Summary
Chromatin 바인딩 단백질의 순차적 소금 추출 큰 단백질 복합물의 바인딩 속성을 결정 하기 위한 유용한 도구입니다. 개별 하위 단위 또는 단백질 복잡 한 대량 chromatin의 전반적인 선호도에 도메인의 역할을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.
Abstract
Chromatin 대상으로 단백질의 바인딩 속성의 매우 chromatin의 복잡 한 본질 및 가장 포유류 chromatin 수정 복합물의 다른 유형의 자연 전하실 수 있습니다. 이러한 장애물을 극복 하기 위해 우리 chromatin 바인딩된 단지의 상대적 바인딩 선호도 평가 하기 위한 순차적 소금 추출 (SSE) 분석 결과 적응 시켰다. 이 쉽고 간단 분석 결과 비 전문가 바인딩 두 관련된 복합물, 복잡 한 소 단위는 손실 또는 개별 도메인 비활성화의 선호도 변화 및 변화에의 선호도에 상대적 차이 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. chromatin 가로로 변경 후 바인딩 선호도입니다. 순차적으로 다시 소금의 양을 증가에 대량 chromatin 중단, 우리 chromatin에서 특정 단백질의 차입을 프로 파일링 할 수 있습니다. 이러한 프로필을 사용 하 여, 우리 chromatin 수정 복잡 한 변경 또는 변경 chromatin 환경에 미치는 바인딩 상호 작용을 확인할 수 있습니다. 다른 생체 외에서 그리고 vivo에서 분석 실험에 SSE 결합해, 개별 도메인 및 다양 한 염색 질 환경에서에서 복잡 한 기능에 단백질의 역할을 확인할 수 있습니다 우리.
Introduction
진 핵 세포에서 DNA 규칙은 세포내와 세포 외 자극에 응답을 협조 하는 단백질의 구색에 의해 엄격 하 게 제어 하는 복잡 하 고 정교한 시스템 이다. DNA는 히스톤 octamers 느슨하게 DNA 따라 분포 하거나 꽉 코일1로 압축 될 수 있는 형태로 nucleosomes 주변 감 쌌 다. DNA와 히스톤의이 구조 배열 읽기, 쓰기 및 지우기 히스톤2포스트 번역 상 수정 (PTM)는 단백질의 네트워크에 의해 통제 된다 chromatin로 알려져 있다. 일부 히스톤 PTMs, acetylation, 등 그들은 히스톤과 DNA2사이 상호 작용을 변경, 입금은 아미노산의 변경. 히스톤 PTMs 모집 transcriptional 레 귤 레이 터, chromatin remodelers, DNA 손상 복구 기계, 및 게놈3의 특정 지역에 DNA 복제 기계를 또한 제공 합니다.
대부분 방법 chromatin 상호 작용을 공부 하 고 작은 규모의 상호 작용을 조사 하거나 큰 게놈 넓은 분석을 포함 합니다. 바인딩 연구 생체 외에서 종종 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA), 등온선 적정 열 량 측정, 형광 편광, 펩 티 드 pulldowns 등 분석 실험에서 히스톤 펩 티 드 또는 DNA 재조합 개별 도메인을 사용합니다. 이 분석 실험 일반적으로 개별 단백질 도메인에 초점을, 때문에 그들은 퍼즐의 작은 조각의 이해를 촉진 하지만 다중 단백질에서 협력 성격의 다중 도메인 단백질, 혼자 그들의 역할을 이해 하 고 우리를 허용 하지 않습니다. 단지입니다. 필연적인의 또 다른 레이어는 대부분 포유류 chromatin 수정 복합물의 이기종 구성에 의해 추가 됩니다. 이 단백질이 질 chromatin 프리의 동적 특성을 함께에서 하면 도전 하는 비보에 바인딩 chromatin 단백질의 상호 작용 chromatin 시험관을 정리 있습니다.
