Summary
Sequentielle Salzgewinnung gebunden Chromatin Proteine ist ein nützliches Werkzeug für die Bestimmung der Bindungseigenschaften von großen Proteinkomplexen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Rolle der einzelnen Untereinheiten oder Domänen in die allgemeine Affinität von einem Proteinkomplex, bulk-Chromatin zu bewerten.
Abstract
Aufklärung der Bindungseigenschaften von Chromatin-targeting Proteinen kann aufgrund der komplexen Natur des Chromatins und der heterogenen Natur der meisten Säugetiere Chromatin-modifizierende komplexe sehr anspruchsvoll sein. Um diese Hürden zu überwinden, haben wir einen sequenzielle Salzgewinnung (SSE) Assay für die Bewertung der relativen verbindliche Affinitäten der Chromatin-gebundene komplexe angepasst. Dieser Assay einfach und unkompliziert einsetzbar von nicht-Experten bewerten die relative Differenz verbindliche Affinität von zwei verwandte komplexe, die Veränderungen in Affinität eines Komplexes als eine Untereinheit verloren ist oder eine einzelnen Domäne wird inaktiviert und die Veränderung der Bindungsaffinität nach Veränderungen der Chromatin-Landschaft. Durch das nacheinander wieder aufhängen Bulk Chromatin in steigenden Mengen von Salz, können wir die Elution eines bestimmten Proteins aus Chromatin Profil. Diese Profile können wir bestimmen, wie Änderungen in einem Chromatin-modifizierende komplex oder Änderungen an der Chromatin-Umwelt bindender Wechselwirkungen auswirken. Kupplung SSE mit anderen Tests in Vitro und in Vivo , bestimmen wir die Rollen der einzelnen Domänen und Proteinen auf die Funktionalität eines Komplexes in einer Vielzahl von Chromatin-Umgebungen.
Introduction
DNA-Verordnung in eukaryotischen Zellen ist eine komplizierte und anspruchsvolle System, die durch ein Sortiment von Proteinen hochstrukturiert ist, die Antworten auf die intrazelluläre und extrazelluläre Stimuli zu koordinieren. DNA ist Histon Octamers zur Form Nukleosomen, gewickelt, lose verteilt entlang DNA oder in engen Spulen1verdichtet werden können. Diese strukturelle Anordnung der DNA und Histonen bekannt als Chromatin, die durch ein Netz von Proteinen, die lesen, schreiben und löschen Post translationale Modifikationen (PTM) auf Histone2geregelt ist. Einige Histon PTMs, wie Acetylierung, ändern die Ladung der Aminosäure, die sie auf, abgelagert werden Wechselwirkungen zwischen Histonen und DNA-2zu verändern. Histon-PTMs dienen auch zur transkriptionellen Regulierungsbehörden, Chromatin Remodelers, DNA-Schäden reparieren Maschinen und DNA-Replikation Maschinen auf bestimmte Regionen des Genoms3zu rekrutieren.
Die meisten Methoden zur Untersuchung Chromatin Wechselwirkungen Sonde kleinen Interaktionen oder große genomweite Analysen beinhalten. In Vitro Bindung Studien nutzen oft einzelne rekombinante Domains mit Histon-Peptide oder DNA in Tests wie Elektrophorese Mobilität Verschiebung Assays (EMSA), Isotherm Titration Kalorimetrie, Fluoreszenz-Polarisation und Peptid Pulldowns. Da diese Tests in der Regel auf eine einzelne Protein-Domäne konzentrieren, sie erleichtern das Verständnis von einem kleinen Stück des Puzzles, aber lassen Sie sich nicht uns zu verstehen, die kooperative Art der multidomain Proteine, geschweige denn ihre Rolle in Multi-protein -komplexe. Eine weitere Schicht der Komplexität wird durch die heterogene Zusammensetzung der meisten Säugetiere Chromatin-modifizierende komplexe hinzugefügt. Diese Heterogenität Protein macht in Kombination mit der dynamischen Natur der Chromatin-Landschaft, eine Herausforderung, um die in Vivo an Chromatin in VitroInteraktionen der Chromatin Proteine binden zu rekapitulieren.
