Summary
顺序盐提取染色质结合蛋白是一个有用的工具, 以确定结合性质的大蛋白复合物。该方法可用于评价单个亚基或域在蛋白质复合体与大块染色质的整体亲和性中的作用。
Abstract
由于染色质的复杂性质和大多数哺乳动物染色质修饰络合物的异质性, 对染色质靶向蛋白的结合性质的阐明具有很大的挑战性。为了克服这些障碍, 我们采用了一种顺序盐萃取 (SSE) 测定方法来评估染色质结合物的相对结合的亲和力。这种简单而直接的测定方法可用于非, 以评估两个相关复合物的结合亲和性的相对差异, 当亚基丢失或单个域被灭活时, 复杂度的亲和性变化, 以及染色质景观改变后的结合亲和力。通过在不断增加的盐量中依次 re-suspending 大块染色质, 我们能够从染色质中分析特定蛋白质的洗脱。使用这些轮廓, 我们能够确定染色质修饰复合物或染色质环境的改变如何影响结合作用。连接 SSE 与其他在体外和在体内化验, 我们可以确定的作用, 单个领域和蛋白质的功能, 在一个复杂的各种染色质环境。
Introduction
真核细胞中的 DNA 调控是一个复杂而复杂的系统, 它受到一系列蛋白质的严密控制, 它们能够协调对细胞内和细胞外刺激的反应。dna 被包裹在组蛋白 octamers 形成核, 它可以松散地沿 dna 分布或压缩成紧密的线圈1。这种结构安排的 DNA 和组蛋白被称为染色质, 这是由一个网络的蛋白质, 读取, 写入, 并抹去后的翻译修改 (PTM) 组组的2。一些组蛋白 PTMs, 如乙酰化, 改变了它们所沉积的氨基酸的电荷, 改变了蛋白质组与 DNA2之间的相互作用。组蛋白 PTMs 也用于招募转录调节剂, 染色质 remodelers, dna 损伤修复机械, 和 dna 复制机械, 以特定的区域的染色体3。
大多数研究染色质相互作用的方法要么探测小规模的相互作用, 要么涉及大规模的全基因组分析。体外结合研究通常利用单个重组域与组蛋白多肽或 DNA 进行分析, 如电泳迁移率测定 (EMSA)、等温滴定量热法、荧光极化和肽 pulldowns。因为这些分析通常专注于单个蛋白质领域, 它们有助于理解一小部分的拼图, 但不允许我们理解多域蛋白质的合作性质, 更不用说它们在 multi-protein 中的作用了。配合.另一层复杂的是由大多数哺乳动物染色质修饰复合物的异质成分添加。这种蛋白质的异质性, 结合染色质景观的动态性质, 使它具有挑战性, 以重述在体内染色质蛋白的结合相互作用的染色质体外。
在体内方法已取得重大进展;然而, 他们往往是昂贵的, 费时, 技术上的挑战。染色质沉淀, 其次是测序 (芯片序列) 是非常有用的, 以确定蛋白质和组蛋白修饰在整个基因的本地化, 但它需要大量的优化4。蛋白质通常与染色质交联以保持相互作用;然而, 这可以产生人工交互作用, 并可能导致表位掩蔽5。此外, immunoprecipitations (ip) 要求高度特异的抗体, 并广泛优化 DNA 剪切和 IP 条件的芯片 qPCR 使用已知的绑定站点, 这通常是不可用的先验。在优化了芯片条件后, 样品的处理成本很高, 需要数周到数月才能进行序列分析。虽然这种方法对于鉴别基因组中染色质结合蛋白的定位是非常宝贵的, 但成本和时间的承诺使得它无法使用这种方法来产生关于小的变化可能影响全局绑定属性的假设。.
在本文中, 我们描述了如何使用顺序盐萃取 (SSE) 检测可以用来检查染色质结合蛋白的全球结合剖面, 并区分如何改变蛋白质, 复杂, 或全球 PTM 剖面可以改变相互作用。虽然盐提取物是一个普遍和广泛使用的技术, 我们展示了如何这种顺序方法是高度重现性和多才多艺。SSE 允许我们描述一个复杂的单个子单位, 甚至一个单一的域是如何促成复合体对大块染色质的整体亲和性的。SSE 也可以用来确定蛋白质的结合是否受染色质景观的变化的影响, 为组蛋白标记靶向提供了有趣的假说, 可以使用芯片序列和其他基因研究进行确认。
我们最初改编自吴 et al., 检查 Polybromo1 (PBRM1) 在 PBAF 染色质 remodeler6,7的绑定中的功能。利用这一技术, 我们确定了 PBRM1 在 PBAF 染色质重塑复合体中染色质结合的作用, 然后确定了六个体 bromodomains 对此函数的相对贡献7。
在这里, 我们描述如何优化这种方法来探索不同细胞类型的染色质结合, 以评估类似的染色质修饰复合物的相对结合亲和性, 以检查化学抑制剂的染色质蛋白质的位移, 并以确定染色质结合在染色质景观改变后的效果。
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Protocol
1. 准备工作
- 准备100毫升低渗溶液缓冲器 A: 0.3 米蔗糖, 60 毫米氯化钾, 60 毫米三 pH 8.0, 2 毫米 EDTA, 0.5% NP-40。存储在4和 #186; C.