Vivo에서 방법을 만든 중요 한 발전; 그러나, 그들은 종종 비싼, 시간이 소모 및 기술적으로 도전입니다. 그러나 그것 요구 한다 상당한 최적화4chromatin immunoprecipitation 시퀀싱 (칩 seq) 이어서 전체 게놈, 단백질 및 히스톤 수정 현지화를 결정 하는 데 매우 유용 하다. 단백질 상호 작용; 보존 하는 chromatin 가교 화 들은 그러나,이 인공 상호 작용을 일으켜서 고5마스킹 epitope를 발생할 수 있습니다. 또한, immunoprecipitations (IP) 매우 특정 항 체와 DNA 전단 및 칩-정량은 종종 사용할 수의 선험적으로알려진된 바인딩 사이트를 사용 하 여 IP 조건의 광범위 한 최적화를 필요로 합니다. 칩 조건의 최적화, 후 샘플의 처리 비용이 많이 드는 고 시퀀싱 분석을 개월에 몇 주를 요구 한다. 이 방법은 유용 하지만 게놈, 비용에서 단백질 바인딩된 chromatin의 지역화를 식별 및 약속 시간을 작은 변화 글로벌 바인딩 속성에 영향을 미칠 수 있습니다 방법에 대 한 가설을 생성 하려면이 메서드를 사용 하 여 금지 .
이 문서에서 우리는 chromatin-바인딩 단백질의 글로벌 바인딩 프로필을 검토 하 고 단백질, 복잡 한, 또는 글로벌 PTM 프로필에 변경 상호 작용을 변경할 수 있습니다 어떻게 구별 하는 순차적 소금 추출 (SSE) 분석 결과 사용 하는 방법을 설명 합니다. 소금 기사는 일반적으로 광범위 하 게 사용된 하는 기술, 어떻게이 순차적 방법은 매우 재현 가능 하 고 다양 한 설명 합니다. SSE 특성을 어떻게 복잡 한 또는 심지어 단일 도메인의 단일 소 단위 대량 chromatin에 대 한 복잡 한의 전반적인 선호도에 기여 수 있습니다. SSE 경우 단백질의 바인딩을 영향을 변화 chromatin 풍경에 의해 칩 seq와 다른 게놈 넓은 연구를 사용 하 여 확인 될 수 있는 히스톤 마크 대상에 대 한 흥미로운 가설을 제공 하는 결정을 하기 위해 사용할 수 있습니다.
우리는 원래 적응이 방법에서 우 외., Polybromo1의 기능 검사 (PBRM1) PBAF chromatin remodeler6,7의 바인딩에. 이 기술을 사용 하 여, 우리는 PBAF chromatin 개장 하는 복잡 한 내에서 chromatin 바인딩에 대 한 PBRM1의 역할을 결정 하 고이 함수7에 6 개의 개별 bromodomains의 상대적 기여도 결정.
여기 우리가 화학 억제 물에 의해 단백질 chromatin에서의 변위를 검사를 다른 세포 유형, 단지, 수정 하는 비슷한 chromatin의 상대적 바인딩 선호도 평가에서 chromatin 바인딩 탐험이 방법을 최적화 하는 방법에 설명 하 고 chromatin 바인딩 chromatin 풍경에 변경 후의 효과 결정 합니다.
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Protocol
1. 준비
- 소형 솔루션 버퍼 a: 0.3 M의 준비 100 mL 자당, 60 m m KCl, 60 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA, 그리고 0.5 %NP-40. 스토어 4 º C.
참고: 일부 셀 라인, HEK293T, 등 덜 엄격한 lysing 조건 필요합니다. 핵 lyse 쉽게를 사용 하 여 수정 버퍼 a: 25 mM HEPES pH 7.6, 25 m m KCl, 5 mM MgCl 2, 0.05 m m EDTA, 0.1 %NP-40, 및 10% 글리세롤. - 2 x mRIPA 솔루션의 250 mL 재고 솔루션을 준비: 100 mM Tris pH 8.0, 2 %NP-40, 그리고 0.5% 나트륨 deoxycholate.
- 5 M NaCl 100ml 재고 솔루션 준비.