In-Vivo -Methoden haben bedeutende Fortschritte gemacht; Allerdings sind sie oft teuer, zeitaufwendig und technisch anspruchsvoll. Chromatin Immunopräzipitation gefolgt durch Sequenzierung (ChIP-Seq) ist sehr nützlich für die Bestimmung der Lokalisierung von Proteinen und Histon-Modifikationen in das Genom, aber es erhebliche Optimierung4 erfordert. Proteine sind oft vernetzt, Chromatin, Interaktionen zu bewahren; Allerdings können künstliche Interaktionen produzieren und kann dazu führen, dass Epitop Maskierung5. Darüber hinaus erfordern die Immunperoxidase (IP) hochspezifische Antikörper und umfassende Optimierung von DNA zu scheren und IP-Bedingungen von ChIP-qPCR mit einer bekannten Bindungsstelle, die oft nicht verfügbar- a-prioriist. Nach der Optimierung von ChIP Bedingungen Verarbeitung der Proben ist aufwändig und erfordert mehrere Wochen bis Monate, zu sequenzieren und analysieren. Obwohl dieses Verfahren von unschätzbarem Wert für die Ermittlung der Lokalisierung von Chromatin Proteine gebunden über das Genom, die Kosten und Zeitaufwand machen es unerschwinglich zur Verwendung dieser Methode zum Generieren von Hypothesen darüber, wie kleine Veränderungen globalen Bindungseigenschaften beeinflussen kann .
In diesem Artikel beschreiben wir wie ein sequentielle Salzgewinnung (SSE) Assay verwendet werden kann, global verbindliche Profile von Chromatin-gebundene Proteine untersuchen und unterscheiden, wie Änderungen in einem Protein, komplexe oder globale PTM Profil Interaktionen verändern können. Obwohl Salz Extraktionen allgemein und allgemein verwendete Technik sind, zeigen wir, wie diese sequenziellen Methode äußerst reproduzierbare und vielseitig ist. SSE erlaubt uns zu charakterisieren, wie eine einzelne Untereinheit eines Komplexes oder sogar einer einzelnen Domäne, die Anlage insgesamt Affinität für Schüttgut Chromatin beiträgt. SSE kann auch verwendet werden, um festzustellen, ob die Bindung eines Proteins ist beeinflusst durch Änderungen im Chromatin Landschaft, bietet interessante Hypothesen für Histon Mark targeting, die mittels ChIP-Seq und andere Genom breite Studien bestätigt werden können.
Wir ursprünglich diese Methode von Wu Et Al., prüfen der Funktion des Polybromo1 angepasst (PBRM1) in der Bindung der PBAF Chromatin Fertighausbau6,7. Mit dieser Technik, wir die Rolle des PBRM1 für Chromatin Bindung innerhalb der PBAF Chromatin Umbau komplexer und dann bestimmt den relative Beitrag der sechs einzelnen Bromodomänen zu dieser Funktion7.
Hier beschreiben wir wie Sie diese Methode, um Chromatin Bindung in verschiedene Zelltypen zu beurteilen, die relative Bindungsaffinität von ähnlichen Chromatin bearbeiten komplexe, untersuchen die Verschiebung eines Proteins aus Chromatin durch einen chemischen Inhibitors erkunden zu optimieren und Ermittlung die Auswirkungen von Chromatin Bindung nach Veränderungen der Chromatin-Landschaft.
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Protocol
1. Vorbereitungen
- vorbereiten 100 mL Hypotonische Lösung Puffer A: 0,3 M Saccharose, 60 mM KCl, 60 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA, und 0,5 % NP-40. Bei 4 º c.