注意: 某些细胞系, 如 HEK293T, 需要较不严格的溶条件。如果原子核溶解容易, 使用修改的缓冲 A:25 毫米 HEPES pH 7.6, 25 毫米氯化钾, 5 毫米氯化镁 2 , 0.05 毫米 EDTA, 0.1% NP-40, 和10% 甘油. - 准备一个250毫升的 2x mRIPA 溶液的库存解决方案: 100 mM pH 8.0, 2% NP-40, 和0.5% 钠胆酸.
- 准备100毫升的5米氯化钠的库存解决方案.
- 使用 2x mRIPA 和5米 nacl 溶液, 为六盐浓度的每一个都准备50毫升的 1x mRIPA 溶液: 0 毫米, 100 毫米, 200 毫米, 300 毫米, 400 毫米, 和500毫米氯化钠。在开始实验之前, 冷却所有的冰上的解决方案.
- 在所需条件下增大单元格线.
注: 在确定击倒蛋白质的效果时, 必须将 SSE 与野生细胞进行比较。这些 SSE 必须并排执行。举例来说, 使用化学抑制剂或刺激, 请参阅 3-5 节.
2。基本顺序盐萃取
- 每种情况下收获800万细胞, 用5毫升冰冷 PBS 洗涤两次.
注意: 有同等数量的细胞具有同等的蛋白质浓度是至关重要的。细胞的确切数量可能需要针对单个细胞系或特定的蛋白质进行优化。重要的是不要有太多, 因为增加的蛋白质浓度将阻止观察的洗脱曲线, 这是依赖于平衡结合。然而, 太少, #160; 细胞可能没有足够的蛋白质来检测曲线, 染色质颗粒更难隔离, 并可以在分数之间丢失. - 重新悬浮在1毫升的缓冲液 + 蛋白酶抑制剂, 转移到1.5 毫升微离心管, 并旋转顶部超过底部在4和 #186; C 为 10 min.
- 通过离心 6000 x g 分离原子核 5 min 在4和 #186; C.
注: 在这一步之后, 核信封仍应完好无损。如果核包完好无损, 颗粒将 re-suspend 充分;然而, 当信封是裂解和染色质释放, 颗粒不会 re-suspend。如果在缓冲孵化后核包络不完整, 请使用修改后的缓冲区 a. - 添加200和 #181; L mRIPA 0 毫米氯化钠 + 蛋白酶抑制剂, 每核颗粒前 re-suspending 颗粒。质每样移15次, 用1毫升吸管。球团应该 re-suspend 容易, 然而, 原子核将溶解, 因为它是 pipetted 和样品将变得厚实和黏, 并且困难的吸管。
- 为了将球团拉入笔尖, 在离心管的底部插入吸管尖端的末端。一旦 DNA 从细胞核中释放出来, 颗粒就不会完全溶解, 但移会破坏它.
- 当所有样本均已匀浆时, 在冰上孵育所有样品3分钟.
注意: 孵化时间可能需要根据感兴趣的蛋白质进行优化. - 在 6500 x g 处离心3分钟, 在4和 #186 分离染色质颗粒; C.
- 将上清液转移到清洁的1.5 毫升离心管。这将是0毫米的分数。这0毫米 mRIPA 溶液可以作为一个洗涤步骤来溶解细胞核并去除任何与染色质无关的松散蛋白.
- 添加200和 #181; L mRIPA 100 毫米氯化钠 + 蛋白酶抑制剂, 每一个染色质颗粒前 re-suspending 颗粒。通过移15倍的颗粒来分解染色质颗粒.
注意: 关键是要与 pipetted 中的球团的次数一致. - 在冰上孵育3分钟。这一孵化步骤允许所有样本达到平衡状态, 这是特别重要的, 当有多个样本.
