Summary
Sequentiële zout winning van chromatine gebonden eiwitten is een nuttig instrument voor het bepalen van de bindende eigenschappen van grote eiwitcomplexen. Deze methode kan worden gebruikt om te evalueren van de rol van individuele subeenheden of domeinen in de algehele affiniteit van een eiwit complex om te bulk chromatine.
Abstract
Opheldering van de bindende eigenschappen van chromatine-targeting eiwitten kunnen zeer uitdagend vanwege de complexe aard van de chromatine en het heterogene karakter van de meeste zoogdieren chromatine-aanpassen complexen. Om deze hindernissen te overwinnen, hebben wij een sequentiële zout winning (SSE) assay voor het evalueren van de relatieve bindende verwantschappen van chromatine-gebonden complexen aangepast. Deze test gemakkelijk en eenvoudig kan worden gebruikt door niet-deskundigen om te evalueren van het relatieve verschil in bindende affiniteit van twee verwante complexen, de veranderingen in de affiniteit van een complex als een onderdeel verloren is gegaan of een per individueel domein wordt geïnactiveerd en de verandering in bindende affiniteit na veranderingen in het landschap van de chromatine. Door sequentieel schorsing opnieuw bulk chromatine in steeds grotere hoeveelheden zout, kunnen we de elutie van een bepaald eiwit van chromatine profile. Met behulp van deze profielen, zijn wij in staat om te bepalen hoe wijzigingen in een complex van chromatine-aanpassen of veranderingen in het milieu van de chromatine van invloed zijn op bindende interacties. SSE koppeling met andere tests in vitro en in vivo , we kunnen het vaststellen van de rollen van afzonderlijke domeinen en eiwitten op de functionaliteit van een complex in een verscheidenheid van chromatine omgevingen.
Introduction
Verordening van het DNA in eukaryote cellen is een ingewikkelde en geavanceerde systeem dat strak wordt beheerd door een assortiment van proteïnen toe die reacties op intracellulaire en extracellulaire stimuli coördineren. DNA is gewikkeld rond Histon octamers aan vorm nucleosomes, die losjes kunnen worden gedistribueerd langs DNA of gecomprimeerd in strakke spoelen1. Deze structurele regeling van DNA en histonen staat bekend als de chromatine, die wordt geregeld door een netwerk van proteïnen toe die lezen, schrijven en wissen van bericht vertalende wijzigingen (PTM) op histonen2. Sommige Histon PTMs, zoals acetylation, wijzigen de lading van het aminozuur dat ze worden afgezet, veranderen van de interacties tussen histonen en DNA2. Histon PTMs dienen ook te werven transcriptionele regelgevers, chromatine remodelers, DNA schade reparatie machines en DNA replicatie machines voor specifieke gebieden van het genoom3.
De meeste methoden voor het bestuderen van de chromatine interacties sonde kleinschalige interacties of grote genoom-brede analyse te betrekken. In vitro studies van bindend gebruiken vaak individuele recombinante domeinen met Histon peptiden of DNA in assays zoals elektroforese mobiliteit shift assays (EMSA), isothermische titratie calorimetrie, fluorescentie polarisatie en peptide pulldowns. Omdat deze gehaltebepalingen typisch op een individuele eiwit-domein richten, zij vergemakkelijken het begrip van een klein stukje van de puzzel, maar niet toestaan ons te begrijpen van de coöperatieve aard van meerdere domeinen eiwitten, laat staan hun rol in meerdere eiwit complexen. Een andere laag van complexiteit wordt toegevoegd door de heterogene samenstelling van de meeste zoogdieren chromatine-aanpassen complexen. Deze heterogeniteit van eiwitten, maakt in combinatie met het dynamische karakter van het landschap van de chromatine, het uitdagend om te recapituleren de in vivo interacties van chromatine eiwitten binden aan chromatine in vitro.