Hinweis: Einige Zelllinien, wie HEK293T, erfordern weniger strenge Lysiereinrichtung Auflagen. Wenn Kerne leicht lösen, benutzen Sie geändert Puffer A: 25 mM HEPES pH 7.6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 0,05 mM EDTA 0,1 % NP-40 und 10 % Glycerin. - Bereiten eine 250 mL Stammlösung 2 X mRIPA Lösung: 100 mM Tris pH 8.0, 2 % NP-40 und 0,5 % Natrium-Deoxycholate.
- Bereiten eine 100 mL Stammlösung 5 M NaCl.
- Mit 2 X mRIPA und 5 M NaCl-Lösungen, 50 mL 1 X mRIPA-Lösung für jede der sechs Salzkonzentrationen vorbereiten: 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM und 500 mM NaCl. Vor Beginn des Experiments, alle Lösungen auf Ice cool
- Grow Zellinien gewünschten Bedingungen.
Hinweis: Wenn Sie die Auswirkungen der umzuwerfen eines Proteins zu bestimmen, muss SSE für die Knockdown Linie mit Wildtyp-Zellen verglichen werden. Diese SSE muss nebeneinander durchgeführt werden. Für Beispiele für die Verwendung von chemischen Inhibitoren oder Reize, siehe Abschnitte 3-5.
2. Grundlegenden sequenzielle Salzgewinnung
- Ernte 8 Millionen Zellen der einzelnen Zustand und zweimal mit 5 mL Eis kaltem PBS waschen.
Hinweis: Es ist entscheidend für die gleiche Anzahl von Zellen zu entsprechenden Proteinkonzentrationen haben. Die genaue Anzahl der Zellen müssen für die einzelnen Zell-Linien oder bestimmte Proteine optimiert werden. Es ist wichtig, nicht zu viele, da der Anstieg der Proteinkonzentrationen Beobachtung der Elution Kurve, verhindert das Gleichgewicht Bindung abhängt. Jedoch mit zu wenig Zellen möglicherweise nicht genügend Protein um die Kurve zu erkennen und das Chromatin-Pellet ist schwieriger zu isolieren und verloren zwischen Brüchen. - Wieder aussetzen Zellen in 1 mL Puffer A + Protease-Inhibitoren, transfer in 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren und drehen oben über Boden bei 4 ° c für 10 min.
- Isolieren die Kerne durch Zentrifugation bei 6000 X g für 5 min bei 4 ° c.
Hinweis: Nach diesem Schritt sollte die Kernhülle noch intakt sein. Wenn die Kernhülle intakt ist, wird das Pellet vollständig neu aussetzen; jedoch wird wenn der Umschlag lysiert und das Chromatin wird freigegeben, das Pellet nicht erneut aussetzen. Wenn die Kernhülle nach Puffer A Inkubation nicht intakt ist, verwenden Sie modifiziert Puffer A. - Fügen Sie 200 µL mRIPA 0 mM NaCl + Protease-Inhibitoren, jedes Kerne Pellet vor Aussetzung neu Pellet. 15-Mal mit einer 1-mL-Pipette pipettieren, um jede Probe zu homogenisieren. Das Pellet sollten leicht wieder auszusetzen, jedoch wird die Kerne lösen, wie es Pipettieren ist und die Probe wird dick und klebrig und schwer zu pipette.
- Um das Pellet in der Spitze aufzustellen, tippen am Ende die Pipettenspitze gegen die Unterseite des die Zentrifugenröhrchen. Das Pellet wird nicht vollständig auflösen, sobald die DNA wird aus den Kernen entlassen, aber Pipettieren bricht es auf
- Wenn alle Proben homogenisiert worden sind, brüten die Proben auf Eis für 3 min.
Hinweis: Die Inkubationszeit kann je nach Protein des Interesses optimiert werden müssen. - Isolieren Chromatin Pellet durch Zentrifugieren die Proben für 3 min bei 6500 X g bei 4 º c.