- 1 x mRIPA 솔루션 50 mL 6 소금 농도의 각각에 대 한 준비 2 x mRIPA와 5 M NaCl 솔루션을 사용 하 여: 0 m m, 100 m m, 200mm, 300mm, 400mm, 및 500 mM NaCl. 실험을 시작 하기 전에 차가운 얼음에 모든 솔루션
- 성장 세포 원하는 조건에서 라인.
참고: 때 단백질 노크의 효과, 최저 라인에 대 한 SSE wildtype 셀에 비교 해야 합니다. 이러한 SSE는 병행 하 여 수행 되어야 합니다. 예제를 보려면 화학 억제제 또는 자극을 사용 하 여, 섹션 3-5을 참조 하십시오.
2. 기본 순차적 소금 추출
각- 수확 8 백만 세포 그리고 얼음 차가운 PBS의 5 mL로 두 번 세척.
참고: 그것은 같은 수의 셀을 해당 단백질 농도가지고 중요 합니다. 세포의 정확한 수는 개별 셀 라인 또는 특정 단백질에 대 한 최적화 할 수 있습니다. 그건 중요 하지 너무 많은 단백질 농도 있는 증가 평형 바인딩에 따라 차입 곡선의 관찰을 하지 것 이다. 그러나, 너무 셀 수 충분 한 단백질, 곡선을 감지 하 고 chromatin 펠 릿은 어렵게 시키고 분수 사이 손실 될 수 있습니다. - 다시 버퍼 A의 1 mL + protease 억제제 셀을 일시 중단, 전송 1.5 mL 마이크로 원심 튜브, 그리고 10 분에 대 한 4 º C에서 하단에 회전 톱으로
- 4 º C에서 5 분 동안 6000 x g에서 원심 분리 하 여 핵 분리.
참고:이 단계 후 핵 여전히 해야 합니다 그대로. 핵 봉투 그대로 경우 펠 릿 다시 일시 중단 완전히; 그러나 때 봉투 lysed는 염색 질은, 펠 릿 하지 다시 일시 중단 합니다. 핵 봉투는 버퍼 A 부 화 후 그대로입니다, 사용 하 여 버퍼 A. 수정 - 추가 200 µ L mRIPA 0 mM NaCl + protease 억제제 다시 펠 릿을 중단 하기 전에 각 핵 펠 릿을. 1 mL 피 펫과 15 번 pipetting으로 각 샘플을 균질. 그러나 펠 릿을 쉽게 중단 다시 한다,, 핵 pipetted는 고 샘플 및 끈 적 하 고 두꺼운 플라스틱 어렵다 될 것 이다 lyse 것입니다.
- 펠 릿을 끝으로, 원심 분리기 튜브의 하단에 대 한 피 펫 팁의 끝을 가볍게 하기 위해
- . 일단 DNA는 핵에서 발표 하지만 pipetting 않으려고 그것을 깰 것 이다 펠 릿 완벽 하 게 분해 되지 것입니다
참고: 보육 시간 관심사의 단백질에 따라 최적화 되어야 할 수 있습니다.
참고:이 시간에 펠 릿 pipetted의 수와 일치 하도록 중요.
참고: 400 m m NaCl, 후 mRIPA 펠 릿 명확 하 고 효험이 고 튜브의 맨 아래에 유지 되지 않습니다. 펠 릿 절연 상쾌한 동안 원심 분리기 튜브의 뚜껑에 놓일 수 있습니다.
참고: 단백질의 바인딩 프로필을 확인, 그것은 로드 로드 보다 lysate, 동등한 단백질 농도의 동일한 볼륨에 중요 한.
3. 순차적 소금 추출의 존재는 " 리더 " 억제제
- 셀 (4 백만)의 두 세트를 수확 하 고 표준 SSE에서 핵 분리.
- 다시 mRIPA 0 m NaCl m의 200 µ L에 두 집합을 일시 중단 하 고 3 분 동안 품 어. 이것은 모든 무료 핵 단백질의 제거에 대 한 수.