- 离心机在 6500 x g, 3 分钟在4和 #186; C 和转移上清到一个干净的1.5 毫升管.
- 对剩余的盐浓度重复 2.6-2.10.
注: 400 毫米氯化钠后, mRIPA 颗粒应清晰, 7月29日, 不会停留在底部的管。颗粒可以放在离心管的盖子上, 而上清分离. - 添加70和 #181; 将4x 蛋白质加载到每一个分数中, 并加载30和 #181; 每一个分数的 l 对 SDS 丙烯酰胺凝胶进行西部印迹分析.
注: 要确定蛋白质的结合轮廓, 关键是要装载等量的裂解物, 而不是载入等量的蛋白质浓度. - 通过转移到膜上并使用有兴趣的蛋白质的主要抗体来执行标准的免疫印迹.
- 从染色质定量蛋白质洗, 用成像仪在红外荧光 IRDye 二次抗体和图像印迹中孵育印迹。虽然其他的开发方法可以使用, 我们建议荧光或红外成像, 因为它是更定量的性质.
- 使用 ImageJ 或类似软件计算每个盐浓度的蛋白质洗强度。通过绘制对盐浓度的波段强度, 可以确定你感兴趣的蛋白质的洗脱模式.
3。在 #34; 读取器和 #34; 抑制剂
- 获取两组单元格 (400万) 并将原子核隔离为标准的 SSE.
- 在200和 #181 中重新挂起两个组; mRIPA 0 毫米氯化钠, 孵育3分钟。这将允许去除细胞核中的任何游离蛋白.
- 添加200和 #181; 每粒 mRIPA 0 毫米氯化钠。将抑制剂 (2 和 #181; 1 毫米 (+) JQ1) 添加到一个样品和一甲基亚砜到对照组.
- 用移15次搅动颗粒, 在冰上孵育5分钟.
- 离心机在 6500 x g, 3 分钟在4和 #186; C 和转移上清到一个干净的1.5 毫升管.
- 重复 3.3-4 对所有盐浓度和执行一个标准的西方印迹.
4。序贯盐萃取在 #34; 作家和 #34; 抑制剂
- 使用抑制剂 (10 和 #181; M) 或亚甲基亚砜治疗3小时的细胞
- 为每种治疗收集400万单元格.
- 为示例执行一个标准的 SSE, 并将抑制剂添加到所有缓冲区.
5。DNA 损伤后的序贯盐提取
- 使用1和 #181 处理单元格; M. 1 h.
- 更改单元格上的媒体并允许它们恢复3小时.
- 收集800万单元格并执行基本的 SSE
6。非顺序盐提取
- 收集1200万单元格并使用 PBS 进行清洗.
- 拆分单元格, 使每个微离心管有200万细胞.
- 在500和 #181 中重新挂起; 缓冲 A L, 孵育10分钟.
- 用离心法将原子核分离 6000 x g.
- 在200和 #181 中重新悬浮颗粒; 每个 mRIPA 缓冲液 + 氯化钠.
- 质每样移15次, 用1毫升吸管针尖.
- 在冰上孵育3分钟
- 通过离心 6500 x g 分离染色质, 并将上清液转移至清洁管。添加70和 #181; l 加载染料和运行30和 #181; 我在一个 SDS 页的凝胶中进行印迹分析.