- Transfer überstand zu einer Zentrifuge sauber 1,5 mL Tube. Dies wird die Fraktion 0 mM sein. Diese 0 mM mRIPA Lösung kann fungieren als ein Waschschritt zur Lyse der Kerne und entfernen Sie alle losen Proteine nicht im Zusammenhang mit Chromatin.
- Fügen Sie 200 µL mRIPA 100 mM NaCl + Protease-Inhibitoren, jedes Chromatin Pellet vor Aussetzung neu Pellet. Unterteilen Sie das Chromatin Pellet durch pipettieren die Kugel nach oben und unten 15 Mal.
Hinweis: Es ist entscheidend für die Anzahl der Wiederholungen entsprechen die Pellet in pipettiert. - Inkubation für 3 min auf Eis. Diese Inkubationsschritt kann alle Proben einen Gleichgewichtszustand zu erreichen, was besonders wichtig ist, gibt es mehrere Proben.
- Zentrifuge bei 6500 X g für 3 min bei 4 ° c und Übertragung Überstand auf eine saubere 1,5 mL-Tube.
- Wiederholen Sie 2,6-2.10 für die verbleibenden Salzkonzentrationen.
Hinweis: Nach 400 mM NaCl, mRIPA das Pellet sollte klar und glitschige und bleibe nicht am Boden des Röhrchens. Das Pellet in den Deckel des Zentrifugenröhrchen während des Überstands isoliert platziert werden kann. - Hinzufügen 70 µL 4 x Protein laden färben, jede Fraktion und laden Sie 30 µL der einzelnen Fraktionen auf ein SDS-Acrylamid-Gel für die western-Blot Analyse.
Hinweis: Um das verbindliche Profil des Proteins zu bestimmen, ist es wichtig, entsprechende Mengen an lysate, anstatt be-gleich Proteinkonzentrationen laden. - Führen Sie eine standard-western-Blot durch die Übertragung auf eine Membran und primären Antikörper für interessierender Proteine.
- , Das Protein aus dem Chromatin eluiert quantitate inkubieren der Blot in Infrarot-Fluoreszenz IRDye Sekundärantikörper und Bild Blot mit einem Imager. Während andere Methoden der Entwicklung verwendet werden können, empfehlen wir Fluoreszenz oder Infrarot-Bildgebung, wie es in der Natur mehr quantitative.
- Einsatz ImageJ oder ähnliche Software zu berechnen, die Intensität für das Protein an jede Salzkonzentration eluiert. Durch die grafische Darstellung der Band Intensität gegen die Salzkonzentration, die Elution Muster von Ihr Protein des Interesses bestimmt werden kann.
3. Sequentielle Salzgewinnung in Anwesenheit von ein " Leser " Inhibitor
- zwei Gruppen von Zellen (4 Millionen) zu ernten und isolieren die Kerne wie in einem standard SSE.
- Wieder auszusetzen, beide in 200 µL mRIPA 0 mM NaCl und 3 min inkubieren. Dadurch wird für die Entfernung von jedem kostenlos Protein in den Kernen.
- Fügen Sie 200 µL mRIPA 0 mM NaCl, jedes Pellet. Hinzufügen der Steuerelementsatz Inhibitor (2 µL 1 mm (+) JQ1) zu einer Probe oder DMSO.
- Rühren die Pellets durch Pipettieren 15mal und inkubieren Sie für 5 min auf Eis
- Zentrifuge bei 6500 X g für 3 min bei 4 ° c und Übertragung Überstand auf eine saubere 1,5 mL-Tube.
- 3.3-4 für die Salzkonzentrationen wiederholen und führen Sie eine standard-western-Blot.
4. Sequentielle Salzgewinnung in Anwesenheit von ein " Schriftsteller " Inhibitor
- Zellen mit dem Inhibitor (10 µM SAHA) zu behandeln oder DMSO für 3 h
- Ernte 4 Millionen Zellen für jede Behandlung.
- Führen ein standard SSE für die Proben mit dem Inhibitor hinzugefügt, um die Puffer.
