Summary
クロマチン結合タンパク質のシーケンシャル塩抽出は大きい蛋白質の複合体の結合特性を決定するための便利なツールです。このメソッドは、個々 のサブユニットまたは蛋白質の複合体をクロマチンを一括の全体的な親和性でドメインの役割を評価する使用できます。
Abstract
クロマチン ターゲット蛋白質の結合特性の解明は、クロマチンの複雑な性質およびほとんどの哺乳類のクロマチン修飾錯体の異種の性質のために非常に挑戦することができます。これらのハードルを克服するために我々 は、クロマチン結合複合体の相対結合親和性を評価するためのシーケンシャル塩抽出 (SSE) アッセイを適応しています。結合 2 つ関連複合体、複合体サブユニットが失われたまたは個々 のドメインを無効にするとときの親和性の変化、変化の親和性の差を評価する非専門家によるこの簡単でわかりやすい分析を使用できます。親和性クロマチンの風景に変更しました。順番に塩の量を増やすことで一括クロマチン再懸濁、クロマチンから特定のタンパク質の溶出プロファイルできたら。これらのプロファイルを使用して、我々 はクロマチン修飾複合体の変化やクロマチン環境に変更が結合の相互作用に与える影響を確認することができます。他のin vitroとin vivoアッセイと SSE をカップリング、個々 のドメインとクロマチン環境の様々 な複合体の機能タンパク質の役割を判断できます。
Introduction
真核細胞における DNA の規制は、細胞内および細胞外刺激に対する応答を調整するタンパク質の品揃えによってしっかりと制御されている複雑で高度なシステムです。DNA がヒストン octamers フォーム ヌクレオソーム DNA に沿って分布やタイトなコイル1に圧縮する疎にラップされました。DNA とヒストンのこの構造の配置は、クロマチン、読み取り、書き込み、およびヒストン2ポスト並進変更 (PTM) を消去するタンパク質のネットワークによって規制されていると呼ばれます。アセチル化などいくつかのヒストン Ptm、ヒストンと DNA の2間の相互作用を変更することで、沈殿するアミノ酸の料金を変更します。また、ヒストン Ptm は転写制御因子、クロマチンの remodelers、DNA 損傷修復機構とゲノム3の特定の領域に DNA 複製機械を採用になります。
クロマチンの相互作用を研究するためのほとんどのメソッドは小規模な相互作用プローブまたは大規模なゲノムワイドな解析を含みます。結合試験体外はしばしば電気泳動の移動性シフト試金 (EMSA)、等温滴定型熱量測定、蛍光偏光、ペプチド プルダウンなどのアッセイのヒストン ペプチドや DNA と個々 の遺伝子組換えドメインを利用します。これらの試金は通常個々 のタンパク質ドメインに焦点を当てる、彼らは、パズルの小さなピースの理解を容易にするが、多蛋白質の役割ではおろか、マルチ ドメイン蛋白質の共同の性質を理解する私たちを許可して複合体。ほとんどの哺乳類のクロマチン修飾錯体の異種合成による複雑さの別の層が追加されます。この蛋白質の不均一性クロマチン風景の動的な性質との組み合わせで難しく、体内へのバインド クロマチン蛋白質の相互作用クロマチン体外を要約します。
生体内での方法を行った進歩;ただし、彼らはしばしば高価な時間のかかる作業、技術的に困難です。4の大幅な最適化が必要ですしかし、クロマチン免疫沈降 (チップ seq) を配列することによって続いて、遺伝子、ヒストン修飾とタンパク質の局在を決定するため便利です。タンパク質が多い相互作用; を維持するクロマチンへの架橋しかし、これは人工の相互作用を作り出すことができる、5をマスキング エピトープを引き起こす可能性があります。さらに、特異性の高い抗体や DNA のせん断とチップ qPCR が頻繁に利用可能な事前既知のバインディングのサイトを使用して IP 条件の大規模な最適化 immunoprecipitations (IP) が必要です。チップの条件の最適化後、試料の加工は高価とシーケンス分析して数ヶ月に数週間が必要です。この方法は貴重なクロマチンの局在を特定するためゲノム、コストの間で蛋白質をバインドおよび時間のコミットメントでは、小さな変化が大域結合特性に与える影響についての仮説を生成するこのメソッドを使用する法外です.