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Representative Results
本文从文献6中, 论证了常用的顺序盐萃取 (SSE) 方法的优点和应用。在图 1中, 我们通过检测 ARID1a 和 PBRM1 的洗脱模式, 比较了 SSE 在提取蛋白质并发中的重现性。我们一贯观察, ARID1a, 一个曝气生物滤子亚基, elutes 主要在200毫米氯化钠和 PBRM1, 一个独家 PBAF 亚基, elutes 主要在300毫米氯化钠。图 1a显示了三独立的 SSE 与 800万 OVCA429 单元的复制。图 1b描绘了一个非盐提取物, 从200万细胞中分离出来的细胞核悬浮在一个盐缓冲液中。虽然这两种方法的结论, ARID1a elutes 在200毫米和 PBRM1 elutes 在300毫米, SSE 产生一个明确的绑定配置文件, 并允许明确区分这两个复合体的约束力。此外, 在非方法中, 400 mm 和 500 mm NaCl 缓冲液中的蛋白质洗量低于 300 mm, 三复制之间不一致。虽然这一问题可以通过进一步优化孵化时间和离心速度来解决, 这说明了 SSE 的重现性优势。
通过我们的优化, 我们发现其他染色质复合体可能需要更多的时间来洗。在图 2中, 我们证明了转录激活剂, PBAF, elutes 从染色质一直到小与3分钟和10分钟潜伏期之间。相比之下, 转录阻遏的洗脱, Polycomb 压迫复合体 1 (PRC1), 表明由 BMI-1, 需要较长的潜伏期释放染色质8。这种现象可能是由于 PRC1 被定位在更紧凑和无法进入的基因组区域, 或者可能是由于两个配合物的微分结合动力学。
经过对某一特定蛋白质的优化, 小可用于研究蛋白质结合强度在不同条件下的变化。SSE 可用于检测蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂的有效性。为了演示这个概念, 我们利用 (+) JQ1, 这是一个 BRD4 bromodomain 抑制剂, 以检查如何改变 BRD4 绑定 (图 3a)9。我们将细胞核从 400万 OVCA429 细胞中分离出来。要删除任何未绑定的 BRD4, 在两个样本上都进行了初始 0 mM 清洗。然后一个标准的 SSE 执行与亚甲基亚砜或1µM (+) JQ1 添加到每个分数。样品孵育5分钟。我们观察到, BRD4 elutes 早在抑制剂的存在与亚砜相比。为了表明 (+) JQ1 是特定的 BRD4, 我们涂抹 ARID1a, 并看到洗脱没有变化 (图 3b)。
接下来, 我们研究了蛋白质结合是如何改变的, 当染色质的景观被修改。BRD4 包含两个 bromodomains, 在组蛋白尾部识别乙酰赖氨酸残留量10。为了提高组蛋白乙酰化的水平, 我们在上证的所有缓冲液中添加了10µM 蛋白乙酰抑制剂 suberanilohydroxamic 酸 (saha) 的 OVCA429 细胞, 对3小时的萨哈 (10 µM) 进行了治疗。通过增加全球组蛋白乙酰化水平, 我们观察到了 BRD4 绑定的增加 (图 4a)。当印迹为 ARID1a, 我们观察更紧密的结合 ARID1a, 这并不奇怪, 因为生物滤池复合体的亚基, 如 BRG1, BRM, 和 BRD9, 都包含 bromodomains10,11 (图 4b)。
最后, 为了展示如何使用 SSE 来观察蛋白质结合的变化, 当细胞经历基因组改变, 我们诱导双链 DNA 断裂与拓扑 II 抑制剂, 阿霉素12。我们用1µM 阿霉素治疗 HEK293T 细胞一小时, 并允许细胞恢复三小时。在执行 SSE, 我们涂抹的 PBRM1, 这是涉及 DNA 损伤修复13。我们观察到两个峰值的 PBRM1 结合: 一个在300毫米和一个在500毫米氯化钠 (图 5)。这表明, 一些 PBRM1 的种群是有约束力的正常, 但一个子集的 PBRM1 是更紧密地绑定到染色质继 DNA 损伤。这只是一个例子, 如何使用 SSE 来检查染色质相互作用如何改变, 以响应不同的外部刺激。
图 1: 与 OVCA429 细胞中的顺序盐萃取物相比, 非序列
A) 采用序贯盐萃取法对 ARID1a 和 PBRM1 洗脱剖面的三独立复制进行 Immunoblots 和定量。B) Immunoblots 和定量的三独立复制的 ARID1a 和 PBRM1 洗脱剖面在非盐提取方法。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: PBAF 和 PRC1 洗脱剖面的潜伏期比较
PBAF (PBRM1) 洗脱剖面与3和10分钟潜伏期的比较。B) PRC1 (BMI-1) 洗脱剖面与3和10分钟潜伏期的比较。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: (+) JQ1 抑制 BRD4 结合的有效性
A) BRD4 1 µM (+) JQ1 的洗脱模式与 OVCA429 细胞中的亚砜控制相比较。B) 与 OVCA429 细胞中的二甲基亚砜对照相比, 在1µM (+) JQ1 的存在下, ARID1a 的洗脱轮廓。带强度是表示为0毫米-500 毫米分数与亚砜或 (+) JQ1。> 请点击这里查看更大版本的这个数字。