In vivo methoden hebben gemaakt vooruitgang; ze zijn echter vaak duur, tijdrovend en technisch uitdagende. Chromatine immunoprecipitation gevolgd door sequencing (ChIP-seq) is zeer nuttig voor de bepaling van de lokalisatie van eiwitten en histone modificaties in het genoom, maar het vereist aanzienlijke optimalisatie4. Eiwitten zijn vaak kruisverwijzende aan chromatine te behouden interacties; echter dit kunstmatige interacties kan produceren en epitoop maskeren5kan veroorzaken. Bovendien, de immunoprecipitations (IP) vereist zeer specifieke antilichamen en uitgebreide optimalisatie van DNA schuintrekken en IP-voorwaarden door ChIP-qPCR met behulp van een bekende bindende site, die vaak niet beschikbaar een priori is. Na optimalisatie van ChIP voorwaarden, verwerking van de monsters is kostbaar en vereist enkele weken tot maanden volgnummer te analyseren. Hoewel deze methode is van onschatbare waarde voor het identificeren van de lokalisatie van de chromatine eiwitten gebonden in het genoom, de kosten en tijd inzet maken het onbetaalbaar te gebruiken deze methode voor het genereren van hypothesen over hoe de kleine wijzigingen van invloed kunnen zijn op de internationale bindende eigenschappen .
In dit artikel beschrijven we hoe een sequentiële zout winning (SSE) assay te onderzoeken van globale bindende profielen van chromatine-gebonden eiwitten en onderscheiden hoe wijzigingen in een eiwit, complexe of global PTM profiel interacties kunnen veranderen kan worden gebruikt. Hoewel zout extracties een algemeen en in het algemeen gebruikte techniek zijn, we laten zien hoe deze sequentiële methode is zeer reproduceerbaar en veelzijdig. SSE laat ons toe om karakteriseren hoe een enkele subeenheid van een complex of zelfs een enkel domein draagt bij aan de algehele affiniteit van het complex voor bulk chromatine. SSE kan ook worden gebruikt om te bepalen als de binding van een eiwit wordt beïnvloed door veranderingen in de chromatine landschap, bieden interessante hypothesen voor het targeten van Histon mark die kunnen worden bevestigd met behulp van de ChIP-seq en andere genoom-brede studies.
We oorspronkelijk aangepast deze methode van Wu et al., te onderzoeken van de functie van Polybromo1 (PBRM1) in de binding van de PBAF chromatine remodeler6,7. Met behulp van deze techniek, we bepaald de rol van PBRM1 voor de chromatine binding binnen de PBAF chromatine remodeling complexe en vervolgens bepaald de relatieve bijdrage van de zes afzonderlijke bromodomains aan deze functie7.
Hier beschrijven we hoe het optimaliseren van deze methode om te verkennen van de binding van de chromatine in verschillende soorten cellen, om te beoordelen van de affiniteit van de relatieve binding van soortgelijke chromatine wijzigen complexen, te onderzoeken van de verplaatsing van een eiwit van chromatine door een chemische inhibitor, en om te bepalen van de effecten van chromatine bindend na veranderingen in het landschap van de chromatine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereidingen
- bereiden 100 mL hypotone oplossing Buffer A: 0,3 M sacharose, 60 mM KCl, 60 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA, en 0,5% NP-40. Bewaren bij 4 ° c.
Opmerking: Sommige cellijnen, zoals HEK293T, vereisen minder strenge lysing voorwaarden. Als kernen lyse gemakkelijk, gebruik bewerkt Buffer A: 25 mM HEPES pH 7,6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 0.05 mM EDTA, 0,1% NP-40 en 10% glycerol. - Bereiden een 250 mL stockoplossing van 2 x mRIPA-oplossing: 100 mM Tris pH 8.0, 2% NP-40, en 0,5% natrium deoxycholate.
- Bereiden een 100 mL stockoplossing van 5 M NaCl.
- 50 mL 1 x mRIPA-oplossing voor elk van de zes concentraties van zout met behulp van de 2 x mRIPA en 5 M NaCl oplossingen, bereiden: 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM en 500 mM NaCl. Voordat u het experiment start, cool alle oplossingen op ice.
- Groeien cellijnen gewenste omstandigheden.
Opmerking: Bij het bepalen van de effecten van een eiwit neerhalend, SSE voor de vechtpartij lijn moet worden vergeleken met wildtype cellen. Deze SSE moet naast elkaar worden uitgevoerd. Voor voorbeelden met behulp van chemische inhibitoren of prikkels, verwijzen naar secties 3-5.
2. Fundamentele sequentiële zout winning
- oogst 8 miljoen cellen van elk voorwaarde en was tweemaal met telkens 5 mL van ijs koud PBS.