5. Sequentielle Extraktion folgende DNA Salzschäden
- Behandlung von Zellen mit 1 µM Doxorubicin für 1 h.
- Wechseln Sie das Medium auf die Zellen und lassen sie wieder für 3 h.
- 8 Millionen Zellen zu ernten, und führen Sie die grundlegenden SSE.
6. Nicht-sequenziellen Salzgewinnung
- 12 Millionen Zellen ernten und waschen mit PBS.
- Kluft Zellen, so dass es 2 Millionen Zellen pro Mikro Zentrifugenröhrchen.
- Neu in 500 µL Puffer A und 10 min. inkubieren
- Isolieren Sie die Kerne durch Zentrifugation bei 6000 X g.
- In 200 µL der einzelnen mRIPA Puffer + NaCl pellets wieder auszusetzen.
- Homogenisieren jede Probe durch Pipettieren 15-Mal mit einer Pipettenspitze 1 mL.
- Inkubation auf Eis für 3 min.
- Isolieren das Chromatin durch Zentrifugation bei 6500 X g und übertragen den Überstand um Rohre zu reinigen. Hinzufügen von 70 µL Farbstoff zu laden und ausführen 30 µL auf einem SDS-Page-Gel für die western-Blot Analyse.
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Representative Results
In diesem Beitrag zeigen wir die Vorteile und Anwendungsmöglichkeiten der häufig verwendeten sequentielle Salzgewinnung (SSE) Methode, die wir aus der Literatur6angepasst haben. In Abbildung 1vergleichen wir die Reproduzierbarkeit der SSE, Proteine nicht sequenziell zu kassieren, indem die Elution Muster von ARID1a und PBRM1 zu erkennen. Wir beobachten immer wieder, dass ARID1a, BAF-Untereinheit elutes in erster Linie bei 200 mM NaCl und PBRM1, eine exklusive PBAF-Untereinheit, vor allem bei 300 mM NaCl elutes. Abbildung 1a zeigt drei unabhängige Wiederholungen von SSE mit 8 Millionen OVCA429 Zellen. Abbildung 1 b zeigt ein nicht-sequentielle Salzgewinnung wo Kerne von 2 Millionen Zellen isoliert in einem einzigen Salz Puffer wieder ausgesetzt wurden. Obwohl beide Methoden feststellen, dass ARID1a bei 200 mM ELUTES und PBRM1 bei 300 mM ELUTES, die SSE produziert eine wohldefinierte verbindliche Profil und ermöglicht eine klare Trennung der Bindung dieser zwei komplexe. Darüber hinaus in der nicht-sequenziellen Methode, die Menge an Protein in die 400 mM und 500 mM NaCl-Puffer eluiert ist niedriger als die 300 mM und steht im Widerspruch zwischen den drei Wiederholungen. Obwohl dieses Problem mit der weiteren Optimierung der Inkubation Zeit und Zentrifugation Geschwindigkeit gelöst werden kann, verdeutlicht dies die Reproduzierbarkeit Vorteil sse.
Durch unsere Optimierung fanden wir, dass andere Chromatin-komplexe erfordern mehr Zeit, um eluiert werden. In Abbildung 2zeigen wir, dass die transcriptional Aktivator, PBAF, von Chromatin konsequent zwischen SGVS mit 3 min und 10 min Inkubationszeiten ELUTES. Im Gegensatz dazu erfordert Elution von transkriptioneller Repressor, Polycomb repressiven Komplex 1 (PRC1), gekennzeichnet durch BMI-1, eine längere Inkubationszeit von Chromatin8freigegeben werden. Dieses Phänomen könnte konnte wegen PRC1 wird lokalisiert werden in kompakter und unzugänglichen Regionen des Genoms, oder durch differenzielle verbindliche Kinetik für die zwei komplexe.