本稿で我々 は逐次塩抽出 (SSE) 試金を使用してクロマチン結合蛋白質の大域結合プロファイルを確認し、蛋白質、複雑なまたはグローバル PTM のプロファイルに変更することができます相互作用を変更する方法を区別する方法について説明します。塩抽出の一般的に、広く使用されている手法ですが、この逐次法が高い再現性で汎用性の高い方法を示す.SSE の複雑なまたは単一のドメインも 1 つサブユニットが一括クロマチン複合体の全体的な親和性に貢献する方法を特徴付けることができます。蛋白質の結合はヒストン マーク ターゲット チップ seq と他のゲノム広い調査を使用して確認することができます興味深い仮説を提供するクロマチン環境の変化によって影響がかどうかを決定するため、SSE を使用もできます。
我々 はもともとこのメソッドから Wu et al., Polybromo1 の機能を調べるため、適応 (PBRM1) PBAF クロマチン remodeler6、7の結合に。この手法を使用すると、我々 は複雑な改造 PBAF クロマチン内クロマチンの結合のための PBRM1 の役割を決定、[この関数7六つの個人 bromodomains の相対的な寄与を決定します。
ここで化学剤によるクロマチンからタンパク質の変位を確認する似たようなクロマチン複合体の変更の相対結合親和性を評価するために、異なったセルタイプにクロマチンの結合を探索するこのメソッドを最適化する方法について説明し、クロマチンの風景に変更後のクロマチンの結合の効果を決定します。
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Protocol
1。 準備
0.5%、60 mM Tris pH 8.0、2 ミリメートルの EDTA、60 mM KCl- 準備 100 mL の低張性溶液バッファー a: 0.3 M ショ糖 NP 40。4 ° C でストア
。 注: HEK293T など、いくつかの細胞溶解のより少なく厳しい条件が必要です。核は簡単に分離、変更バッファー a: 25 mM HEPES pH 7.6、25 mM KCl、5 mM MgCl 2、0.05 ミリメートルの EDTA、0.1 %np-40、および 10% グリセロールを使用します 。
- 2 x mRIPA ソリューションの 250 mL の原液を準備: 100 mM Tris pH 8.0、デオキシ コール酸ナトリウム NP-40、および 0.5% 2% します 。
- 5 M nacl 100 mL 原液を準備します 。
- ごとに六つの塩の集中の 1 x mRIPA 溶液 50 mL を準備 2 x mRIPA と 5 M NaCl 水溶液を使用して: 0 mM、100 mM、200 mM、300 mM、400 mM と 500 mM の NaCl。実験を開始する前に氷のすべてのソリューションをクールな 希望の条件の下で細胞の
- 成長します
。 注: 蛋白質をノックダウンの効果を判断するには場合、ノックダウンのラインのための SSE は野生型細胞と比較する必要があります。これらの SSE は、サイド バイ サイド実行する必要があります。化学剤や刺激を使用しての例については、セクション 3-5 を参照してください 。
2。基本的なシーケンシャル塩抽出
- 収穫 800 万セルそれぞれの条件し、5 mL の氷冷 PBS で 2 回洗って
。 注: 同等のタンパク質濃度を持っている細胞の数と同じ数を持つことが重要です。セルの正確な数は、個々 のセルの行または特定の蛋白質のために最適化する必要があります。持っていることが重要だ、蛋白濃度の増加は平衡バインディングに依存して溶出曲線の観察を防ぐため、あまりにも多く。ただし、あまりにも少数の細胞とされない場合があります、曲線を検出する十分なタンパク質とクロマチン ペレットは困難に分離し、分数間に失われることができます 。
- 1 mL のバッファー A + プロテアーゼ阻害剤で細胞を再停止、1.5 mL のマイクロ遠心チューブ、および 4 ° C で 10 分間で下回転トップに転送
- は 4 ° C で 5 分間 6000 × g で遠心分離によって核を分離します
。 注: この手順後核封筒まだそのままでなければなりません。ペレットが完全に中断されます再核封筒がそのままの場合ただし、封筒を分離するか、クロマチンが解放されると、ペレットは再度中断します。核封筒がない場合そのままバッファー A インキュベーション後、バッファー A の変更を使う