- 추가 200 µ L mRIPA 0 mM NaCl 각 펠 릿을. 컨트롤 집합을 하나의 샘플을 DMSO (1 mM (+) JQ1의 2 µ L) 억제제를 추가.
- 동요는 펠 릿으로 15 번 pipetting 및 5 분 ice에 품 어
- 4 º C와 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 표면에 뜨는 전송 3 분 6500 x g에서 원심 분리기.
- 모든 소금 농도 대 한 3.3-4를 반복 하 고 수행 하는 표준 서쪽 오 점.
4. 순차적 소금 추출의 존재는 " 작가 " 억제제
- 억제제 (10 µ M 사)와 세포 치료 또는 3 h. 위해 DMSO
- 각 치료에 대 한 4 백만 셀 수확.
- 억제제 모든 버퍼에 추가 된 샘플에 대 한 표준 SSE 수행.
5. 순차적 소금 추출 다음 DNA 손상
- 1 헤에 대 한 1 µ M 독 소 루비 셀 치료
- 셀에 미디어를 변경 하 고 3 h. 위해 복구 하도록 허용
- 8 백만 세포를 수확 하 고 기본적인 SSE 수행.
6. 비-순차 소금 추출
- 12 백만 세포를 수확 하 고 PBS로 세척.
- 분할 세포는 마이크로 원심 튜브 당 2 백만 셀.
- 버퍼 A의 500 µ L에 다시 일시 중단 하 고 10 분에 대 한 품 어
- 6000 x g.에서 원심 분리 하 여 핵을 분리
- MRIPA 버퍼 + NaCl의 각각의 200 µ L에서 알 약을 다시 중단.
- 1 mL 피 펫 팁 15 번 pipetting으로 각 샘플을 균질.
- 3 분에 대 한 얼음에 품
- 6500 x g에서 원심 분리 하 여는 chromatin를 분리 하 고 튜브를 청소 상쾌한 전송. 염료를 로드의 70 µ L을 추가 하 고 서쪽 오 점 분석에 대 한 SDS 페이지 젤에 30 µ L을 실행.
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Representative Results
이 논문에서는, 장점과 우리 문학6에서 적응 하는 일반적으로 사용 되 순차적 소금 추출 (SSE) 메서드의 응용 프로그램을 설명 합니다. 그림 1, 우리는 비-순차적으로 ARID1a와 PBRM1의 차입 패턴을 감지 하 여 단백질을 추출에 SSE의 재현성을 비교 합니다. 우리는 지속적으로 ARID1a, BAF 소 단위 NaCl 및 PBRM1, 독점적인 PBAF 소 단위 200mm에서 주로 elutes, 300 mM NaCl에서 주로 elutes 관찰 합니다. 그림 1a 는 8 백만 OVCA429 세포와 SSE의 3 개의 독립적인 복제를 보여줍니다. 그림 1b 묘사 비순차적 소금 추출 핵 2 백만 셀에서 절연 단일 소금 버퍼에 다시 중단 했다. 두 방법 ARID1a 200mm에서 elutes PBRM1 300 mM에서 elutes 결론, 비록는 SSE 잘 정의 된 바인딩 프로필을 생성 하 고이 두 단지의 바인딩의 명확한 구별에 대 한 수 있습니다. 또한, 비-순차적 방법에서 400 m m 및 500 m m NaCl 버퍼에 eluted 단백질의 양을 300 m m 보다 낮은 이며 3 복제 사이 일치 하지 않습니다. 이 문제가 부 화 시간 및 원심 분리 속도의 더 최적화와 함께 해결 될 수 있습니다, 하지만이 SSE의 재현성 이점을 보여 줍니다.