Opmerking: Het is cruciaal voor het gelijke aantal cellen dat gelijkwaardige eiwit concentraties. Het exacte aantal cellen mogelijk moet worden geoptimaliseerd voor individuele cellijnen of bepaalde eiwitten. Het is belangrijk om niet te veel, zoals de toename van de concentratie van het eiwit voorkomt observatie van de elutie-curve, die afhankelijk zijn van evenwicht bindend is. Echter, met te weinig cellen er mogelijk niet voldoende eiwit te sporen van de curve en de chromatine pellet is moeilijker te isoleren en kunnen verloren gaan tussen breuken. - Resuspendeer de cellen in 1 mL Buffer A + proteaseinhibitors, Pipetteer in 1,5 mL micro centrifuge buizen, en draaien boven over bodem bij 4 ° c gedurende 10 minuten
- Isoleren de kernen door centrifugeren bij 6000 x g gedurende 5 min bij 4 ºC.
Opmerking: Na deze stap de nucleaire envelop moet wel intact. Als de nucleaire envelop intact is, zal de pellet resuspendeer volledig; echter, wanneer de envelop is lysed en de chromatine wordt losgelaten, de pellet zal niet opnieuw opschorten. Als de nucleaire envelop na een incubatieperiode van Buffer A niet intact is, gebruikt u bewerkt Buffer A. - Voeg toe 200 µL van mRIPA 0 mM NaCl + protease remmers aan elke kernen pellet voordat de pellet opnieuw wordt verbroken. Meng elk monster door 15 keer pipetteren met een pipet 1 mL. De pellet moet resuspendeer gemakkelijk, echter de kernen zal lyse zoals het is afgepipetteerde en het monster wordt dik en kleverig en moeilijk te Pipetteer.
- Om de opstelling de pellet in de tip, tikt u op het einde van de pipet tip tegen de bodem van de centrifugebuis. De pellet zal niet volledig oplossen zodra het DNA wordt vrijgelaten uit de kernen, maar pipetteren het omhoog breken zal
- Wanneer alle de monsters hebben zijn gehomogeniseerd, incubeer alle monsters op het ijs gedurende 3 minuten
Opmerking: De incubatietijd moet worden geoptimaliseerd afhankelijk van de proteïne van belang. - Isoleren chromatine pellet door centrifugeren van de monsters gedurende 3 minuten bij 6500 x g bij 4 ºC.
- Overdracht supernatant aan een schone 1,5 mL centrifuge buis. Dit zal de Fractie 0 mM. Deze 0 mM mRIPA oplossing kan fungeren als een wassen stap naar lysis van de kernen en verwijder eventuele losse eiwitten niet geassocieerd met chromatine.
- Voeg toe 200 µL van mRIPA 100 mM NaCl + protease remmers aan elke chromatine pellet voordat de pellet opnieuw wordt verbroken. De chromatine pellet breken door de pellet op en neer 15 keer pipetteren.
Opmerking: Het is van cruciaal belang overeenstemming te zijn met het aantal keren de pellet in afgepipetteerde. - Incubate op ijs gedurende 3 minuten. Deze incubatietijd-stap kunt alle monsters te bereiken van een staat van evenwicht, die met name belangrijk is wanneer er meerdere monsters.
- Centrifuge bij 6500 x g gedurende 3 minuten bij 4 ° c en overdracht supernatant aan een tube schoon 1,5 mL.
- 2.6-2.10 Herhaal voor de resterende zout concentraties.
Opmerking: Na 400 mM NaCl, mRIPA de pellet moet duidelijk en gloopy en zal niet blijven op de bodem van de buis. De pellet kan worden geplaatst in het deksel van de centrifugebuis terwijl het supernatant geïsoleerd. - Toevoegen 70 µL van 4 x eiwit laden kleurstof naar elke breuk en laden 30 µL van elke fractie op een SDS acrylamide gel voor westelijke vlekkenanalyse.
Opmerking: Om te bepalen van het profiel van de binding van het eiwit, het is van cruciaal belang voor het laden van gelijkwaardige hoeveelheid lysate, in plaats van laden gelijk eiwit concentraties. - Een standaard westelijke vlek uitvoeren door op een membraan over te brengen en het gebruik van primaire antilichamen voor proteïnen van belang.
- Naar het kwantificeren van het eiwit geëlueerd van de chromatine, Incubeer de vlek in infrarood fluorescentie IRDye secundaire antilichamen en afbeelding vlek met een imager. Terwijl andere soorten ontwikkeling kunnen worden gebruikt, we raden fluorescentie of infrarood imaging, aangezien er meer kwantitatieve aard.