Nach der Optimierung für ein bestimmtes Protein können SGVS verwendet werden, wie ändert sich die Stärke der Proteinbindung unter verschiedenen Bedingungen zu studieren. SSE kann verwendet werden, um die Wirksamkeit der Inhibitor Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen. Um dieses Konzept zu demonstrieren, haben wir (+) JQ1, die einen BRD4 Bromodomain-Hemmer ist, zu untersuchen, wie es verändert BRD4 Bindung (Abbildung 3a)9verwendet. Wir isolierten Kerne von 4 Millionen OVCA429 Zellen. Um alle ungebundenen BRD4 zu entfernen, wurde eine erste 0 mM waschen auf beide Proben durchgeführt. Hinzufügen von einem Standard, den sse mit DMSO oder 1 µM (+) durchgeführt wurde, JQ1 jede Fraktion. Proben wurden für 5 min inkubiert. Wir beobachten, dass BRD4 früher im Beisein der Inhibitor DMSO gegenüber elutes. Um zu zeigen, dass die (+) JQ1 spezifisch für BRD4 ist, haben wir für ARID1a ausgelöscht und sah keine Änderung der Elution (Abb. 3 b).
Als nächstes haben wir untersucht, wie die Proteinbindung verändert werden kann, wenn die Landschaft des Chromatins geändert wird. BRD4 enthält zwei Bromodomänen, die auf Histone Tails10Schimmelpilzschäden Lysin Rückstände zu erkennen. Zur Erhöhung der Histon-Acetylierung, behandelten wir OVCA429 Zellen mit 10 µM der Histon Deacetylase Inhibitor Suberanilohydroxamic Säure (SAHA) für 3 h SAHA (10 µM) wurde hinzugefügt, um die Puffer in der SSE. Durch die Erhöhung der globalen Histon Acetylierung, beobachteten wir eine Zunahme BRD4 verbindlich (Abb. 4a). Wenn für ARID1a beflecken, beobachten wir engere Bindung des ARID1a, das ist nicht verwunderlich, denn alle Untereinheiten der komplexen, wie BRG1, BRM und BRD9, BAF Bromodomänen10,11 (Abbildung 4 b) enthalten.
Zu guter Letzt zeigen wie SSE verwendet werden kann, zu schauen, wie die Proteinbindung ändert, wenn Zellen genomische Veränderungen erleben, induzierte wir doppelte stranded DNA-Brüchen mit Topoisomerase-II-Hemmer, Doxorubicin12. Wir behandelten HEK293T Zellen mit 1 µM von Doxorubicin für eine Stunde und erlaubt Zellen für drei Stunden zu erholen. Nach der Durchführung der SSE, ausgelöscht wir für PBRM1, die in DNA-Schäden reparieren13beteiligt ist. Wir beobachteten zwei Spitzen für PBRM1-Bindung: jeweils 300 mM und jeweils 500 mM NaCl (Abbildung 5). Dies deutet darauf hin, dass einige der PBRM1 Bevölkerung ist normalerweise verbindlich, aber eine Teilmenge der PBRM1 ist enger Chromatin nach DNA-Schäden verpflichtet. Dies ist nur ein Beispiel der SSE Verwendung um zu prüfen, wie Chromatin Interaktionen als Reaktion auf verschiedene äußere Reize verändert werden.