ペレットを再懸濁の前に核ペレットに - 追加 200 μ mRIPA 0 mM NaCl + プロテアーゼ阻害剤。15 回を 1 mL ピペットでピペッティングによって各サンプルを均質化します。ペレットを容易に中断する再、戻それは厚さと粘着とピペットに困難なサンプルになると、核が溶解させます。 ただし。
- の先端に餌を描く、遠心分離機管の底面に対してピペット チップの端をタップするために
- 。一度、核からの DNA をリリース ピペッティングことが壊れますので、ペレットは完全に分解しない
- 3 分の氷の上のすべてのサンプルをインキュベートすべての試料をホモジナイズ時
メモ: インキュベーション時間を興味の蛋白質によって最適化する必要があります 。
- 4 ° C で 6500 x g で 3 分のサンプルを遠心分離によって分離クロマチン ペレット 。
- きれいな 1.5 mL 遠心分離機に転送清管。これは 0 mM 分数になります。この 0 mM mRIPA ソリューションの核溶解洗浄ステップとして機能およびクロマチンに関連付けられていない任意の緩やかな蛋白質を削除できます 。 クロマチン ペレット ペレットを再懸濁の前に
- を追加 200 μ L mRIPA 100 mM の NaCl + プロテアーゼの阻害剤。上下に 15 回ペレットをピペッティングによるクロマチン ペレットを分割します
。 注: でペレット戻回数と一致する重要です 。
- 3 分間氷の上加温。この潜伏ステップにより、複数のサンプルがある場合、特に重要である平衡状態に到達するすべてのサンプル 。
- 6500 x g で 4 ° C ときれいな 1.5 mL チューブに上清転送で 3 分間遠心します 。
- は残りの塩濃度 2.6 2.10 を繰り返します
。 注: 400 mM の NaCl 後、mRIPA ペレットべきはっきりと取れ、管の下部に滞在されません。ペレットを分離した上清中の遠心分離機管の蓋に配置できます 。
- 蛋白質のローディング x 4 の追加 70 μ L 各分画に染めるし、西部のしみの分析の SDS アクリルアミドゲルに各画分の 30 μ L をロードします
。 注: 蛋白質の結合プロファイルを決定する、それが重要ライセート、ロードよりもむしろ等しい蛋白質濃度と同等のボリュームをロードします 。
- 膜に転送することによって標準的な西部のしみを実行し、興味の蛋白質の一次抗体を使用します 。
- は、クロマチンから溶出する蛋白質を量的に表わすことでは、赤外蛍光 IRDye 二次抗体にしみと、撮像素子と画像のしみを孵化させなさい。開発の他のメソッドを使用できますが、お勧めします蛍光や赤外線撮像、自然の中より定量的である 。
- 使用 ImageJ または同様のソフトウェアごとの塩分濃度で溶出蛋白質に対する強度を計算します。塩分濃度に対するバンド強度をグラフ化、興味の蛋白質の溶出パターンを判定できます 。
3。存在下で連続塩抽出、" リーダー " 阻害剤
- 細胞 (400 万) の 2 つのセットを収穫し、標準の SSE のように核を分離します 。
- は再 mRIPA 0 mM の NaCl を 200 μ l 添加の両方のセットを中断し、3 分間インキュベートします。これは、核内蛋白質の除去のため、します 。
- 追加 200 μ L mRIPA 0 mM NaCl ペレット。コントロール セットに 1 つのサンプルと DMSO に阻害剤 (1 mm (+) JQ1 2 μ L) を追加します 。
- 撹拌機、ペレットで 15 回をピペッティングし氷上で 5 分間インキュベート
- 6500 x g で 4 ° C ときれいな 1.5 mL チューブに上清転送で 3 分間遠心します 。
- すべての塩濃度に 3.3 4 を繰り返し、標準的な西部のしみを実行します 。
4。逐次塩抽出の存在下、" ライター " 阻害剤
- (10 μ M サハ) 阻害剤で細胞を治療または 3 h の DMSO
- 各治療のため 400 万セルを収穫します 。
- 阻害剤のすべてのバッファーに追加でサンプルの標準 SSE を実行します 。
5。シーケンシャル塩抽出次 DNA 損傷
- 1 のための 1 μ M ドキソルビシンとセルを扱う
- 3 h を回復するようにしセル上のメディアを変更
- 800 万セルを収穫し、基本的な SSE を実行します 。
6。非逐次塩抽出
- 1200 万セルを収穫し、PBS で洗浄します 。
- 分割細胞マイクロ遠心チューブあたり 200 万セルが存在するようにします 。
- 再バッファー A の 500 μ L で中断し 10 分間インキュベート
- 6000 x g に遠心分離によって核を分離