- Gebruik ImageJ of soortgelijke software voor de berekening van de intensiteit van het eiwit bij elke zoutconcentratie geëlueerd. Door de intensiteit van de band tegen de zoutconcentratie graphing, het patroon van de elutie van uw proteïne van belang kan worden bepaald.
3. Sequentiële zout winning in aanwezigheid van een " Reader " remmer
- oogst van twee sets cellen (4 miljoen) en het isoleren van de kernen zoals in een standaard SSE.
- Resuspendeer beide sets in 200 µL van mRIPA 0 mM NaCl en incubeer gedurende 3 minuten. Dit zal zorgen voor de verwijdering van alle gratis eiwit in de kernen.
- Voeg toe 200 µL mRIPA 0 mM NaCl tot elke pellet. De Inhibitor van de omwenteling (2 µL van 1 mM (+) JQ1) met één monster en DMSO toevoegt aan de besturingsset.
- Schudden de pellet door pipetteren 15 keer en incubeer op ijs gedurende 5 minuten
- Centrifuge bij 6500 x g gedurende 3 minuten bij 4 ° c en overdracht supernatant aan een tube schoon 1,5 mL.
- 3.3-4 Herhaal voor alle concentraties die het zout en het uitvoeren van een standaard westelijke vlek.
4. Sequentiële zout winning in aanwezigheid van een " schrijver " remmer
- behandelen van cellen met de Inhibitor van de omwenteling (10 µM SAHA) of DMSO voor 3 h.
- 4 miljoen cellen voor elke behandeling oogst.
- Uitvoeren van een standaard SSE voor de monsters met de remmer toegevoegd aan alle de buffers.
5. Sequentiële zout winning volgende DNA schade
- cellen met 1 µM Doxorubicine voor 1 h. behandelen
- Wijzigen van de media op de cellen en laten herstellen voor 3 h.
- Oogst van 8 miljoen cellen en het uitvoeren van de fundamentele SSE.
6. Niet-opeenvolgende zout winning
- oogst van 12 miljoen cellen en wassen met PBS.
- Kloof cellen zodat er 2 miljoen cellen per micro centrifugebuis.
- Resuspendeer in 500 µL van Buffer A en incubeer gedurende 10 minuten
- Isoleren van de kernen door centrifugeren op 6000 x g.
- Resuspendeer pellets in een 200 µL van elk van de mRIPA buffers + NaCl.
- Elk monster Meng door 15 keer pipetteren met een uiteinde van de pipet 1 mL.
- Incubate op ijs gedurende 3 minuten
- Isoleren van de chromatine door centrifugeren bij 6500 x g en breng de bovendrijvende vloeistof voor de reiniging van buizen. Voeg 70 µL van het laden van de kleurstof en 30 µL draaien op een SDS-pagina gel voor westelijke vlekkenanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze paper tonen we de voordelen en toepassingen van de veelgebruikte sequentiële zout (SSE) extractiemethode die we vanuit de literatuur6hebben aangepast. In Figuur 1vergelijken we de reproduceerbaarheid van SSE met niet-sequentieel extraheren van eiwitten door het detecteren van de patronen van de elutie van ARID1a en PBRM1. We zien steeds dat ARID1a, een subeenheid van BAF, GC voornamelijk op 200 mM NaCl en PBRM1, een exclusieve PBAF subeenheid, GC voornamelijk op 300 mM NaCl. Figuur 1a toont drie onafhankelijke replicatieonderzoeken voor SSE met 8 miljoen OVCA429 cellen. Figuur 1b toont een niet-opeenvolgende zout winning waar kernen van 2 miljoen cellen geïsoleerd opnieuw geschorst in een enkele buffer van zout waren. Hoewel beide methoden concluderen dat ARID1a GC op 200 mM en PBRM1 GC op 300 mM, de SSE produceert een welomschreven bindende profiel en zorgt voor een duidelijk onderscheid van de binding van deze twee complexen. Bovendien, in de niet-sequentiële methode, de hoeveelheid eiwit in de 400 en 500 mM NaCl-buffers geëlueerd lager is dan de 300 mM en is inconsistent tussen de drie wordt gerepliceerd. Hoewel dit probleem opgelost met verdere optimalisering van incubatie tijd en centrifugeren snelheid worden kan, illustreert dit het voordeel van de reproduceerbaarheid van SSE.