최적화를 통해 우리는 다른 chromatin 단지 eluted 수에 더 많은 시간이 필요할 수 있습니다 발견. 그림 2는 transcriptional 활성 제, PBAF, 3 분 및 10 분 보육 시간 SSEs 사이 일관 chromatin에서 elutes 보여 줍니다. 반면, BMI-1을 표시 하는 transcriptional 진압 Polycomb 억압 적인 복잡 한 1 (PRC1)의 차입 chromatin8에서 공개 될 보육 장시간을 필요 합니다. 이 현상을 수 PRC1 인해 되 고 지역화는 게놈의 더 콤팩트 하 고 접근 하기 어려운 지역에서 또는 두 단지에 대 한 차동 바인딩 활동 때문일 수 있었다.
특정 단백질에 대 한 최적화, 후 SSEs 단백질 바인딩 강도 다른 조건에서 변경 하는 방법을 공부 하 사용할 수 있습니다. SSE는 단백질 단백질 상호 작용의 억제제의 효과 검사를 사용할 수 있습니다. 이 개념을 보여, 우리는 (+) JQ1, BRD4 bromodomain 억제제는 그것 BRD4 바인딩 (그림 3a)9를 변경 하는 방법을 검토 하 활용. 우리 4 백만 OVCA429 세포에서 핵을 고립. 제거 하려면 모든 언바운드 BRD4, 초기 0 mM 세척 두 샘플에서 수행 되었다. 다음 표준 SSE DMSO 또는 1 µ M (+)와 함께 수행한 JQ1 각 분수에 추가. 샘플은 5 분 동안 incubated 했다. 우리는 BRD4 억제제 DMSO에 비해 존재 이전 elutes 관찰 합니다. (+) JQ1 BRD4에 대 한 특정 표시, 우리 ARID1a에 대 한 얼룩이 고 차입 (그림 3b)에 변화를 보았다.
다음 우리는 어떻게 단백질 바인딩은 chromatin의 수정 될 때 변경 될 수 있다 검사 합니다. BRD4는 히스톤 꼬리10acetylated 리 진 잔류물을 인식 하는 2 개의 bromodomains를 포함 합니다. Histone acetylation의 수준을 증가, 우리는 히스톤 deacetylase 억제 물 suberanilohydroxamic 산의 (사) 3 헤 사 하에 대 한 10 µ M와 OVCA429 세포 치료 (10 µ M)는 SSE 동안 모든 버퍼에 추가 되었습니다. 증가 함으로써 글로벌 histone acetylation 수준, BRD4 증가 (그림 4a) 바인딩 관찰 합니다. ARID1a에 대 한 더 럽 히기 때 우리는 관찰 뿐만 아니라, ARID1a의 엄격한 바인딩 subunits BAF 복잡 하 고, BRG1, BRM, BRD9, 등의 모든 bromodomains10,11 (그림 4b) 포함 하기 때문에 놀라운 일이 아니다.
마지막으로, SSE를 사용 하 여 단백질 바인딩 세포 게놈 변경 경험을 변경 하는 방법을 보고 하는 방법을 전시, 우리 topoisomerase II 억제 물, 독 소 루비12더블 좌초 DNA 휴식을 유도 한다. 우리 한 시간에 대 한 독 소 루비의 1 µ M와 HEK293T 셀을 처리 하 고 3 시간 동안 복구 하는 세포를 허용. SSE을 수행한 후 우리는 DNA 손상 복구13에 포함 되는 PBRM1에 대 한 얼룩이. 우리 PBRM1 바인딩에 대 한 두 개의 봉우리를 관찰: 300 mM와 500 mM NaCl (그림 5)에 하나씩 하나씩. PBRM1 인구 중 일부는 일반적으로, 바인딩 하지만 PBRM1의 하위 집합 chromatin DNA 손상 다음에 바인딩되어 더 긴밀 하 게 나왔다. 이것은 SSE를 사용 하 여 다른 외부 자극에 대 한 응답에서 chromatin 상호 변경 되는 방법을 검사 하는 방법의 한 예입니다.