- MRIPA バッファー + 塩化ナトリウムの各 200 μ L でペレット再中断します 。
- 1 mL ピペット チップで 15 回のピペッティングによって各サンプルをホモジナイズしてください 。
- 氷上 3 分加温
- は、クロマチンを 6500 × g で遠心分離によって分離し、チューブをきれいに清を転送します。ローディングの染料の 70 μ L を追加し、西部のしみの分析のための SDS ページのゲルの 30 μ L を実行します 。
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Representative Results
本稿では、利点と我々 は文学6から適応している一般的に使用される連続塩抽出 (SSE) メソッドのアプリケーションを示しています。図 1ARID1a と PBRM1 の溶出パターンを検出することにより非連続的にタンパク質を抽出する SSE の再現性を比較する.一貫して、ARID1a、BAF サブユニットが 200 mM で主に塩化ナトリウムと PBRM1、排他的な PBAF サブユニットを示して、主に 300 mM の NaCl を示して遵守します。図 1 aは、800 万 OVCA429 細胞と SSE の 3 つの独立した複製を示しています。図 1 bは、200 万セルから分離した核が塩バッファーで再懸濁非シーケンシャル塩抽出を示しています。両方の方法を締結 ARID1a た 200 mm と 300 mM で PBRM1 を示して、SSE は明確に定義されたバインディング プロファイルが生成されます、これらの 2 つの複合体の結合の明確な区別できます。さらに、非シーケンシャル メソッドで、400 mM と 500 mM の NaCl バッファーで溶出する蛋白質の量が 300 mM よりも低いと 3 つ複製間の一貫性はないです。この問題は、インキュベーション時間と遠心分離速度のさらなる最適化の解決かもしれないが、これは SSE の再現性の利点を示しています。
私たちの最適化を通じて他のクロマチン複合体が溶出するより多くの時間を必要がありますが分かった。図 2、転写活性化因子、PBAF、た者共インキュベーション時間が 3 分、10 分間一貫してクロマチンからことを示す.対照的に、BMI-1 によって示される転写リプレッサー、ポリコーム抑制複合 1 (よう PRC1) の溶出は、クロマチン8からリリースされるより長い培養時間を必要とします。この現象可能性がありますされるよう PRC1 によるローカライズされているゲノムのよりコンパクトなアクセスできない地域でまたは差動結合反応を 2 つの複合体が原因である可能性があります。
特定蛋白質のための最適化後者共を使用してさまざまな条件でのタンパク質結合強度がどのように変化を研究できます。SSE は、タンパク質間相互作用阻害剤の効果を検証する使用できます。この概念を示すためには、(+) JQ1、BRD4 ブロモ ドメインの阻害剤である BRD4 バインディング (図 3 a)9を変更する方法を調べることを利用しました。400 万 OVCA429 細胞から核を分離しました。任意の非連結 BRD4 を削除するには、初期 0 mM 洗浄は、両方のサンプルで実行されました。SSE を行った DMSO または 1 μ M (+) 標準 JQ1 は、各画分に追加。サンプル 5 分間培養します。BRD4 た DMSO と比較して阻害剤存在下で以前ことを遵守します。その (+) JQ1 は BRD4 に固有を示す、ARID1a の消されたし、(図 3 b) 溶出の変更を見た。
次に、クロマチンの風景が変更されたときの蛋白質の結合の変更方法を検討しました。BRD4 にはヒストンの尾10アセチル化リジン残基を認識する 2 つの bromodomains が含まれています。3 h サハのヒストンの脱アセチル化酵素阻害剤 suberanilohydroxamic 酸 (サハ) の 10 μ m OVCA429 細胞を扱って、ヒストンのアセチル化のレベルを増加する (10 μ M) は、SSE の中にすべてのバッファーに追加されました。全体的なヒストンのアセチル化レベルを増やすことによって (図 4 a) をバインド BRD4 の増加を観察しました。ARID1a のしみ、遵守 ARID1a 同様の厳密なバインド BRG1、BRM、BRD9 など、複雑な BAF のサブユニットすべては bromodomains10,11 (図 4 b) 含まれているので不思議ではないです。
