائية جامعة بوردو ب. غ..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
References
- Ramakrishnan, V. Histone structure and the organization of the nucleosome. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).
- Musselman, C. A., Lalonde, M. -E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, (2017).
- Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting. Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).
- Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma. J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).
- Kerppola, T. K. Polycomb group complexes--many combinations, many functions. Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).
- Filippakopoulos, P., et al. Selective inhibition of BET bromodomains. Nature. 468 (7327), 1067-1073 (2010).
- Filippakopoulos, P., et al. Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family. Cell. 149 (1), 214-231 (2012).
- Sanchez, R., Zhou, M. -M. The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription. Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).
- Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics. Biochim. Biophys. Acta - Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).
- Kakarougkas, A., et al. Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin. Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).
- Lee, S. Y., Park, J. -H., Kim, S., Park, E. -J., Yun, Y., Kwon, J. A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks. Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin. J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).