图 4: 修饰染色质美化时的装订
) 比较10µM SAHA 治疗的 OVCA429 细胞 BRD4 洗脱3小时, 与亚甲基亚砜相比。B) with10 µM ARID1a OVCA429 细胞的洗脱特征与二甲基亚砜相比。带强度为0毫米-500 毫米分数与亚砜或 SAHA。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: DNA 损伤后 PBRM1 结合的变化
上证 PBRM1 1 µM 阿霉素治疗 HEK293T 细胞结合的结果。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
蛋白质和染色质相互作用通过盐萃取的表征是一种常用的方法, 已经使用了几十年14,15;然而, 它没有得到系统的优化, 以揭示它的充分效用。我们演示了这种顺序方法提供了一种快速和廉价的方法来区分染色质结合的变化时, 蛋白质或环境的改变。SSE 具有高度的适应性和优化, 重要的是, 它在技术上是简单的, 不需要专门的设备。在开始之前需要优化的关键方面是: 起始单元数、低渗缓冲条件和潜伏期。
细胞数的最重要的方面是它是一致的所有样品。当观察生物滤池复合物时, 使用800万细胞能很好地描述这些复合物是如何结合的;然而, 细胞的数量 (或缓冲的数量) 可能需要调整根据兴趣蛋白质的丰盈。重要的是要注意, 使用较少的细胞是有挑战性的, 因为在400毫米和500毫米氯化钠很难想象的染色质颗粒。这是至关重要的, 以确保颗粒没有转移与上清后, 400 毫米氯化钠。
为了准确地评估核蛋白, 细胞核需要保持完好, 直到它们与0毫米氯化钠 mRipa 溶液裂解。许多常用的低渗溶液对 HEK293T 和 HeLa 细胞等细胞系过于苛刻。对于这些单元格行, 建议使用修改后的缓冲区 A。
最后, 孵化时间可能会因实验而异。对于曝气生物滤子亚基, 洗脱模式不改变3分钟和10分钟的孵化;然而, PRC1 复合物的洗脱将根据样品的孵育时间而发生剧烈变化。此外, 在评估抑制剂对其靶的结合作用时, 可能需要根据抑制剂动力学优化孵化时间。
在进行实验时, 尽可能一致地处理样品是很重要的。对于每一个分数, 盐缓冲应添加到每个样品之前, 均匀化, 使每个样本是同样暴露。移的目的是打破染色质, 帮助释放束缚蛋白。重要的是要确保颗粒通过吸管尖端。特别是当使用大量的细胞, 染色质颗粒是挑战, 通过吸管尖端的前几次。我们已经发现, 一个1毫升的尖端工作的最好的, 因为与小攻尖对底部的微离心管, 我们可以把球团的尖端。经过十五次的染色质颗粒通过尖端, 颗粒应该顺利地通过尖端, 虽然它不会溶解。在冰上孵化样品并通过离心分离染色质后, 用200µL 吸管尖端除去上清液, 允许最大的去除, 而不会扰乱染色质颗粒。
尽管 SSE 需要技术上的一致性, 但它简单明了, 并且可以用普通的实验室资源来执行。重要的是要注意, 这种方法的真正力量是当它与其他型考试结合。例如, 使用此技术, 我们比较了 PBRM1 的绑定配置文件, 当它的每一个六 bromodomains 都被突变时, 我们确定所有的 bromodomains 都参与了 PBRM1 到不同程度的绑定7。有趣的是, 我们发现, bromodomains 是最重要的结合, 也是必不可少的 PBRM1 调节基因表达和控制细胞增殖7。我们还通过定量芯片 qPCR7验证了这些突变体与离散基因组的结合的变化。
我们只展示了一些例子, 说明如何使用这种技术来研究蛋白质-染色质相互作用;然而, 在我们的实验室中, 我们发现, SSE 是一个通用的工具, 用于调查一系列关于染色质阅读器蛋白质的问题。与其他分析相结合, 这种技术有助于我们阐明组成这些复杂蛋白质复合物的组件的功能。通过了解各个领域的重要性, 我们可以确定它们是否是开发一种阻止染色质关联的抑制剂的潜在治疗靶点。
我们已经演示了如何扩大 SSE, 以评估小分子抑制剂对蛋白质结合染色质的有效性。此外, 通过抑制后生作家和橡皮, SSE 可以确定 PTM 水平和读者蛋白质之间的关系。我们还显示, SSE 可以用来确定在应对外部刺激 (如 DNA 损伤) 时绑定的变化。虽然这是一个简单的技术, 当应用在适当的条件, 它可以大大提高我们对染色质和它的调节蛋白的知识。
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Disclosures
作者没有相互竞争的金融利益。
Acknowledgments
这项工作得到了 v 学者奖 (V2014-004) 和 v 学者加奖 (D2016-030) 从 v 的癌症研究基金会和美国癌症协会机构研究补助金 (ACS 表意文字补助金 58-006-53) 的支持, 以普渡大学癌症中心研究.e.g.p. 获得了普渡大学药物化学和分子药理学系创研究生捐赠奖的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
References
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