그림 1: 비-순차적 OVCA429 셀에서 순차적 소금 기사에 비해
A) Immunoblots 및 3 개의 독립의 정량화는 순차 소금 추출 방법으로 ARID1a 및 PBRM1 차입 프로필의 복제 합니다. B) Immunoblots 및 3 개의 독립의 정량화 비순차적 소금 추출 방법에 ARID1a 및 PBRM1 차입 프로필의 복제 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 보육 시간 PBAF 및 PRC1 차입 프로 파일의 비교
A) PBAF (PBRM1) 차입 프로필 3와 10 분 부 화 시간을 비교 합니다. B) 비교 PRC1의 3와 10 분 부 화 시간 (BMI-1) 차입 프로필. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 효과 (+) JQ1의 BRD4 바인딩 억제에
1 µ M (+) JQ1 OVCA429 세포에서 DMSO 제어에 비해 존재 BRD4의 A) 차입 패턴입니다. B) 차입 프로 파일 ARID1a의 1 개의 µ M (+) JQ1 OVCA429 세포에서 DMSO 제어에 비해 존재. 밴드 강도 DMSO 또는 (+) JQ1 0 mM-500 m m 부분에 대 한 표시 됩니다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: chromatin 아름 다운 수정 될 때 바인딩 변경
A) BRD4 OVCA429 세포에서 차입의 비교 DMSO 치료에 비해 3 시간 동안 10 µ M 사 처리. B) 차입 프로필 OVCA429 세포에서 ARID1a의 with10 µ M 사 DMSO에 비해 치료. 밴드 강도 DMSO와 사 하 0-500 mM 분수에 대 한 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 변경 PBRM1 바인딩 DNA 손상 후에
HEK293T 세포에서 PBRM1 바인딩에 대 한 SSE 결과 1 µ M로 치료 독 소 루비. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
소금 기사를 통해 chromatin와 단백질 상호 작용의 일반적인 고용 되어 수십 년14,15; 그러나, 이것은 하지 되어 체계적으로 최적화 하기 전에 그것의 전체 유틸리티를 공개. 이 순차 방법 단백질 또는 환경을 변경 하는 때 chromatin 바인딩에 변화를 구별 하는 신속 하 고 저렴 한 방법을 제공 하는 방법을 보여 줍니다. SSE 매우 적응 하 고, 최적화할 수 이며 중요 한 것은, 그것은 기술적으로 간단 하 고 특수 장비를 요구 한다. 시작 하기 전에 최적화 하는 데 필요한 핵심 요소는: 휴대폰 번호, 소형 버퍼 조건 및 부 화 시간을 시작.
휴대폰 번호의 가장 중요 한 점은 모든 샘플 사이 일관 되 다는 것입니다. BAF 단지에서 볼 때, 8 백만 셀을 사용 하 여 어떻게이 단지 바인딩됩니다;의 좋은 프로 파일 제공 그러나, 셀의 개수 (또는 버퍼의 양을) 관심사의 단백질의 풍부에 따라 조정 해야 합니다. 그것은 주의 그 적은 세포를 사용 하 여 400 m m와 500 mM NaCl에서 그것은 chromatin 펠 릿을 시각화 어렵다 때문에 도전 하는 것이 중요. 그것은 펠 릿 400 mM NaCl 후는 상쾌한와 함께 전송 되지 않습니다 있는지 확인 하십시오 중요입니다.
핵 단백질을 정확 하 게 평가 하기 위해서는 핵 그들은 0 m NaCl mRipa 솔루션 lysed는 때까지 그대로 유지 해야 합니다. 많은 일반적으로 사용 되 소형 솔루션은 너무 HEK293T 그리고 HeLa 세포와 같은 세포 라인에 대 한 가혹한입니다. 이러한 셀 라인에 대 한 것이 좋습니다 대답 수정 된 버퍼를 사용 하 여
마지막으로, 보육 시간 실험에 따라 달라질 수 있습니다. BAF 소 단위에 대 한 차입 패턴 3 분 사이 10 분 보육; 변경 되지 않습니다. 그러나, PRC1 복잡의 차입 크게 샘플 incubated는 얼마나 오래에 따라 변경 합니다. 또한, 대상의 바인딩에 억제제의 효과 평가, 보육 시간 억제 물 활동에 따라 최적화 되어야 할 수 있습니다.