最後に、SSE を使用して細胞ゲノムの変化が発生するときに、蛋白質の結合がどのように変化するかを確認する方法を示す、トポイソメラーゼ II 阻害剤, ドキソルビシン12の二重鎖 DNA 切断を誘導されます。我々 は時間のドキソルビシンの 1 μ m HEK293T 細胞を扱われ、3 時間の回復する細胞します。SSE を実行した後、我々 は PBRM1 は、DNA 損傷修復13に関与しているため消されました。PBRM1 バインディングの 2 つのピークを見ました: 300 mM と 500 mM の NaCl (図 5) のいずれか 1 つ。これは PBRM1 の人口の一部は、通常、バインディングが、PBRM1 のサブセットがより緊密クロマチン DNA 損傷の後にバインドされているを示唆しています。これは、SSE を使用してさまざまな外部刺激への応答でクロマチンの相互作用を変更するかを確認する方法のほんの一例です。
図 1: 非シーケンシャル OVCA429 細胞における逐次塩抽出と比較して
A) Immunoblots と 3 つ独立の定量化は、シーケンシャル塩抽出法による ARID1a と PBRM1 の溶出プロファイルのレプリケートします。B) Immunoblots および非シーケンシャル塩抽出法で ARID1a と PBRM1 の溶出プロファイルの 3 つの独立した複製の数量。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2 PBAF とよう PRC1 の溶出プロファイルのインキュベーション時間の比較
A) 3 と 10 分間インキュベーション時間を持つ PBAF (PBRM1) 溶出プロファイルの比較。B) よう PRC1 の比較 (BMI-1) 溶出プロファイル 3 と 10 分間インキュベーション時間を。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 有効性 (+) JQ1 BRD4 結合を阻害します。
1 μ M (+) OVCA429 細胞における DMSO コントロールと比較して JQ1 の存在下で BRD4 の A) 溶出パターン。1 μ M (+) OVCA429 細胞における DMSO コントロールと比較して JQ1 の存在下で ARID1a の B) 溶出プロファイル。バンドの強度は、DMSO と (+) JQ1 0 ミリメートル-500 ミリメートルの一部に示されます。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: バインド手入れクロマチンが変更されたときに変更
A) OVCA429 細胞から BRD4 溶出の比較は、dmso と比較して 3 時間 10 μ m サハ扱われます。ARID1a OVCA429 細胞からの B) 溶出プロファイルは、with10 μ M DMSO と比較してサハを扱われます。DMSO とサハ 0-500 mM 分画のバンドの強度が示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: DNA 損傷後 PBRM1 バインディングの変更
SSE HEK293T 細胞からの PBRM1 連結決算処理 1 μ m ドキソルビシン。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
塩の抽出でタンパク質とクロマチンの相互作用の評価は何十年も14,15; に採用されている一般的な方法ただし、それが最適化されていない体系的にする前に、フル ・ ユーティリィティを明らかにします。このフレームシーケンシャル方式が蛋白質または環境が変更されるとき、クロマチンの結合の変化を区別するために迅速かつ安価な方法を提供する方法を示します。SSE は高い適応性、最適化、および重要なは、それは技術的には簡単で、特殊な機器は必要ありません。開始する前に最適化する必要がある重要な側面は、: 細胞数、低張バッファー条件とインキュベーション時間を開始します。
細胞数の最も重要な側面は、すべてのサンプルとの間に整合性があることです。BAF 錯体を見るとき、; これらの複合体の連結方法の良いプロファイルを与える 800 万の細胞を用いたただし、セルの数 (またはバッファーの量) は興味の蛋白質の豊富さによって調整する必要があります。少ない細胞を用いた 400 mM と 500 mM の NaCl では、クロマチンのペレットを可視化するは難しいので困難なことに注意してくださいすることが重要です。ペレットは 400 mM の NaCl 後上澄みと転送されませんを確認することが重要です。