Dankzij onze optimalisatie vonden we dat andere chromatine complexen kunnen meer tijd nodig om te worden geëlueerd. In Figuur 2, we laten zien dat de transcriptionele activator, PBAF, GC van chromatine consequent tussen SSE met 3 min en 10 min incubatie tijd. In tegenstelling, vereist de elutie van de transcriptionele onderdrukker, Polycomb repressieve complexe 1 (PRC1), aangeduid met de BMI-1, een langere incubatietijd van chromatine8worden vrijgegeven. Dit fenomeen kan worden als gevolg van PRC1 wordt gelokaliseerd in compacter en ontoegankelijke gebieden van het genoom, of zou kunnen zijn als gevolg van differentiële bindende kinetiek voor de twee complexen.
Na optimalisatie voor een bepaalde proteïne, kunnen SSE worden gebruikt om te bestuderen hoe de sterkte van de binding aan eiwitten verandert in verschillende omstandigheden. SSE kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de effectiviteit van een inhibitor van de omwenteling van eiwit-eiwitinteractie. We gebruikt om aan te tonen van dit concept, (+) JQ1, oftewel een inhibitor van BRD4 bromodomain, om te onderzoeken hoe het BRD4 bindende (Figuur 3a)9gewijzigd. We geïsoleerd kernen van 4 miljoen OVCA429 cellen. Als u wilt verwijderen van een niet-afhankelijke BRD4, werd een eerste 0 mM wassen uitgevoerd op beide monsters. Dan een standaard die SSE werd uitgevoerd met DMSO of 1 µM (+) JQ1 toegevoegd aan elke fractie. Monsters werden gedurende 5 minuten geïncubeerd. We kunnen vaststellen dat de BRD4 eerder GC in aanwezigheid van de Inhibitor van de omwenteling in vergelijking met DMSO. Om aan te tonen dat JQ1 (+) specifiek voor BRD4, we wiste voor ARID1a en zag geen verandering in de elutie (Figuur 3b).
Volgende die wij hoe binding aan eiwitten kan worden gewijzigd onderzocht wanneer het landschap van de chromatine is gewijzigd. BRD4 bevat twee bromodomains dat geacetyleerd lysine residuen op Histon staarten10herkennen. Het vergroten van het niveau van Histon acetylation, we OVCA429 cellen met 10 µM van het histone deacetylase remmer suberanilohydroxamic zuur (SAHA) voor 3 h. SAHA behandeld (10 µM) werd toegevoegd aan alle de buffers tijdens de SSE. Door het verhogen van de wereldwijde Histon acetylation niveaus, waargenomen toename van BRD4 bindend (figuur 4a). Wanneer bevlekken voor ARID1a, observeren we strengere binding van ARID1a, dat is niet verwonderlijk omdat subeenheden van de BAF complex, zoals BRG1, BRM en BRD9, alle bromodomains10,11 (figuur 4b bevatten).
Tot slot, om te exposeren hoe SSE kan worden gebruikt om te kijken hoe de binding aan eiwitten verandert wanneer cellen genomic veranderingen ervaren, we geïnduceerde dubbele gestrande DNA-einden met de topoisomerase II remmer, Doxorubicine12. Wij HEK293T cellen met 1 µM van Doxorubicine behandeld voor een uur en cellen te herstellen voor drie uur toegestaan. Na het uitvoeren van de SSE, wiste we voor PBRM1, die bij DNA schade reparatie13 betrokken is. We waargenomen twee pieken voor de PBRM1 binding: een op 300 mM en een 500 mm NaCl (Figuur 5). Dit suggereert dat sommige van de PBRM1 bevolking normaal is bindend, maar een subset van PBRM1 is meer strak gebonden aan chromatine na DNA-schade. Dit is slechts één voorbeeld van het gebruik van SSE te onderzoeken hoe de chromatine interacties worden gewijzigd in reactie op verschillende externe stimuli.