실험을 수행할 때 샘플의 치료 가능한 일관 되 게 중요 하다. 각 샘플은 동등 하 게 노출 되도록 각 분수에 대 한 소금 버퍼 균질 전에 모든 샘플에 추가 합니다. Pipetting의 요점은 바운드 단백질 chromatin 도움 릴리스 헤어입니다. 펠 릿 피 펫 팁을 통해 전달 되도록 중요 하다. 셀의 더 큰 수를 사용할 때에 특히 chromatin 펠 렛 피 펫 팁 처음 몇 번 통과 도전 이다. 우리와 마찬가지로 마이크로 원심 튜브의 하단에 대 한 팁의 사소한 도청, 우리는 팁으로 펠 릿을 그릴 수 1 mL 팁은이 위해, 가장 발견 했다. 15 번 팁 통해 chromatin 펠 릿을 통과 후 펠 릿 분해 되지 것입니다 하지만 원활 하 게 팁을 통해 이동 해야 합니다. 얼음에 샘플 잠복기는 chromatin 원심 분리 하 여 격리 후 200 µ L 피 펫 팁 상쾌한 제거 수 있습니다 최대한 제거 chromatin 펠 렛을 방해 하지 않고.
비록 SSE 기술 일관성 필요 합니다, 간단 하 고, 간단, 이며 공통 실험실 리소스 수행할 수 있습니다. 이 방법의 진정한 힘은 다른 phenotypical 시험에 결합 하는 때 중요 하다. 예를 들어이 기술을 사용 하 여, 우리는 6 bromodomains의 각 변이 했다 PBRM1의 바인딩 프로필 비교, 우리는 bromodomains 중 하나를 제외한 모든도7변화를 PBRM1의 바인딩에 참여 했다 결정. 글, 우리 발견 했다 바인딩에 대 한 가장 중요 한 bromodomains 유전자 발현 및 제어 셀 확산7의 PBRM1 규정에 대 한 필수 또한 했다. 우리 또한 정량적 칩 정량7에의해 개별 genomic 소재 시에 이러한 돌연변이의 바인딩의 변경 유효 하.
우리는이 기술을 사용 하 여 상호 작용 단백질 chromatin; 공부 하는 방법을의 몇 가지 예만 나타났습니다. 그러나, 우리 실험실에서 우리는 SSE는 chromatin 리더 단백질에 관한 질문의 다양 한 배열을 조사를 위한 다양 한 도구 발견 했다. 다른 분석 함께,이 기술은 우리의 능력을 용이 하 게이 구성 하는 구성 요소 기능을 명료 하 게 정교한 단백질 복합물. 개별 도메인의 중요성을 이해 함으로써 우리 chromatin 협회를 차단 하는 억제제의 개발을 위한 잠재적인 치료 대상 여부를 확인할 수 있습니다.
우리가 단백질 바인딩에 chromatin 작은 분자 억제제의 효과를 평가 SSE을 확장 하는 방법을 설명 했다. 또한, 후 작가 지우개를 억제 함으로써 SSE PTM 수준 및 리더 단백질 사이의 관계를 확인할 수 있습니다. 우리는 또한 바인딩 DNA 손상 등 외부 자극에 대 한 응답에서에 변화를 결정 하는 SSE를 사용할 수 있습니다 나타났습니다. 하지만이 간단한 기술을, 적절 한 조건에서 적용 될 때, 그것은 크게 chromatin와 그것의 규정 하는 단백질의 우리의 지식을 사전 수 있습니다.
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Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.
Acknowledgments
이 작품은 암에 대 한 V 학자 상 (V2014-004)와 V 학자 플러스 퍼듀 대학 센터에서 암 연구를 위한 V 재단과 미국의 암 사회 제도적 연구 그랜트 (ACS IRG 그랜트 58-006-53) 수상 (D2016-030)에 의해 지원 되었다 연구입니다. E. G. P. Borch 대학원 기금 상을 퍼듀 대학 약 화학 및 분자 약리학 부에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
References
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