Abbildung 1: Nicht-sequentielle im Vergleich zu sequenziellen Salz Extraktionen in OVCA429 Zellen
(A) Immunoblots und Quantifizierung von drei unabhängigen repliziert der ARID1a und PBRM1 Elution Profile durch die sequentielle Salzgewinnung Methode. (B) Immunoblots und Quantifizierung von drei unabhängige Wiederholungen von ARID1a und PBRM1 Elution Profile in der nicht-sequentielle Salzgewinnung-Methode. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Vergleich der Inkubationszeiten von PBAF und PRC1 Elution Profile
(A) Vergleich von PBAF (PBRM1) Elution Profilen mit 3 bis 10-minütigen Inkubationszeiten. (B) Vergleich der PRC1 (BMI-1) Elution Profile mit 3 bis 10-minütigen Inkubationszeiten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Wirksamkeit der (+) JQ1 auf Hemmung BRD4 Bindung
(A) Elution Muster der BRD4 im Beisein von 1 µM (+) im Vergleich zur Kontrolle von DMSO in OVCA429 Zellen JQ1. (B) Elution Profil des ARID1a im Beisein von 1 µM (+) im Vergleich zur Kontrolle von DMSO in OVCA429 Zellen JQ1. Band-Intensität ist bei 0 mM - 500 mM Bruch mit DMSO oder (+) JQ1 angegeben. klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Veränderungen in der Bindung als Chromatin landschaftlich geändert wird
(A) Vergleich der BRD4 Elution von OVCA429 Zellen mit 10 µM SAHA für 3 Stunden im Vergleich zu DMSO Behandlung behandelt. (B) Elution Profile von ARID1a aus OVCA429 Zellen behandelt with10 µM im Vergleich zu DMSO SAHA. Band-Intensität ist für 0 bis 500 mM Bruch mit DMSO oder SAHA angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Änderungen in PBRM1 Bindung nach DNA-Schäden
SSE-Ergebnisse für PBRM1 Bindung von HEK293T Zellen behandelt mit 1 µM Doxorubicin. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Charakterisierung von Protein und Chromatin-Interaktionen durch Salz Extraktionen ist eine gängige Methode, die beschäftigt war für Jahrzehnte14,15; jedoch wurde es nicht systematisch vor optimiert, um den vollen Nutzen zu offenbaren. Wir zeigen, wie diese sequenziellen Methode bietet eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, Veränderungen im Chromatin Bindung zu unterscheiden, wenn das Protein oder die Umwelt geändert wird. SSE ist sehr anpassungsfähig und optimierbar, und wichtiger ist, es ist technisch einfach und erfordert keine spezielle Ausrüstung. Die wichtigsten Aspekte, die vor dem Start optimiert werden müssen: ab Zellzahl, hypotone Pufferbedingungen und Inkubationszeit.
Der wichtigste Aspekt der Zellzahl ist, dass sie zwischen den Proben im Einklang steht. Bei der Betrachtung der BAF-komplexe gibt mit 8 Millionen Zellen ein gutes Profil von wie diese komplexe verbindlich sind; Allerdings kann die Anzahl der Zellen (oder der Betrag des Puffers) müssen je nach der Fülle des Proteins des Interesses eingestellt werden. Es ist wichtig zu beachten, dass mit weniger Zellen schwierig ist, weil bei 400 mM und 500 mM NaCl es schwer ist, das Chromatin Pellet zu visualisieren. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Pellets nicht mit der Überstand nach 400 mM NaCl übertragen wird.
Um nukleare Proteine genau bewerten zu können, müssen die Kerne intakt bleiben, bis sie mit 0 mM NaCl mRipa Lösung lysiert werden. Viele häufig verwendete hypotone Lösungen sind zu hart für Zell-Linien wie HEK293T und HeLa-Zellen. Für diese Zelllinien empfiehlt es sich, den veränderten Puffer A. verwenden
Zu guter Letzt die Inkubationszeit hängt das Experiment ab. Für BAF Untereinheiten ändert die Elution Muster nicht zwischen einem 3 min und 10 min Inkubation; die Elution des PRC1 komplexes ändert sich jedoch drastisch je nachdem, wie lange die Proben inkubiert werden. Darüber hinaus kann bei der Beurteilung der Wirkung der Inhibitor an der Bindung seines Ziels die Inkubationszeit müssen je nach Inhibitor Kinetik optimiert werden.