Figuur 1: Niet-sequentiële vergeleken met sequentiële zout extracties in OVCA429 cellen
A) Immunoblots en kwantificering van drie onafhankelijke repliceert van ARID1a en PBRM1 elutie profielen door de sequentiële zout extractiemethode. B) Immunoblots en kwantificering van drie onafhankelijke replicatieonderzoeken voor ARID1a en PBRM1 elutie profiles in de niet-sequentiële zout extractiemethode. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Vergelijking van incubatie tijden van PBAF en PRC1 elutie profielen
A) vergelijking van PBAF (PBRM1) elutie profielen met 3 en 10 minuten incubatie tijd. B) vergelijking van PRC1 (BMI-1) elutie profielen met 3 en 10 minuten incubatie tijd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Effectiviteit van (+) JQ1 op de remming van BRD4-bindende
A) elutie patroon van BRD4 in aanwezigheid van 1 µM (+) JQ1 in vergelijking met DMSO controle in OVCA429 cellen. B) elutie Profiel van ARID1a in aanwezigheid van 1 µM (+) JQ1 in vergelijking met DMSO controle in OVCA429 cellen. Intensiteit van de band is geïndiceerd voor 0 mM - 500 mM breuk met DMSO of (+) JQ1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Wijzigingen in de bindende als chromatine aangelegde wordt gewijzigd
A) gedurende 3 uur in vergelijking met DMSO behandeling, behandeld met 10 µM SAHA vergelijking van BRD4 elutie van OVCA429 cellen. B) elutie profielen van ARID1a van OVCA429 cellen behandeld with10 µM SAHA vergeleken met DMSO. Intensiteit van de band is geïndiceerd voor 0 mM - 500 mM breuk met DMSO of SAHA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Wijzigingen in PBRM1 bindend na DNA-schade
SSE resultaten voor de PBRM1 binding van HEK293T cellen behandeld met 1 µM Doxorubicine. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Karakterisatie van eiwitten en chromatine interacties via zout extracties is een gemeenschappelijke methode die heeft gewerkt voor decennia14,15; echter, het is niet systematisch geoptimaliseerd voor te onthullen zijn volle nut. We laten zien hoe deze sequentiële methode biedt een snelle en goedkope manier te onderscheiden van wijzigingen in de chromatine bindend wanneer het eiwit of het milieu wordt gewijzigd. SSE is zeer flexibel en optimaliseerbare, en nog belangrijker is, het is technisch eenvoudig en vereist geen gespecialiseerde apparatuur. De belangrijkste aspecten die worden geoptimaliseerd moeten voor het begin van zijn: vanaf celaantal, hypotone buffer voorwaarden en incubatietijd.
Het belangrijkste aspect van celaantal is dat er consistente tussen alle monsters. Wanneer we kijken naar BAF complexen, geeft 8 miljoen cuvetten een goed profiel van hoe deze complexen zijn bindend; echter, het aantal cellen (of het bedrag van de buffer) wellicht worden aangepast op basis van de overvloed van de proteïne van belang. Het is belangrijk op te merken dat met minder cellen is uitdagend omdat bij 400 mM en 500 mM NaCl is het moeilijk om te visualiseren van de chromatine-pellet. Het is essentieel om ervoor te zorgen dat de pellet wordt niet overgedragen met het supernatans dat na 400 mM NaCl.
Om nauwkeurig evalueren nucleaire eiwitten, moeten de kernen intact blijven totdat ze zijn lysed met 0 mM NaCl mRipa oplossing. Veel gebruikte hypotone oplossingen zijn te hard voor cellijnen zoals HEK293T en HeLa cellen. Voor deze cellijnen, is het aanbevolen om het gebruik van de gemodificeerde Buffer A.
Tot slot kan de incubatietijd variëren afhankelijk van het experiment. Voor BAF subeenheden verandert het patroon van de elutie niet tussen een 3 min en 10 min incubatie; echter verandert de elutie van het PRC1-complex drastisch afhankelijk van hoe lang de monsters worden geïncubeerd. Bovendien, bij de beoordeling van het effect van een inhibitor van de omwenteling op de binding van de doelgroep, wellicht de incubatietijd worden geoptimaliseerd afhankelijk van de kinetiek van de Inhibitor van de omwenteling.