核タンパク質を正確に評価するために核は 0 mM mRipa 食塩と分離、彼らまでそのまま滞在する必要があります。多くの一般的に使用される低張性ソリューションは、HEK293T と HeLa 細胞などの細胞のあまりにも厳しい。これらの細胞は勧め A. 変更されたバッファーを使用するには
最後に、インキュベーション時間は実験によって異なる場合があります。BAF サブユニットの溶出パターンが 3 分と 10 分の孵化; の間変化しません。しかし、よう PRC1 複合体の溶出を大幅にサンプルをインキュベートするどのくらいの時間に応じて変更します。さらに、そのターゲット結合に対する阻害剤の効果を評価する際、インキュベーション時間は阻害剤の反応速度論によって最適化する必要があります。
実験を実行するサンプルの治療でできるだけ一貫性を持つことが重要です。各分画、各サンプルが均等にさらされて、salt のバッファーは均質化する前にすべてのサンプルを追加して必要があります。ピペッティングのポイントは、クロマチンとヘルプのリリースをバインドされた蛋白質を壊すことです。ペレットは、ピペットの先端を通過していることを確認することが重要です。セルの大きい数を使用するときに特にクロマチン ペレット ピペット チップを最初の数回を通過するは困難です。マイクロ遠心チューブの下部に対して先端のマイナーなタップで我々 は先端にペレットを描くことは、我々 は、1 mL ヒントこれは、最高の作品を発見しました。ペレットが先端をそれは溶けませんに 15 回先端を介してクロマチン ペレットを通過した後スムーズに移動。氷のサンプルをインキュベート、クロマチンを遠心分離によって分離後、上清 200 μ L ピペット チップとを削除するは、クロマチン ペレットを中断させることがなく最大除去できます。
SSE は、技術的な一貫性を必要とする、それはシンプルで簡単なと共通の実験室のリソースで実行できます。この方法の真の力は、それは他の表現型検査とつながれることに注意することが重要です。たとえば、この技法を使用すると、それぞれその 6 bromodomains の変異した時 PBRM1 の結合プロファイルを比較した、我々 はすべてが、bromodomains の 1 つが変動度7PBRM1 のバインディングにかかわったことを決定します。興味を持って、ことが判明したバインドの最も重要な bromodomains も遺伝子発現の制御細胞増殖7PBRM1 規制のため不可欠であります。定量的チップ qPCR7によって離散 genomic 位置これら突然変異体のバインディングでの変更を検証するもできます。
我々 はこの手法を使用して蛋白質 chromatin の相互を勉強する方法の例を示しています。しかし、私たちの研究室で私たちは SSE がクロマチン リーダー タンパク質に関する質問の広い配列を調査するための多機能なツールであることを発見しました。その他の分析と組み合わせると、このテクニックを容易に当社の能力、これらを構成するコンポーネントの機能を解明タンパク質複合体を詳しく説明。個々 のドメインの重要性を理解すること、潜在的な治療上のターゲット ブロックのクロマチン関連阻害剤の開発しているかどうかを識別できます。
クロマチンに結合する蛋白質の小分子阻害薬の有効性を評価するための SSE の展開方法を説明してきました。また、エピジェネティックな作家と消しゴムを阻害、SSE は PTM レベルとリーダー蛋白質との関係を確認できます。私たちはまた SSE は、DNA 損傷などの外部刺激への応答の結合の変更を確認する使用ことができますを示しています。これは単純な手法が適切な条件で適用されたとき、クロマチンの規定する蛋白質の知識を大きく進入できます。
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Disclosures
著者は競合する金融興味を持ってないです。
Acknowledgments
癌のこの作品 V 学者賞 (V2014 ~ 004) と V 学者プラス賞 (D2016-030) V がん研究財団と、アメリカがん社会制度研究助成 (ACS IRG グラント 58 006 53) からパデュー大学中心に支えられ研究。E. g. p. は、Borch 大学院基金賞パデュー大学医薬品化学および分子薬理部によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
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