Wenn Sie das Experiment durchführen, ist es wichtig, so konsistent wie möglich mit der Behandlung der Proben werden. Für jede Fraktion sollte Salz Puffer zu jeder Probe vor der Homogenisierung hinzugefügt werden, so dass jede Probe gleichmäßig ausgesetzt ist. Das Pipettieren ist das Chromatin und Hilfe Version der gebundenen Proteine aufzubrechen. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Pipettenspitze Pellet durchläuft. Vor allem, wenn Sie eine größere Anzahl von Zellen zu verwenden, ist das Chromatin Pellet herausfordernd, die Pipettenspitze die ersten paar Male durchlaufen. Wir haben festgestellt, dass ein 1 mL-Tipp am besten funktioniert, mit geringfügigen Anzapfung der Spitze gegen die Unterseite des Mikro Zentrifugenröhrchen, wir erarbeiten die Pellets in der Spitze können. Nach dem passieren der Chromatin-Pellet durch die Spitze fünfzehnmal, sollte das Pellet reibungslos durch die Spitze bewegen, obwohl es nicht auflösen wird. Nach Inkubation der Proben auf Eis und isolieren das Chromatin durch Zentrifugation, ermöglicht entfernen des Überstands mit einer 200 µL Pipettenspitze für die maximale Entfernung ohne Unterbrechung das Chromatin-Pellet.
Obwohl SSE technische Konsistenz erfordert, es ist einfach, unkompliziert und mit gemeinsamen Labor Ressourcen durchgeführt werden kann. Es ist wichtig zu beachten, dass die wahre Stärke dieser Methode ist, wenn es mit anderen phänotypischen Untersuchungen gekoppelt ist. Zum Beispiel mit dieser Technik, wir verglichen die verbindliche Profile der PBRM1, wenn jeder seine sechs Bromodomänen wurden mutiert, wir festgestellt, dass alle bis auf eines der Bromodomänen in der Bindung des PBRM1 beteiligt waren, zu unterschiedlichen Grad7. Interessanterweise, fanden wir, dass die Bromodomänen, die das wichtigste für die Bindung wurden auch für PBRM1 Regulierung der Genexpression und Kontrolle Zelle Verbreitung7wesentlich waren. Wir auch validiert die Veränderungen der Bindung dieser Mutanten zu einem diskreten genomischen Locus durch quantitative ChIP-qPCR7.
Wir haben gezeigt, dass nur ein paar Beispiele wie diese Technik verwendet werden kann, um Protein-Chromatin Interaktionen zu untersuchen; in unserem Labor haben wir jedoch festgestellt, dass SSE ein vielseitiges Werkzeug ist für die Untersuchung einer Vielzahl von Fragen zu Chromatin Leser Proteine. Diese Technik ermöglicht in Kombination mit anderen Analysen, unsere Fähigkeit erläutern Sie die Funktionalität der Komponenten bestehend aus diese Proteinkomplexe zu erarbeiten. Durch das Verständnis der Bedeutung der einzelnen Domains, können wir erkennen, seien es mögliche therapeutische Ziele für die Entwicklung der Inhibitor, das Chromatin Verband blockiert.
Wir haben bewiesen, wie SSE erweitert werden kann, um die Wirksamkeit einer niedermolekularer Inhibitor auf Proteinbindung, Chromatin zu bewerten. Darüber hinaus kann SSE durch Hemmung der epigenetischen Schriftsteller und Radiergummis, die Beziehung zwischen PTM und Leser Proteine bestimmen. Wir haben auch gezeigt, dass die SSE kann verwendet werden, um Änderungen in Bindung als Reaktion auf äußere Reize wie DNA-Schäden zu ermitteln. Obwohl dies eine einfache Technik, wenn unter den richtigen Bedingungen angewendet, kann es stark unser Wissen von Chromatin und seine regulatorische Proteine voraus.
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Disclosures
Die Autoren haben keinen finanziellen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch einen V Scholar Award (V2014-004) und ein Gelehrter V plus Award (D2016-030) von der V Foundation for Cancer Research und eine amerikanische Krebs Gesellschaft institutionelle Research Grant (ACS IRG Grant 58-006-53) an der Purdue University Center für Krebs unterstützt. Forschung. E. G. P. wurde von der Borch Graduate Endowment Award an der Purdue University medizinische Chemie und Molekulare Pharmakologie Abteilung unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
References
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