Als u het experiment uitvoert, is het belangrijk dat u zo consistent mogelijk met de behandeling van de monsters. Elke fractie, moet het zout buffer worden toegevoegd aan elk monster vóór homogenisering zodat elk monster wordt even blootgesteld. Het punt van pipetteren is te breken van de chromatine en help vrijlating de afhankelijke eiwitten. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de pellet passeert het uiteinde van de pipet. Vooral bij gebruik van een groter aantal cellen, is de chromatine pellet uitdagend om het passeren van het uiteinde van de Pipet de eerste paar keer. We hebben gevonden dat een 1 mL tip het beste voor dit werkt, zoals met kleine aftappen van de tip tegen de onderkant van de micro-centrifugebuis, zijn wij in staat tot het opstellen van de pellet in de tip. Na het passeren van de chromatine pellet via de tip vijftien keer, moet de pellet soepel doorlopen de tip, hoewel het niet zal oplossen. Na het broeden van de monsters op ijs en het isoleren van de chromatine door middel van centrifugeren, zorgt verwijderen van de bovendrijvende substantie met een 200 µL pipette uiteinde voor maximale verwijderen zonder het verstoren van de chromatine-pellet.
Hoewel SSE technische samenhang vereist, het is simpel, eenvoudig en kan uitgevoerd worden met gemeenschappelijke middelen van het laboratorium. Het is belangrijk op te merken dat de ware kracht van deze methode is wanneer het is gekoppeld aan andere phenotypical onderzoeken. Bijvoorbeeld met behulp van deze techniek, vergeleken we de bindende profielen van PBRM1 wanneer elk van de zes bromodomains werden gemuteerd, we bepaald dat alle, maar een van de bromodomains betrokken waren bij de binding van PBRM1 aan variërende graden7. Intrigerend, vonden we dat de bromodomains die het belangrijkst voor bindende waren ook essentieel voor de verordening van de PBRM1 van genexpressie en controle cel proliferatie7 waren. We ook de veranderingen in de binding van deze mutanten naar een discrete genomic locus gevalideerd door kwantitatieve ChIP-qPCR7.
We hebben laten zien slechts een paar voorbeelden van hoe deze techniek kan worden gebruikt voor het bestuderen van de chromatine-eiwit interacties; we hebben echter in ons lab gevonden dat SSE een veelzijdig instrument is voor het onderzoeken van een breed scala van vragen met betrekking tot de chromatine lezer eiwitten. In combinatie met andere analyses, deze techniek vergemakkelijkt ons vermogen verhelderen van de functionaliteit van de componenten bestaande uit deze werken van eiwitcomplexen. Door inzicht in het belang van afzonderlijke domeinen, die we kunnen identificeren of ze zijn potentiële therapeutische doelen voor de ontwikkeling van een inhibitor van de omwenteling die chromatine vereniging blokkeert.
We hebben aangetoond hoe SSE kan worden uitgebreid om de doeltreffendheid van een klein molecuul remmer op binding aan eiwitten te chromatine. Bovendien, door remming van de epigenetische schrijvers en gummen, kunt SSE bepalen de relatie tussen PTM niveaus en lezer eiwitten. We hebben ook aangetoond dat de SSE kan worden gebruikt voor het bepalen van de veranderingen in bindende in reactie op externe prikkels zoals DNA-beschadigingen. Hoewel dit een eenvoudige techniek, wanneer toegepast in de juiste omstandigheden, kan het sterk onze kennis van chromatine en haar regelgevende eiwitten verder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een V geleerde award (V2014-004) en een V geleerde plus award (D2016-030) van de Stichting V voor kankeronderzoek, en een Amerikaans kanker maatschappij institutionele onderzoeksbeurs (ACS IRG Grant 58-006-53) aan de Purdue University Center for Cancer Onderzoek. E. G. P. werd gesteund door de Borch Graduate Endowment Award aan de Purdue University medicinale chemie en moleculaire farmacologie departement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
References
- Ramakrishnan, V. Histone structure and the organization of the nucleosome. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).
- Musselman, C. A., Lalonde, M. -E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, (2017).
- Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting. Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).
- Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma. J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).
- Kerppola, T. K. Polycomb group complexes--many combinations, many functions. Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).
- Filippakopoulos, P., et al. Selective inhibition of BET bromodomains. Nature. 468 (7327), 1067-1073 (2010).
- Filippakopoulos, P., et al. Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family. Cell. 149 (1), 214-231 (2012).
- Sanchez, R., Zhou, M. -M. The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription. Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).
- Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics. Biochim. Biophys. Acta - Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).
- Kakarougkas, A., et al. Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin. Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).
- Lee, S. Y., Park, J. -H., Kim, S., Park, E. -J., Yun, Y., Kwon, J. A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks. Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin. J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).
